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1、基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1 1、目的基因的获取（前提）、目的基因的获取（前提）2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建（核心）（核心）3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞（关键）（关键）4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定（保证）（保证）一、目的基因的获取一、目的基因的获取获取目的基因的常用方法获取目的基因的常用方法（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）利用）利用人工合成人工合成（DNADNA合成仪）合成仪）概念：概念：基因文库基因文库 （gene library）基因组文
2、库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如cDNA文库）文库） 将含有某种将含有某种生物不同基因的生物不同基因的许多许多DNA片段片段,导导入受体菌的群体入受体菌的群体中储存中储存,各个受体各个受体菌分别含有这种菌分别含有这种生物的不同的基生物的不同的基因因,称为基因文库称为基因文库基因文库中包含了一种生物基因文库中包含了一种生物所有的基因所有的基因,这种基因文库叫这种基因文库叫做基因组文库做基因组文库. 基因文库中包含了一种生基因文库中包含了一种生物的一部分基因物的一部分基因,这种基因这种基因文库叫做部分基因文库文库叫做部分基因文库.(1)从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因基
3、因组基因组DNADNA文库文库cDNAcDNA文库文库基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？依据依据 基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNA 基因的表达产物蛋白质基因的表达产物蛋白质方法：方法：“鸟枪鸟枪法法”又名又名 “霰霰弹法弹法”-核酸探针核酸探针PCR技术技术 聚合酶链式反应聚合酶链式反应 是一项生物是一项生物体外复制体外复制特定特定DNA片段的核酸片段的核酸合成合成技术技术。通
4、过此技术，可获取大量的目的。通过此技术，可获取大量的目的基因基因。原理：原理：前提：前提：条件条件PCR扩增仪扩增仪DNA复制复制一段已知目的基因的核苷酸序列（便于合成引物）一段已知目的基因的核苷酸序列（便于合成引物）方式：以方式：以_方式扩增，方式扩增， 即即_（n n为扩增循环的次数）为扩增循环的次数）指数指数2 2n n模板模板DNA；DNA引物；四种脱氧核引物；四种脱氧核苷酸（原料）；热稳定苷酸（原料）；热稳定DNA聚合酶聚合酶（Taq酶）；酶）；（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因n 过程变性、退火、延伸三步曲变性：加热至加热至9095双链DNA解链成为单
5、链DNA退火：冷却至冷却至5560部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至加热至7075以目的基因为模板，合成互补的新DNA链变性变性退火退火延伸延伸v（3） 人工合成法人工合成法 DNADNA合成仪合成仪根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNA DNA 蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成mRNA 反转录单链DNA DNA聚合酶聚合酶双链DNA反转录法：反转录法：化学合成法：化学合成法：缺点：由于一种氨基酸可由多种密码缺点：由于
6、一种氨基酸可由多种密码子决定，故推测的基因可能为新基因，子决定，故推测的基因可能为新基因，专一性不强专一性不强优点：操作简单优点：操作简单缺点：缺点：mRNAmRNA生存时间短，生存时间短，技术要求高，操作麻烦技术要求高，操作麻烦优点：专一性强，准确优点：专一性强，准确从基因文库中获取从基因文库中获取利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增利用人工合成利用人工合成归纳：获取目的基因的方法归纳：获取目的基因的方法2构建载体二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建核心核心（1 1）用一定的）用一定的_切切割质粒，使其出现一个切口，割质粒，使其出现一个切口，露出露出_。（2 2）用）用_切断目切断目
7、 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。（3 3）将切下的目的基因片段插入质粒的）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量处，再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同1.1.过程过程: :质粒质粒目的基因目的基因限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶表表达达载载体体同种同种1.1.过程过程: :（重组载体）（重组载体）2.2.基因表达载体
8、的组成：基因表达载体的组成：它们有什么作用？它们有什么作用？a、目的基因、目的基因b、启动子、启动子c、终止子、终止子d、标记基因、标记基因位于基因的首端位于基因的首端,是是RNA聚合酶聚合酶识别和结合的部位，识别和结合的部位， 有了它才有了它才能驱动基因转录出能驱动基因转录出mRNA.位于基因的末端位于基因的末端,终止转录终止转录检测目的基因是否导入受体细胞检测目的基因是否导入受体细胞常用的受体细胞：常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。酵母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理将目的基因导入受体细胞的原理借鉴借鉴
9、细菌或病毒侵染细胞细菌或病毒侵染细胞的途径。的途径。三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞关键关键1、将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌）农杆菌转化法转化法特点特点:能感染能感染双子叶植物双子叶植物和和祼子植物祼子植物,对对单子叶植物无感染能力单子叶植物无感染能力Ti质粒质粒的的TDNA可转移至受体细可转移至受体细胞并整合到其染色体上胞并整合到其染色体上转化过程转化过程:Ti质粒质粒目的基因目的基因构建构建表达表达载体载体导入导入植植物物细细胞胞插入插入植物细胞染植物细胞染色体色体DNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌（2）基因枪法）基因枪法 基因枪
10、法又称基因枪法又称微弹轰击法微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。的基因与其整合并表达的方法。（3）花粉管通道法）花粉管通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基（含目的基因），使目的基因
11、借助花粉管通道进入受体细胞。因借助花粉管通道进入受体细胞。2、将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞方法方法:显微注射技术显微注射技术操作程序操作程序:提纯含目的基提纯含目的基因表达载体因表达载体取受精卵取受精卵显微注射显微注射移植到子宫移植到子宫受精卵发育受精卵发育新性状动物新性状动物注入注入3、将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞常用法常用法：Ca2+处理处理常用菌常用菌：大肠杆菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：繁殖快繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少、多为单细胞、遗传物质相对少过程：过程：Ca2+处理处理大肠杆菌大肠杆菌感受态感受态细胞细胞表达载体
12、表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合感受态细感受态细胞吸收胞吸收DNA( (四四) )目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定保证保证检测检测导入检测：目的基因是否导入受体细胞导入检测：目的基因是否导入受体细胞 染色体染色体DNADNA上上方法方法DNADNA分子分子杂杂交交表达检测表达检测转录检测转录检测分子杂交分子杂交翻译检测翻译检测抗原抗体抗原抗体杂交杂交分分子子检检测测法法鉴定鉴定抗虫鉴定抗虫鉴定抗病鉴定抗病鉴定活性鉴定等活性鉴定等个体水平的鉴定个体水平的鉴定知识延伸知识延伸DNADNA分子杂交技术分子杂交技术 该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链该方法是根据碱基互补配对原则
13、，把互补的双链DNA解开，把单股的解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。或基因。返返返返 回回回回非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区RNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点外显子外显子内含子内含子终止子终止子基因的结构基因的结构启动子启动子原核原核真核真核原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码作业作业获取目的基因的方法及过程？获取目的基因的方法及过程？个人观点供参考，欢迎讨论
