05—基因工程载体第三章

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1、第三章第三章 基因工程载体基因工程载体狮徒罩鸭筒拯理疾萄适揪淤抠桥潮项搞不诞盔百窿僵跌民日秉纠樊钥咨刚05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章第一节第一节 基因克隆技术概述基因克隆技术概述一、基因克隆技术一、基因克隆技术 基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组的在体外人工连接，构建成新的重组的DNA，然后，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合重新组合 。二、目的基因的取得二、目的基因的取得 1、直接

2、、直接 2、反转录酶、反转录酶 3、化学合成、化学合成 4、基因文库、基因文库 5、PCR垃豌亭弊典羚吁杭罗远贫细惧场弗终矿堑绞肥肖揽刨禄榆永劈装较舰栅京05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章首先利物理方法（如剪切力、超声波等）或酶化学方法（如限首先利物理方法（如剪切力、超声波等）或酶化学方法（如限制性内切核酸酶）将生物细胞染色体制性内切核酸酶）将生物细胞染色体DNA切割成为基因水平的切割成为基因水平的许多片段，继而将这些片段与适当的载体结合。将重组许多片段，继而将这些片段与适当的载体结合。将重组DNA转转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库，再结合筛选方法，入受体菌扩增，获得无性繁殖的

3、基因文库，再结合筛选方法，从众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株，从中将重组从众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株，从中将重组的的DNA分离、回收。分离、回收。 这种方法也就是应用基因工程技术术分离这种方法也就是应用基因工程技术术分离目的基因，其特点是绕过直接分离基因的难关，在基因组目的基因，其特点是绕过直接分离基因的难关，在基因组DNA文库中筛选出目的基因。可以说这是利用文库中筛选出目的基因。可以说这是利用“溜散弹射击溜散弹射击”原理去原理去“命中命中”某个基因。由于目的基因在整个基因组太小，在像当程度某个基因。由于目的基因在整个基因组太小，在像当程度上还得靠上还得靠“碰运气碰运气”

4、，所以人们称这个方法为，所以人们称这个方法为“鸟枪法鸟枪法”或或“散弹枪散弹枪”实验法。实验法。 覆拨伺洗亚耀厅溢浦戮圭拉谁剔赊主耪寂夕炒函窝珍巴仿吨助铀嚣吭虱票05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章面包酵母吲哚甘油磷酸脱氢酶基因的制取，先面包酵母吲哚甘油磷酸脱氢酶基因的制取，先用用EcoRI把面包酵母把面包酵母DNA切成许多片段，使这切成许多片段，使这些片段与些片段与载体连成重组载体连成重组DNA，可把这些重组，可把这些重组DNA导入导入“吲哚甘油磷酸脱氢酶型组氨酸缺陷吲哚甘油磷酸脱氢酶型组氨酸缺陷型型”大肠杆菌，在基本培养基中培养。只有引大肠杆菌，在基本培养基中培养。只有引入了该基因

5、的细菌才能生长。进一步分离这种入了该基因的细菌才能生长。进一步分离这种菌株，可以得到目的基因菌株，可以得到目的基因。 六漂饰窒梅波尊氟锤禄闷召黍秋视努琴场恶秀哭冲禹迈紊狼始衰作藐迎漾05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章三、重组体的构建1、载体、载体 要把一个有用的基因通过基因工程手段送进生物细胞中，要把一个有用的基因通过基因工程手段送进生物细胞中，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫载体（载体（Vector）。）。 （1）质粒（）质粒（plasmid) （2）噬菌体）噬菌体 的衍生物的衍生物 （3）科斯质粒（）科斯质粒（c

6、osmid） （4 4）单链）单链DNA噬菌体噬菌体M13 （5）病毒）病毒悟尽激铡绿酪兴嚏喉醋钝叭尤茵潮年世七顾嘴蓑药仆觉腺铜贞辕淫呆丢曰05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章2、载体的性质、载体的性质1）它它必必须须具具有有能能够够在在某某些些宿宿主主细细胞胞中中独独立立地地自自我我复复制制和和表表达达的的能能力。力。2）载体）载体DNA的分子量应该较小。的分子量应该较小。3）载载体体上上最最好好应应具具有有两两个个以以上上的的容容易易检检测测的的遗遗传传标标记记（如如抗抗药药性性基因等），以赋予宿主细胞以不同的表型。基因等），以赋予宿主细胞以不同的表型。4）载载体体应应该该具具有有

7、多多个个限限制制性性内内切切酶酶的的单单一一切切点点；载载体体上上的的单单一一酶酶切切位位点点最最好好是是位位于于检检测测表表型型的的遗遗传传标标记记基基因因之之内内，这这样样目目的的基基因因是是否否已已连连接接载载体体就就可可以以通通过过这这一一表表型型的的改改变变与与否否而而得得知知，利利于筛选重组体。于筛选重组体。3、酶系的选用、酶系的选用骄寓袭彻曾傍慨我婚佛喇氯诸监啼蓟畔哥体集梢绣奋腥熙扳港詹椅柄亚撇05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章四、转化及重组子筛选鉴定1、转化、转化（transformation)transformation) 获得重组获得重组DNADNA以后，必须将它

8、导入宿主细胞中以扩增以后，必须将它导入宿主细胞中以扩增表达，这个导入宿主细胞的过程称为转化表达，这个导入宿主细胞的过程称为转化（transformationtransformation） 感受态（感受态（competence)competence)、电击、电击2、重组子、重组子3、重组子的筛选方法、重组子的筛选方法（1）载体上的报告基因（）载体上的报告基因（reporter gene) 抗药性基因、抗药性基因、lacZlacZ基因的显色反应、发光基因（基因的显色反应、发光基因（lux)lux)（2）单菌落扩增）单菌落扩增（3）菌落杂交）菌落杂交州淹鹰捻压咏枉仪秉蚕聊阳狼薪僵素肇调撒版厨歼于励斥

9、殉比易消蔽勾骆05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章 第二节第二节 质质 粒粒 载载 体体 （ Plasmid Vector)墙景哮袭挚老膊组绑篙何乓驼缔已捏轮迟悍弹糟逛懊内址寐钻锚晤炼檄凰05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章一、质粒的概念一、质粒的概念 附加体（整合质粒，附加体（整合质粒，intergrative plasmid)二、质粒的一般生物学特性二、质粒的一般生物学特性1、质粒、质粒DNA （1）SC构型：构型： 共价闭合环形共价闭合环形DNA(closed circle DNA,ccDNA) （2）OC构型构型 开环开环DNA(open circle DNA,ocDN

10、A) （3）L型型 线性线性DNA(linker DNA,lDNA)幸毙撑畦挺驮侯拿币僳悲虞除焉婿鹃篱晕健淖虽萨厨养姬泛赁赁膳廓骗诸05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章帖滴裕饱蔼战批漂钓存通借焦漾乔痹坞宫忻凹杯毫态瘁压州暗驰擅递法沦05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章 质粒名称质粒名称 质粒来源质粒来源 核苷酸长度（核苷酸长度（kb） 分子量分子量(MD) pTiAch5 土壤农杆菌土壤农杆菌 213 142 To L 假单胞菌假单胞菌 117 78 F 大肠杆菌大肠杆菌 95 63 RP4 假单胞菌假单胞菌 54 36 Col E1 大肠杆菌大肠杆菌 6.36 4.2 pBR

11、322 大肠杆菌大肠杆菌 4.362 2.9 pBR345 大肠杆菌大肠杆菌 0.7 0.46财沛蜕鹃宇速妖钡动淳僚恼腾蒙鼓袋兽壕敲制猿纬奈限荐茫织夺育爆征判05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章2、质粒的复制与遗传根据质粒与宿主菌的相关程度根据质粒与宿主菌的相关程度 某种质粒在一个细菌细胞内的数目就称为这种质粒某种质粒在一个细菌细胞内的数目就称为这种质粒的拷贝数（的拷贝数（copy number） 严密型质粒严密型质粒（stringent plasmid)stringent plasmid) 松弛型质粒松弛型质粒 (relaxed plasmid) (relaxed plasmid)根

12、据质粒是否带有转移基因（根据质粒是否带有转移基因（tratra基因）基因） 接合型质粒（传递性质粒）接合型质粒（传递性质粒） 非接合型质粒非接合型质粒体毡替申枫栏煽钡酗纯缨靶秘临金慢矢秒袍兆汇迅亡痹枕极械容躺爽护铝05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章严密型质粒严密型质粒（stringent plasmid)stringent plasmid) 严密型质粒通常是一些具有自身传递能力的大质粒，复制与严密型质粒通常是一些具有自身传递能力的大质粒，复制与宿主菌密切相关，宿主菌内只有宿主菌密切相关，宿主菌内只有1-21-2个质粒拷贝存在，当宿主个质粒拷贝存在，当宿主菌蛋白合成停止时，质粒的菌蛋白

13、合成停止时，质粒的DNADNA复制也就随之停止复制也就随之停止 松弛型质粒松弛型质粒 (relaxed plasmid) (relaxed plasmid) 松弛型质粒通常是分子量较小，不具传递能力的质粒，它在松弛型质粒通常是分子量较小，不具传递能力的质粒，它在宿主菌内通常可含宿主菌内通常可含10-20010-200个拷贝，而且不受宿主菌蛋白合成个拷贝，而且不受宿主菌蛋白合成的影响，当宿主菌蛋白质合成停止时，例如当宿主菌遇上有的影响，当宿主菌蛋白质合成停止时，例如当宿主菌遇上有抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素存在时，质粒存

14、在时，质粒DNADNA的复制仍可继续进行，甚至可将数十个增至的复制仍可继续进行，甚至可将数十个增至几千个。几千个。 儒吏铡姓楼肤藉估棒皂腾馋脾拥寺挤舟此棍描乘贡隶噎广怔面谩氏谨促营05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章接合型质粒又叫传递性质粒，接合型质粒可以从一接合型质粒又叫传递性质粒，接合型质粒可以从一个细胞自主地转移到原来不存在这种质粒的另一个个细胞自主地转移到原来不存在这种质粒的另一个细胞中去。接合型质粒的分子比较大，编码一套控细胞中去。接合型质粒的分子比较大，编码一套控制质粒制质粒DNADNA转移的基因。这一过程是由接合型质粒转移的基因。这一过程是由接合型质粒上的转移基因（上的转

15、移基因（tra genestra genes）控制的。）控制的。 非接合型质粒，由于分子小，不足以编码全部转移非接合型质粒，由于分子小，不足以编码全部转移体系所需要的基因，因而不能够自我转移。体系所需要的基因，因而不能够自我转移。 望凿入唱喇透觉眯剁作缆投但湘钦赏钱撂淡乃蕊帕胺砷邦蚊甚逝羔切奥酿05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章所谓质粒的不亲和性，有时也称为不相容性，是指所谓质粒的不亲和性，有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地

16、共存的现象的现象 只有在确实证明第二种质粒只有在确实证明第二种质粒B已经进入含有第一种质已经进入含有第一种质粒粒A的寄主细胞，而它的的寄主细胞，而它的DNA并不受寄主细胞限制并不受寄主细胞限制体系的降解作用，但这两种质粒却不能长期稳定共体系的降解作用，但这两种质粒却不能长期稳定共存，在这种情况下，我们才能够说存，在这种情况下，我们才能够说A和和B是不亲和的是不亲和的质粒质粒 质质粒粒不不亲亲和和的的分分子子基基础础，主主要要是是由由于于它它们们在在复复制制功功能之间的相互干扰造成的。能之间的相互干扰造成的。 墓说垄浚挂矩信辊芒顽虾亦氓故脾粮尖宴魄件伶氮农秋箩炳辱狈馈颓销碌05基因工程载体第三章

17、05基因工程载体第三章根据质粒上带有特殊用途的基因1）生殖性质粒（）生殖性质粒（fertility plasmid）这这类类质质粒粒简简称称“F质质粒粒”，它它有有 tra基基因因，主主要要用用于于细细胞胞间间的接合生殖（的接合生殖（F因子）因子）2）抗性质粒（）抗性质粒（resistance plasmid）抗抗性性质质粒粒简简称称R质质粒粒，它它携携带带有有赋赋予予宿宿主主细细胞胞一一种种或或多多种种抗抗生生素素抗抗性性的的基基因因，这这些些抗抗生生素素包包括括土土霉霉素素，氨氨苄苄霉素等。（霉素等。（R因子）因子）3）Col质粒质粒Col质粒可以编码一种可杀死其他细菌的蛋白质粒可以编码一

18、种可杀死其他细菌的蛋白colicin。倡韩磐涧替鸡电蹬缕竹咨烧哨秸术赶瑚叭刑积菌霍笼崔衣漳众观勉蛮店理05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章4）降解质粒（）降解质粒（degradative plasmid） 降降解解质质粒粒主主要要是是使使宿宿主主细细菌菌消消化化 一一些些非非“正正常常”的的分分子，如水杨酸等。子，如水杨酸等。5）致病质粒（）致病质粒（virulence plasmid） 致致病病质质粒粒赋赋予予宿宿主主细细菌菌细细胞胞以以病病原原菌菌侵侵染染性性，例例如如土土壤壤农农杆杆菌菌中中的的Ti质质粒粒（诱诱导导肿肿瘤瘤质质粒粒，Tumor inducing plasmid）

19、可可以以在在大大多多数数双双子子叶叶植植物物和和少少数数单子叶植物上诱导形成冠瘿病。单子叶植物上诱导形成冠瘿病。彭系啼啤待膜舵崔尼司诛霓似宅奥抑盘拒肤债嚣糊闯伶庆潦唱裔划趴纤拌05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章3、构建质粒克隆载体的基本策略、构建质粒克隆载体的基本策略 1）分分子子量量尽尽可可能能小小，多多拷拷贝贝，而而且且便便于于提提取取和和纯纯化化。分分子子量量越越小小越越能能抵抵抗抗机机械械剪剪切切力力的的切切割割，可可容容纳纳外外源源性性DNA就就越越长长。分子量小的质粒往往属于松弛型质粒。分子量小的质粒往往属于松弛型质粒。2）缺缺失失tra基基因因，质质粒粒就就不不会会从从

20、一一个个细细菌菌接接触触转转移移到到另另一一个个细细菌，所以是非接合型质粒。菌，所以是非接合型质粒。3）质粒序列中具有一个或多个单一的限制性内切酶位点。）质粒序列中具有一个或多个单一的限制性内切酶位点。4）具具有有一一个个或或几几个个报报告告基基因因，而而且且引引入入的的基基因因应应在在限限制制性性内内切切酶酶的的单单切切点点之之内内，由由于于插插入入外外源源基基因因，这这个个报报告告基基因因灭灭活活，从而便于筛选重组体。从而便于筛选重组体。喝桥迅什佑北硅巫鹏恃帕飞娠超疹环盒拙歼题但购匪历诗乔绝婿汞微对骇05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章4、质粒的改造、质粒的改造“天然质粒天然质粒”

21、:它一般是指那些没有经过以基因克隆为目标的体外它一般是指那些没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。修饰改造的质粒。在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天然质粒有在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天然质粒有ColEI、RSF2124和和pSC101 。第一个用于基因克隆的是天然质粒第一个用于基因克隆的是天然质粒pSC101，它对于，它对于EcoRI限制限制酶只有一个识别位点，而且在此克隆外源酶只有一个识别位点，而且在此克隆外源DNA既不会影响它的既不会影响它的复制功能，也不会破坏其唯一的四环素抗性复制功能，也不会破坏其唯一的四环素抗性 选择记号（选择记号（Tetr）。）。 跌勉课论握蘑

22、朴葡植某郧檬揉渐沮纠招野替精巾艘邱磋扦举侦唁隶淬等寒05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章三、常用的质粒载体三、常用的质粒载体 （一）（一）pBR322质粒载体质粒载体万能质粒之称万能质粒之称 1、标准的质粒载体命名法则、标准的质粒载体命名法则 “P”表示它是一种质粒表示它是一种质粒 “BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者则是分别取自该质粒的两位主要构建者FBolivar和和RLRodriguez姓氏的头一个字母姓氏的头一个字母 “322”系指实验编号系指实验编号 “BR”恰好与恰好与“细菌抗药性细菌抗药性”（bacterial resistance）两个词的）两个词的第一个英语字母

23、等同第一个英语字母等同 锁门斜泻黎语嫉恬棱卜喘录裕氨茎懈熏柄绩池莎尊筐完狠勘操颜麓玛钝阅05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章2、pBR322质粒载体的物理图谱质粒载体的物理图谱轨藻紊后符救戴罕垃骂贵铱拴嘲葬咆爷澳赔范毅钙颇暇幼钎瓷衙载贬姜窒05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章3 3、pBR322pBR322质粒载体的构建质粒载体的构建 pBR322pBR322质粒的亲本之一是质粒的亲本之一是pMB1pMB1质粒。复制子的来源。质粒。复制子的来源。 pBR322 pBR322质粒上的氨粒上的氨苄青霉素抗性基因（青霉素抗性基因（ampampr r）是取自于）是取自于pSF2124p

24、SF2124质粒粒来源于来源于pSC101pSC101质粒的四粒的四环素抗性基因（素抗性基因（tettetr r）; ; 在在pBR322pBR322质粒粒载体的构建体的构建过程中的一个重要目程中的一个重要目标是是缩小基小基因因组的体的体积，这就需要从就需要从质粒粒DNADNA上移去一些上移去一些对基因克隆基因克隆载体无关体无关紧要的要的DNADNA片段，同片段，同时也伴随着消除掉若干个也伴随着消除掉若干个对DNADNA克隆无用的限制克隆无用的限制酶酶识别位点位点。还要要设法使法使质粒内存在的任粒内存在的任何易位子何易位子统统失去功能。失去功能。 辙俺风趴任塞抵鸳级凿瘦范晃锚冉馈冠宙延妊处谱罪

25、丽计鸣滩碳玛遭荷叹05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章糙逃劝归绕荣迟骨匙写盐互舆沪肾哼靖哪厄划躲季偏格畔柔上米监生颖点05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章4 4、pBR322pBR322质粒载体的优点质粒载体的优点 具有较小的分子量。具有较小的分子量。 统一规定统一规定pBR322质粒质粒DNA分子核苷酸的计数从分子核苷酸的计数从EcoR限制酶的限制酶的识别位点开始，并公认该序列识别位点开始，并公认该序列-GAATTC-中的第一个中的第一个T为核为核苷酸苷酸 1。 克隆载体的分子大小最好不要超过克隆载体的分子大小最好不要超过10kb（6kb）。）。 具有两种抗菌素抗性基因可供作

26、转化子的选择记号。具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。 因因DNA插入而导致基因失活的现象，称之为插入失活效应。插入而导致基因失活的现象，称之为插入失活效应。 AmpsTets ，AmprTets， AmpsTetr 具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可累具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可累积积10003000个拷贝。个拷贝。碟侯瞅捍贿爆饵藐寥沫恢瘪硒餐噶湖瀑钝遗梧骨傈侣懒蛤奶盛乐耘帛嘘佐05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章（二）（二）pUCpUC质粒载体质粒载体1、概述在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个在其5-端带有一段多克隆位点（

27、multiple cloning sites，MCS）的lacZ基因而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。 pUC，是因为它是由美国加利福尼亚大学（University of California）的科学家JMessing和JVieria于1987年首先构建的。 昆普旭驭署芋锭狼你宦鸯秸焚烫节姨镣破旭帕质徐涤筐宗瑟能迟烃境邓亭05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章2 2、pUCpUC质粒载体的结构质粒载体的结构 （i i）来自）来自 pBR322 pBR322质粒的复制起点（质粒的复制起点（oriori）；）；(ii)(ii)氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性性基基因因（ampampr

28、 r），但但它它的的DNADNA核核苷苷酸酸序序列列已已经经发发生生了了变变化化，不不再再含含有有原原来来的的核核酸酸内内切切限限制制酶酶的的单单识识别别位位点；点；（iiiiii）大大肠肠杆杆菌菌-半半乳乳糖糖酶酶基基因因（lacZlacZ）的的启启动动子子及及其其编编码码-肽链的肽链的 DNA DNA序列，此结构特称为序列，此结构特称为 lacZ lacZ基因；基因；（iviv）位位于于 lacZlacZ基基因因中中的的靠靠近近 5-5-端端的的一一段段多多克克隆隆位位点点（MCSMCS）区段，但它并不破坏该基因的功能。）区段，但它并不破坏该基因的功能。 灼裸谩绒而狼仔凛格冕卒蛛奎隧昧感涕

29、秀斥军饼罩灌缺棋缀证捕逻家茧额05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章3 3、pUCpUC质粒载体的优点质粒载体的优点 1 1、具有更小的分子量和更高的拷贝数、具有更小的分子量和更高的拷贝数 在在pBR322pBR322基础上构建基础上构建pUCpUC质粒载体时，仅保留下其中的氨苄质粒载体时，仅保留下其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点，使其分子大小相应地缩小了许青霉素抗性基因及复制起点，使其分子大小相应地缩小了许多多 2、适用于组织化学方法检测重组体适用于组织化学方法检测重组体 pUC8 pUC8质粒结构中具有来自大肠杆菌质粒结构中具有来自大肠杆菌laclac操纵子的操纵子的lacZlac

30、Z基因，基因，所编码的所编码的-肽链可参与肽链可参与-互补作用。因此，在应用互补作用。因此，在应用pUC8pUC8质质粒为载体的重组实验中，可用粒为载体的重组实验中，可用XgalXgal显色的组织化学方法一步显色的组织化学方法一步实现对重组体转化子克隆的鉴定实现对重组体转化子克隆的鉴定 3、具有多克隆位点具有多克隆位点 MCS MCS区段区段 王说啼蒲男绳哑沏狙硅仅培套喝款史歇芽酌琉段咸喀捆弛峨魄妙荆漠颅掂05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章 （三）（三）TA克隆载体克隆载体 Taq DNA聚合酶具有一种非模板依赖性活性，这种聚合酶具有一种非模板依赖性活性，这种活性可以在活性可以在PC

31、R产物的产物的3端加上一个非配对的脱氧腺端加上一个非配对的脱氧腺嘌呤核苷（嘌呤核苷（A）。根据这一特点研制出了一种线性质）。根据这一特点研制出了一种线性质粒，其粒，其5端各带一个不配对的脱氧胸腺嘧啶核苷端各带一个不配对的脱氧胸腺嘧啶核苷（T），采用该质粒可将），采用该质粒可将PCR产物以产物以TA连接的方式直连接的方式直接进行克隆，即接进行克隆，即TA克隆。用于克隆。用于TA克隆的载体称为克隆的载体称为TA克隆载体克隆载体 。亚蜂贫忘财球揣惠冻介黍伺散助咏郡将三裔尿硬贪掩私万趾忻包屉秤宏撮05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章四、酵母中的质粒载体四、酵母中的质粒载体 质粒质粒-2m环（环

32、（2m长的长的DNA自主复制环）自主复制环）6kb，一个酵母细胞中含，一个酵母细胞中含70200拷贝拷贝P1、P2编码复制所需蛋白的基因编码复制所需蛋白的基因 LEU2基因编码基因编码-异丙基苹果酸脱氢酶异丙基苹果酸脱氢酶 该酶参与将丙酮酸变成亮氨酸的生化过程该酶参与将丙酮酸变成亮氨酸的生化过程 使用使用LEU2基因作选择标记时，宿主酵母菌必须是基因作选择标记时，宿主酵母菌必须是没有没有LEU2基因的营养缺陷型突变株（基因的营养缺陷型突变株（LEU2- ）陵汽泽射盏紫释尉魂嚎澄蒙睫满市隅湾珠酗愧阵呆戮趟秀空演窥滑筛玲彩05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章质粒-2m环嫉削宁锰痉康抠注铡碟

33、蠢元舰免矾歉羞贫烹疹各坟翰漆第忌篇浸坚窍撵捍05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章 宿主酵母菌（宿主酵母菌（LEU2-） LEU2基因基因 丙酮酸丙酮酸 亮氨酸亮氨酸不含附加亮氨酸的培养基不含附加亮氨酸的培养基 不含附加亮氨酸的培养基不含附加亮氨酸的培养基 不能生长不能生长 生长生长 卓虐夸矩栋锣鲜敬贴拌蕾洱人霜冒莆戈孩柔痊蔡譬糕烃急熙沙放吩气焙逮05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章酵母游离质粒酵母游离质粒（yeast episomal plasmids,YEps）酵母整合质粒酵母整合质粒（yeast integrative plasmids.YIps）酵母复制质粒（酵母复制质粒

34、（YRps） 穿梭质粒（穿梭质粒（shuttle plasmid） 虱冷辫卯步筒悼询岭谱寻虽街责诽记庶宅像膳蛋扛经妖咽便亨鞠玲课演肇05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章 pJDB 219赛隆妨扦襟塌钵析外辖擂眩润薛脆踌秸路广悬棋畦亩将限防庙躯等拷挠赞05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章选用哪种类型的真菌质粒？选用哪种类型的真菌质粒？转化频率转化频率 YEps：103105 YIps：1-10转化子的稳定性转化子的稳定性YEps：不稳定：不稳定 YIps：稳定：稳定艺挨拥跺恶把疽官睁薄幌芒纲椒廖颈敏绰族秸安纵猪濒匹抚迎久昌鸦喻会05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章 第三节

35、第三节 其其 它它 载载 体体萧窍且圣禹袜畅拿配和描加盅搭夹沥婿舟绅墓篆锣橱谣裕戊核叮痞抹鲤湍05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章一、噬菌体载体一、噬菌体载体1、噬菌体的基本特征、噬菌体的基本特征 Bacteriophage(phage)；phagos （1）生物学特性）生物学特性 对寄主功能的依赖性对寄主功能的依赖性 保持自己的生命、利用寄主细胞的核糖体、合成蛋保持自己的生命、利用寄主细胞的核糖体、合成蛋白质的因子，各种氨基酸及产能体系白质的因子，各种氨基酸及产能体系保护自己的核酸分子免遭环境化学物质的的破坏保护自己的核酸分子免遭环境化学物质的的破坏将核酸分子注入到被感染的细菌细胞将

36、核酸分子注入到被感染的细菌细胞产生大量的子代噬菌体颗粒产生大量的子代噬菌体颗粒使感染的细菌细胞释放出子代噬菌体颗粒使感染的细菌细胞释放出子代噬菌体颗粒锯冶呆豌贰寐架楼搔曰屋温往仓际旬括寂扁闸沪裙朱贴韧谅账儒招帘寻跨05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章2、噬菌体的结构及其核酸类型、噬菌体的结构及其核酸类型结构类型结构类型无尾部的二十面体型无尾部的二十面体型有尾部的二十面体型有尾部的二十面体型线状体型线状体型核酸类型核酸类型双链线性双链线性DNA、双链环形、双链环形DNA、单链环、单链环形形DNA、单链线性、单链线性DNA、单链、单链RNA犊侄姬苞吊走靶岿公竹拔根仑掠虹冬黍齿盐捎挛梗瞒躺次

37、斟芬袜储五韧四05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章T2噬菌体颗粒示意图腕卑犁虫蒙垦撼糜婴狸惺援慈棚条政像回佑懊看归刀丽欧阎宾萍煮炳腹白05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章3、噬菌体的感染性、噬菌体的感染性（1）噬菌体的溶菌生命周期）噬菌体的溶菌生命周期闷唐吁闪唉控樊棒棕嘉猜蒸弧散茫惮愤绘模败窍掐凝踌盈百衷沫溜呆痕瑶05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章（2）噬菌体的溶源周期）噬菌体的溶源周期（）有关的概念：）有关的概念：温和噬菌体（温和噬菌体（temperate phage）溶源性细菌（溶源性细菌（lysogen)溶源化（溶源化（lysogenization)整合（整合（

38、intergration）原噬菌体（原噬菌体（prophage）减辗椰屠友驱企撞徐珐恩卯清淀反剩紫卒暴闪齿泣札卸喜园披寂狸僧昨掂05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章（）溶源周期的主要特征）溶源周期的主要特征蔑疤荔劝仆撰念才铺似患幻溺弧咋霜咏番险冕隶们豆曳帐倘刽莱泡诌欺秆05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章 部分噬菌体的性质部分噬菌体的性质 名称名称 核酸核酸 分子质量分子质量 构型构型 宿主宿主 T4 dsDNA 130106 线形线形 E.coli，烈性，烈性 dsDNA 32106 线形线形 E.coli，温和，温和 P1 dsDNA 58106 线形线形 E.coli，温

39、和，温和 P22 dsDNA 27106 线形线形 志贺氏菌，志贺氏菌， 沙门氏菌，温和沙门氏菌，温和 M-1 dsDNA 28106 线形线形 E.coli 174 ssDNA 1.7106 环状环状 E.coli，烈性，烈性 M13 ssDNA 2.1106 环状环状 E.coli R17 ssDNA 1.1106 线形线形 E.coli（F+）烈性）烈性霸摹良挝颂油狄脾歼涪将过崔酣屈仟锄祷翅阉澄橇乱谐龚岗譬瘤加造扁渝05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章二、二、噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体1、与构建克隆载体相关的、与构建克隆载体相关的噬菌体性质噬菌体性质 DNA 噬菌体的噬菌体的D

40、NA在噬菌体中是线状在噬菌体中是线状DNA分子，全长分子，全长48 502 bp，左右两端各有，左右两端各有12个核苷酸组成的个核苷酸组成的 5凸出黏性末端凸出黏性末端（cohesive end），而且两者的核苷酸序列互补，即），而且两者的核苷酸序列互补，即 5GGGCGGCGACCTNNNN3 3NN NNCCCGCCGCTGGA5 DNA进入宿主细胞后，黏性末端连接后形成环状进入宿主细胞后，黏性末端连接后形成环状DNA分子。分子。把此能连接的末端称为把此能连接的末端称为 cos位点（位点（cohesive end site） 译砍考攒需责朋闹学蜒锡毗姆终膝榔丘冕帝轩蹲响蹲臼崩蛀涯煮号十矫谚

41、05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章击畏慷寡契大电篙优壤脆苗氓兼协藐惧胖棍缨拟非嗅犁顷点扫糙立慰瘴耸05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章噬菌体基因组噬菌体基因组 除了两个正调节基因除了两个正调节基因N N和和Q Q之外，其余的是按功能的相近性聚集之外，其余的是按功能的相近性聚集成簇的。例如，头部、尾部、复制及重组四大功能的基因成簇的。例如，头部、尾部、复制及重组四大功能的基因 （i）左侧区，自基因）左侧区，自基因 A到基因到基因J，包括参与噬菌体头部蛋白质，包括参与噬菌体头部蛋白质和尾部蛋白质合成所需要的全部基因。和尾部蛋白质合成所需要的全部基因。（ii）中间区，介于基因）中间

42、区，介于基因J与基因与基因N之间，这个区又称为非必要之间，这个区又称为非必要区。本区编码的基因与保持噬菌斑形成能力无关，但包括了一区。本区编码的基因与保持噬菌斑形成能力无关，但包括了一些与重组有关的基因（例如些与重组有关的基因（例如 redA和和redB），以及使噬菌体整），以及使噬菌体整合到大肠杆菌染色体中去的合到大肠杆菌染色体中去的int基因，和把原噬菌体从寄主染基因，和把原噬菌体从寄主染色体上删除下来的色体上删除下来的xis基因。基因。揭横款脸忽颈峰样已乃乘频于羚诌汝停螺结贝蚤跳半艘棋豁哑唆证嘘酷关05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章（iii）右侧区，位于）右侧区，位于N基因的右

43、侧，包括全部基因的右侧，包括全部主要的调控成份，噬菌体的复制基因（主要的调控成份，噬菌体的复制基因（O和和P）以及溶菌基因（）以及溶菌基因（S和和R）。）。 吧呵成认础肥墩商错冉氛扶要猪栗阔渊悯痕减晴撼莹蕉几号糯了毫琵码炒05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章限制性核酸内切酶识别位点。限制性核酸内切酶识别位点。DNA上有上有56种限制种限制性核酸内切酶的识别位点性核酸内切酶的识别位点噬菌体的生长途径噬菌体的生长途径 噬菌体感染大肠杆菌后，线形噬菌体感染大肠杆菌后，线形DNADNA注入细胞内，或者进注入细胞内，或者进行溶菌生长途径，黏性末端连接，成为环形行溶菌生长途径，黏性末端连接，成为环

44、形DNADNA分子，指令宿分子，指令宿主细胞合成与包装相关的系列壳蛋白和酶，复制新的主细胞合成与包装相关的系列壳蛋白和酶，复制新的DNADNA，包装成子代噬菌体颗粒，并且在包装成子代噬菌体颗粒，并且在DNADNA指令宿主细胞合成的指令宿主细胞合成的R R蛋白和蛋白和S S蛋白作用下，宿主细胞破裂，释放出大量子代噬菌体蛋白作用下，宿主细胞破裂，释放出大量子代噬菌体颗粒，感染新的细胞；颗粒，感染新的细胞；甲涟翰缺戮沤污辅挣范侩绽阶思雍械墨缮窖好传揭涯盗绣严模感色嗅目淮05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章或者进行溶源生长途径，在其宿主细胞合成的或者进行溶源生长途径，在其宿主细胞合成的inti

45、nt基基因产物作用下，因产物作用下，DNADNA整合在染色体整合在染色体DNADNA上，随染色上，随染色体体DNADNA的复制而复制，以原噬菌体的形式潜伏起来，的复制而复制，以原噬菌体的形式潜伏起来，一旦宿主细胞处于某种胁迫条件下时，在一旦宿主细胞处于某种胁迫条件下时，在DNADNA指令指令宿主细胞合成的宿主细胞合成的xis xis 基因产物作用下，基因产物作用下，DNADNA脱离染脱离染色体，重新进入溶菌生长途径。色体，重新进入溶菌生长途径。 迁抹叉废匿躺积彪五冒桑沏嗓渗忱岭圣褥聘敦茶宇谩豆肩哥槛普捻沥彻腊05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章2、噬菌体作为构建克隆载体材料的依据 噬菌

46、体是一种温和噬菌体噬菌体是一种温和噬菌体能承载比较大的外源能承载比较大的外源DNADNA片段。片段。 在在DNA分子上有多种限制性核酸内切酶识别分子上有多种限制性核酸内切酶识别位点，便于多种外源位点，便于多种外源DNA酶切片段的克隆酶切片段的克隆 睦宪祖腿身椿燎铭量炉谰绦袁戏俗译挟毖窍兢灼裔憎卜沈共循喜然恬跋挺05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章3、构建噬菌体克隆载体的基本策略构建构建噬菌体克隆载体的基本策略是在噬菌体克隆载体的基本策略是在DNA上上切去部分非必需的区域，抹去多余的限制性核切去部分非必需的区域，抹去多余的限制性核酸内切酶切割位点，插入可供选择的标记基因，酸内切酶切割位点

47、，插入可供选择的标记基因，建立体外包装系统建立体外包装系统 志陆葵菌质二拢驱苍阮洁蔗撅跃涡毕遂拓络疫募盖株妥随咸遇突鹃赵菠诽05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章4、 噬菌体克隆载体的主要类型1）插入型载体）插入型载体免疫功能失活的插入型载体：免疫功能失活的插入型载体： 外源外源DNA插入，不能进入溶源周期，清晰的噬菌斑。插入，不能进入溶源周期，清晰的噬菌斑。 半乳糖苷酶失活的插入型载体半乳糖苷酶失活的插入型载体2）替换型载体（取代型载体）替换型载体（取代型载体） 在载体中央部分有一个可以被外源插入的在载体中央部分有一个可以被外源插入的DNA所取所取代的代的DNA分子片段分子片段翁懒垦惺

48、谜澡勒桔坎苏歪冯担腊榆磷驮居惯弯豫禾柿挂甜狐标敞很仿窜起05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章5、 重组体DNA的体外包装1）相关概念 转染（转染（Transfection） 转导（转导（Transduction） 转染效率：转染效率：105-106 ，107 院酪夜葵冗又喧窘灶盗霸遁诞贿原军芍掣侵折韦缀竖较马兹眯致磋垮皱餐05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章 2）DNA的体外包装 （1）概念）概念（2）原理）原理（3） DNA的包装限制的包装限制 75%-105%， 48kb ， 51kb ， 28kb， 23kb象复渗恰住值恤父缨蚕焦印誉钳软错妖然陛叁毅恋圆哭菱涡佩兑按架绞腊

49、05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章影宽壶父篓奢艳炽腮迢辟憨些伙禁汕己艰现垦靡碧秤肆蹿鼻臀导咏氨赡孕05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章炼秸嚼预瞥裂旗盎盔啼辗隧担蚁瞥耀扔瘪翻瓣烃矣糙桐诲箱食瞥蒲澜氯侣05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章6、 重组体分子的选择方法重组体分子的选择方法1）cI基因功能选择方法基因功能选择方法 cI基因编码的阻遏蛋白质，促使感染了基因编码的阻遏蛋白质，促使感染了噬菌体的大噬菌体的大肠杆菌寄主细胞发生溶源化反应。肠杆菌寄主细胞发生溶源化反应。 溶菌化反应：清晰型噬菌斑（溶菌化反应：清晰型噬菌斑（ 重组体分子：重组体分子：cI-） 溶源化反应：混

50、浊型噬菌斑（非溶源化反应：混浊型噬菌斑（非重组体分子：重组体分子： cI+）2）lac Z基因功能选择法基因功能选择法 重组体分子：白色的噬菌斑重组体分子：白色的噬菌斑 非非重组体分子重组体分子:蓝色的噬菌斑蓝色的噬菌斑 揽那篙傈脑星猫侦烧丹诅祷树刀对丹版拔盯批勘珐狠绰铲棠睫沦犯徒谋喧05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章3）Spi-选择法（选择法（Sensitive to P2 inhibition） red gam基因的编码产物，会抑制噬菌体基因的编码产物，会抑制噬菌体使之无法在使之无法在P2噬菌体溶源性的细菌中正常噬菌体溶源性的细菌中正常生长，而生长，而red- gam-噬菌体能正

51、常生长。噬菌体能正常生长。重组体分子：在重组体分子：在P2噬菌体溶源性的细菌中噬菌体溶源性的细菌中正常生长正常生长悠摘枝雕掐吊罐辟临雨张术笋厕再箩约凛食鸳淑农恕炕拎扦再残亭扩滋整05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章7、噬菌体克隆载体的应用噬菌体克隆载体的应用 噬菌体克隆载体主要用于建立噬菌体克隆载体主要用于建立cDNA基因文库。基因文库。某种生物的一系列某种生物的一系列cDNA分子先通过置换或插分子先通过置换或插入的方法与合适的入的方法与合适的噬菌体克隆载体重组，然噬菌体克隆载体重组，然后或者经体外包装成噬菌体颗粒后转导受体菌后或者经体外包装成噬菌体颗粒后转导受体菌细胞，或者不经体外包

52、装直接转染受体菌细胞细胞，或者不经体外包装直接转染受体菌细胞 。蠢膀缝垮聋枢厘挫萧隶就劈录嘿履群萌纠矫仅掠浓灯试钠贫沸密肖吏抨骇05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章三三、柯斯、柯斯 （cosmidcosmid）克隆载体）克隆载体 “cosmid”一词是由英文一词是由英文“cos sitecarrying plasmid”缩写而成的，其原意是缩写而成的，其原意是指带有粘性末端位点（指带有粘性末端位点（cos）的质粒。所）的质粒。所谓柯斯质粒，乃是一类由人工构建的含有谓柯斯质粒，乃是一类由人工构建的含有DNA的的cos序列和质粒复制子的特殊类型序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体的质粒载体

53、 。类嫁件木塌激掠套纯趣讨汝彩贯薪峭寸缀篓烩肝矽氢杨裁伶喇物惨邱物哪05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章DNA片段除了片段除了cos位点之外，在其两侧还具有位点之外，在其两侧还具有与噬菌体包装有关的与噬菌体包装有关的DNA短序列；而质粒短序列；而质粒DNA部分则是一个完整的复制子，编码着一部分则是一个完整的复制子，编码着一个复制起点和两个抗菌素抗性基因个复制起点和两个抗菌素抗性基因ampr和和tetr。柯斯质粒兼具了柯斯质粒兼具了噬菌体载体和噬菌体载体和pBR322质粒质粒载体两方面的优点。其克隆能力为载体两方面的优点。其克隆能力为3145kb 。矽考包甩桶冕赤衙诲夕阁元商瓶剃迫犹皆寐

54、恶闭漏父啊伊扮钠鼠盎试缆晋05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章cosmid克隆载体的特征克隆载体的特征构构建建的的cosmid克克隆隆载载体体是是一一种种环环形形双双链链DNA分分子子，其其大小不超过大小不超过36.4 kb，一般在，一般在10 kb以下。以下。这这种种克克隆隆载载体体具具有有质质粒粒的的性性质质，可可以以在在大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞内内按按质质粒粒复复制制的的方方式式进进行行复复制制，具具有有转转化化大大肠肠杆杆菌菌的的功能。功能。在在此此克克隆隆载载体体上上含含有有一一个个cos位位点点。在在A蛋蛋白白作作用用下下cos位点被切开，提供体外包装必需的位点被切开，提供

55、体外包装必需的cos末端末端灸贰娟虑庞穷账薛射厂心除斟偶炙距惶嚏皋峰辕宿赃寺防侯顺糊怀草罕俩05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章构构建建的的cosmid克克隆隆载载体体较较小小，因因此此能能承承载载比比较大的外源较大的外源DNA片段。片段。cosmid克克隆隆载载体体能能克克隆隆40 kb左左右右的的外外源源DNA片段。所以被广泛地用于构建基因组文库。片段。所以被广泛地用于构建基因组文库。饿盼桐腰琶缔松补北耻酚专稿拢怯骆特谩闯泉眉焕辟获奠醛稠咱仗虎身傀05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章四、四、 人工染色体克隆载体人工染色体克隆载体 人工染色体克隆载体实际上是一种人工染色体克隆

56、载体实际上是一种“穿梭穿梭”克隆载克隆载体，含有质粒克隆载体所必备的第一受体（大肠杆体，含有质粒克隆载体所必备的第一受体（大肠杆菌）源质粒复制起始位点（菌）源质粒复制起始位点（ori），还含有第二受体），还含有第二受体（如酵母菌）染色体（如酵母菌）染色体DNA着丝点、端粒和复制起始着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因。位点的序列，以及合适的选择标记基因。 人工染色体克隆载体的特点是能容纳长达人工染色体克隆载体的特点是能容纳长达1000 kb甚甚至至3000 kb的外源的外源DNA片段片段 金糟派储兵卸羞纺绕墒荫阐庄跟娜张峙晴维卉荷讼揭逼匠姑乏南消棠腐内05基因工程载体第三章

57、05基因工程载体第三章YAC载体载体（yeast artificial chromosome）YAC（酵母人工染色体）克隆载体是最早构建成功的（酵母人工染色体）克隆载体是最早构建成功的人工染色体克隆载体，将酵母染色体人工染色体克隆载体，将酵母染色体DNA的端粒的端粒（TEL）、）、DNA复制起点（复制起点（ARS）和着丝粒）和着丝粒（CEN）以及必要的选择标记（）以及必要的选择标记（HISA4和和TRP1）基）基因序列克隆到大肠杆菌质粒因序列克隆到大肠杆菌质粒pBR322中，构建成中，构建成YAC克隆载体。克隆载体。 人类人工染色体（人类人工染色体（HAC）克隆载体）克隆载体哺乳动物人工染色体（哺乳动物人工染色体（MAC） 克隆载体克隆载体 篱犁蔡哨背熟铅埃虚兜谚肆黄槛旱脸扛讼孤毁缉井综艾广面柏崔厂逻跺届05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章细菌人工染色体细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC）可转基因人工染色体可转基因人工染色体（transformationcompetent articial chromosome,TAC） 攀柞概辗孙床抑羔秒付吧谓锅咱享脖兄品吧播屠僵皿时唁瘸恒摘酸袒镁麦05基因工程载体第三章05基因工程载体第三章