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1、实验四氨基酸纸层析、实验四氨基酸纸层析、折光率的测定折光率的测定 一、实验目的一、实验目的、本实验采用纸色谱对几种氨、本实验采用纸色谱对几种氨基酸进展分别和鉴定基酸进展分别和鉴定,以了解纸色以了解纸色谱的原理，练习其操作方法。谱的原理，练习其操作方法。 2 、了解测定折光率的简单原理，、了解测定折光率的简单原理，掌握阿贝折射仪的运用方法。掌握阿贝折射仪的运用方法。 二、实验原理二、实验原理1、色谱分析法简称色谱法或层析法、色谱分析法简称色谱法或层析法色谱分析法简称色谱法或层析法。色谱分析法简称色谱法或层析法。1906年，年，俄国植物学家俄国植物学家Tsweet将将CaCO3放在竖立的玻放在竖立
2、的玻璃柱中，从顶端倒入植物色素的石油醚浸取璃柱中，从顶端倒入植物色素的石油醚浸取液，并用石油醚冲洗。在柱的不同部位构成液，并用石油醚冲洗。在柱的不同部位构成色带，因此命名为色谱。管内填充物称为固色带，因此命名为色谱。管内填充物称为固定相，冲洗剂称为流动相。定相，冲洗剂称为流动相。色谱法就是利用混合物中各组分在固定相和色谱法就是利用混合物中各组分在固定相和挪动相中进展反复的吸附或分配作用，到达挪动相中进展反复的吸附或分配作用，到达各组分分开的目的。各组分分开的目的。 分类分类:(1)按照被分别物质在固定相中的作用原理不同，色谱法可分为吸附按照被分别物质在固定相中的作用原理不同，色谱法可分为吸附色
3、谱、分配色谱、离子交换色谱等。色谱、分配色谱、离子交换色谱等。(2)按照操作方式不同，又可分为柱色谱、薄层色谱、纸色谱、气相按照操作方式不同，又可分为柱色谱、薄层色谱、纸色谱、气相色谱、和高效液相色谱等。色谱、和高效液相色谱等。 纸色谱为分配色谱，色谱过程在固定相构成的平面状层下进展。滤纸色谱为分配色谱，色谱过程在固定相构成的平面状层下进展。滤纸为载体，固定相为滤纸上的水，流动相展开剂为用水饱和过的纸为载体，固定相为滤纸上的水，流动相展开剂为用水饱和过的有机溶剂。纸色谱属于分配色谱。有机溶剂。纸色谱属于分配色谱。 衡量物质向上挪动的物理量是比移值衡量物质向上挪动的物理量是比移值Rf例例:大黄中
4、游离蒽醌的纸色谱图大黄中游离蒽醌的纸色谱图溶剂前沿溶剂前沿大黄素甲醚大黄素甲醚芦荟大黄素芦荟大黄素大黄素大黄素大黄酸大黄酸点样点点样点 、化合物的折光率、化合物的折光率 折光率象沸点一折光率象沸点一样，是液体有机物最重要的物理常数之一。，是液体有机物最重要的物理常数之一。衡量液体有机物衡量液体有机物纯度的度的规范，折光率比沸点更可靠。利用折光范，折光率比沸点更可靠。利用折光率不率不仅可可鉴定未知物，且可确定沸点和构造定未知物，且可确定沸点和构造类似的液体混合物似的液体混合物的的组成。成。 液体的折光率不但与构造和入射光的波液体的折光率不但与构造和入射光的波长有关，有关，而且也受温度、而且也受温
5、度、压力等要素的影响。由于大气的力等要素的影响。由于大气的变化化对折光率的折光率的测定影响并不定影响并不显著，所以，通常著，所以，通常表示折光率表示折光率时只只标明入射光明入射光线的波的波长和和测定定时的的温度。例如，在入射光温度。例如，在入射光为钠的黄光的黄光(波波长为589.3nm)，测定温度定温度为20时，水的折光率，水的折光率为1.3330，表示，表示为 = 13330。这里里n代表折光代表折光率，率，20代表代表测定定时的温度，的温度，D代表代表钠光。光。 折光率可以经过折光仪准确地测定出来，常用的是阿贝折光率可以经过折光仪准确地测定出来，常用的是阿贝(Abble)折射仪。折射仪。
6、阿阿贝折射折射仪根本原理根本原理 在一定的外界在一定的外界(如温度、如温度、压力等力等)条件下，波条件下，波长一定的一定的单色光从介色光从介质A斜射入介斜射入介质B时，要，要发生折射景象。生折射景象。其入射角其入射角与折射与折射的正弦之比是一个的正弦之比是一个常数，并且与常数，并且与这两个介两个介质的折射率的折射率nA(介介质A)、nB(介介质B)成反比。即：成反比。即：根据折射定律可得：根据折射定律可得： 当当那那么么所以所以(折射角的最大值，称为临界角折射角的最大值，称为临界角 ) 时sin0=1 在在临界角以内的区域都有光界角以内的区域都有光线经过,是亮堂的，在是亮堂的，在临界角以外的界
7、角以外的区域没有光区域没有光线经过，是暗的。在，是暗的。在临界角上正好是界角上正好是“半明半暗如半明半暗如图4-2所示。目所示。目镜上有一个十字交叉上有一个十字交叉线，假，假设十字交叉十字交叉线与明暗与明暗分界限重合，就表示光分界限重合，就表示光线由被由被测液体液体进入棱入棱镜时的入射角正好的入射角正好为90。 由于由于 ,棱镜的折光率棱镜的折光率nB是常数，各种液体的是常数，各种液体的折光率不同，临界角也不同。经过测定临界角的相对位置，经过折光率不同，临界角也不同。经过测定临界角的相对位置，经过换算就可以找出液体的折光率，阿贝折光仪的刻度是经过换算后换算就可以找出液体的折光率，阿贝折光仪的刻
8、度是经过换算后的折光率的读数，故可直接读出折光率。的折光率的读数，故可直接读出折光率。 阿贝阿贝(Abbe)折光仪折光仪 阿贝阿贝(Abbe)折光仪折光仪 阿贝阿贝Abbe折光仪的构造如折光仪的构造如图。它的主要组成部分是两块直图。它的主要组成部分是两块直角棱镜组成的棱镜组，上面一块角棱镜组成的棱镜组，上面一块是外表光滑的丈量棱镜，下面一是外表光滑的丈量棱镜，下面一块是外表磨砂的可以开启的辅助块是外表磨砂的可以开启的辅助棱镜。左面的镜筒是读数镜筒，棱镜。左面的镜筒是读数镜筒，内有刻度盘，其上面有两行数值。内有刻度盘，其上面有两行数值。右边一行是折射率数值右边一行是折射率数值1.30001.70
9、00，左边一行是工业上，左边一行是工业上丈量溶液浓度的标度丈量溶液浓度的标度095%。右面的镜筒是丈量目镜，用。右面的镜筒是丈量目镜，用来察看折光情况。筒内装有消色来察看折光情况。筒内装有消色散棱镜。光线由反射镜射入辅助散棱镜。光线由反射镜射入辅助棱镜，发生漫射，以不同人射角棱镜，发生漫射，以不同人射角射入液层，然后再射到丈量棱镜射入液层，然后再射到丈量棱镜的外表上。此时一部分光线经折的外表上。此时一部分光线经折射后进入丈量目镜，另一部分光射后进入丈量目镜，另一部分光线那么发生全反射。调理螺旋，线那么发生全反射。调理螺旋，以使丈量目镜中的视野以使丈量目镜中的视野 半明半半明半暗。暗。 三、实验
10、步骤三、实验步骤一纸层析一纸层析1在滤纸条上端边缘约在滤纸条上端边缘约1厘米的中央剪一小厘米的中央剪一小孔。孔。2将滤纸条平放于干净的纸上，在间隔滤纸将滤纸条平放于干净的纸上，在间隔滤纸下端下端1cm处用铅笔轻画一横线，并在横线的中处用铅笔轻画一横线，并在横线的中央画不断径为央画不断径为2mm的小圆圈。的小圆圈。3用毛细管汲取氨基酸混合液，在滤纸条下用毛细管汲取氨基酸混合液，在滤纸条下端的小圆圈内点样。端的小圆圈内点样。 4. 取枯燥大试管，参与被水饱和的酚溶液取枯燥大试管，参与被水饱和的酚溶液10ml，留意勿使溶液沾到试管壁上，将试管，留意勿使溶液沾到试管壁上，将试管垂直固定于铁架台上。垂直
11、固定于铁架台上。5. 在距滤纸条下端在距滤纸条下端0.5cm处穿大头针。从滤纸处穿大头针。从滤纸条上端小孔处穿棉线并左右分开，调理线的高条上端小孔处穿棉线并左右分开，调理线的高度使滤纸垂直悬于试管内且下湍浸入溶液度使滤纸垂直悬于试管内且下湍浸入溶液0.5cm，留意勿使点样点浸入溶液中，亦勿使，留意勿使点样点浸入溶液中，亦勿使滤纸条接触试管壁。滤纸条接触试管壁。6. 此时即可看到溶剂向上挪动，溶剂升到一此时即可看到溶剂向上挪动，溶剂升到一定高度时，小心将纸条取出，以铅笔标出溶剂定高度时，小心将纸条取出，以铅笔标出溶剂上升的前沿。上升的前沿。 7. 将滤纸条两端，用大头针钉在小木框上，吹将滤纸条两
12、端，用大头针钉在小木框上，吹干后用喷雾器均匀地喷一层干后用喷雾器均匀地喷一层0.2%茚三酮乙醇溶茚三酮乙醇溶液，然后再将滤纸条吹干，即可看到纸上显出液，然后再将滤纸条吹干，即可看到纸上显出三色点，每个色点代表一种氨基酸。三色点，每个色点代表一种氨基酸。8. 分别丈量并计算三种氨基酸的分别丈量并计算三种氨基酸的Rf，再根据教，再根据教师供应的值确定此三个色点各为何种氨基酸。师供应的值确定此三个色点各为何种氨基酸。9. 留在试管内的酚溶剂切勿弃去，塞紧塞子。留在试管内的酚溶剂切勿弃去，塞紧塞子。氨基酸氨基酸Rf值值蛋氨酸蛋氨酸 0.84丙氨酸丙氨酸 0.62谷氨酸谷氨酸 0.32 二折光率的测定二
13、折光率的测定1、折光仪读数的校正、折光仪读数的校正 1将阿贝折光仪置于普通白炽灯前或将阿贝折光仪置于普通白炽灯前或接近窗户的桌子上。但不要放在直射的阳接近窗户的桌子上。但不要放在直射的阳光下，以免液体试样迅速蒸发。将温度计光下，以免液体试样迅速蒸发。将温度计插人金属匣中，然后接道恒温水，恒温插人金属匣中，然后接道恒温水，恒温20min左右。恒温温度可以从温度计中读左右。恒温温度可以从温度计中读出。出。 2旋开棱镜锁紧扳手，开启铺助棱镜，旋开棱镜锁紧扳手，开启铺助棱镜，用按镜纸蘸少量乙酸或丙酮悄然揩拭用按镜纸蘸少量乙酸或丙酮悄然揩拭镜面。待镜面枯燥后，滴加镜面。待镜面枯燥后，滴加12滴蒸馏水滴蒸
14、馏水于辅助棱镜面上，旋紧棱镜锁紧扳手，使于辅助棱镜面上，旋紧棱镜锁紧扳手，使蒸馏水均匀地充溢视场，留意不要有气泡。蒸馏水均匀地充溢视场，留意不要有气泡。 3调理反光理反光镜，使从丈量目，使从丈量目镜中察看到的中察看到的视场最亮。最亮。调理目理目镜，使聚焦于，使聚焦于“十字的支点上。十字的支点上。调整消色散棱整消色散棱镜手手轮，使，使视场中呈中呈现黑白分界限。黑白分界限。转动棱棱镜转动手手轮，使黑白分界限恰与，使黑白分界限恰与“十字十字的交点重合。的交点重合。4记下蒸下蒸馏水的折光率，反复操作水的折光率，反复操作23次，次，与与规范范值比比较，得到零点的校正，得到零点的校正值。2、加样、加样 翻
15、开棱翻开棱镜，用擦，用擦镜纸(必要必要时用用丝绢沾少量乙醇或丙沾少量乙醇或丙酮)悄然擦悄然擦洗上下洗上下镜面，要面，要单向擦，不要来回擦。待溶向擦，不要来回擦。待溶剂挥发后，滴后，滴12滴待滴待测液体于磨砂棱液体于磨砂棱镜面上面上,小心地封小心地封锁棱棱镜，使液体，使液体铺满整个整个镜面面 。 3、对光光 调理反光镜使入射光调理反光镜使入射光到达最强，目镜内视场亮到达最强，目镜内视场亮堂，悄然转动棱镜调理旋堂，悄然转动棱镜调理旋钮，直到在望远镜内察看钮，直到在望远镜内察看到明暗分界限或彩色光带。到明暗分界限或彩色光带。4、消色、消色 转动棱镜微调旋纽消色散至看到一个黑白转动棱镜微调旋纽消色散至
16、看到一个黑白明晰的分界限明晰的分界限,如下图如下图. 转动棱棱镜调理旋理旋钮使分界限使分界限对准十字交叉准十字交叉线的的中心。中心。 5、精、精调 6、 读数数 从镜筒读出折光率位于下面的刻度并记下从镜筒读出折光率位于下面的刻度并记下测定时的温度测定时的温度,反复反复23次次 7、清洗、清洗 测好样品后，用擦镜纸悄然擦去上下镜面上的液体，再用测好样品后，用擦镜纸悄然擦去上下镜面上的液体，再用乙醇或丙酮润湿的擦镜纸单向擦上下镜面，待棱镜干后，旋紧乙醇或丙酮润湿的擦镜纸单向擦上下镜面，待棱镜干后，旋紧锁钮锁钮. 1 层析缸要预先饱和，展开剂勿附着于大试层析缸要预先饱和，展开剂勿附着于大试管内壁。管
17、内壁。2点样量要适当，太少效果不明显，太多分点样量要适当，太少效果不明显，太多分别不好。别不好。 要求点的样直径不超越要求点的样直径不超越.。无论在预备任务中还是以后的实验过程中，无论在预备任务中还是以后的实验过程中，都不要用手触摸纸条中部，由于手上不干净物都不要用手触摸纸条中部，由于手上不干净物或皮屑落在纸上会产生多余斑点而干扰实验结或皮屑落在纸上会产生多余斑点而干扰实验结果果 4样品点不能浸入展开剂中。样品点不能浸入展开剂中。留意：留意： 5Abbe折光折光仪运用前运用前,必需用重蒸必需用重蒸馏水水( =1.3330)或或规范折光玻璃范折光玻璃块校正校正.每次每次测定前、后定前、后都必需用
18、都必需用12滴丙滴丙酮或乙醇滴于棱或乙醇滴于棱镜面上，合上面上，合上棱棱镜，使上下，使上下镜面全部被丙面全部被丙酮润湿再翻开棱湿再翻开棱镜，然后用擦然后用擦镜纸擦干丙擦干丙酮。6严禁腐禁腐蚀性液体、性液体、强酸、酸、强碱、氟化物等的碱、氟化物等的运用。运用。7阿阿贝折射折射仪的关的关键部位是棱部位是棱镜，必需留意，必需留意维护。滴加液体。滴加液体时，滴管的末端切不可触及棱，滴管的末端切不可触及棱镜，擦洗棱擦洗棱镜时要要单向擦，不要来回擦，以免在向擦，不要来回擦，以免在镜面面上呵斥痕迹。在每次滴加上呵斥痕迹。在每次滴加样品前品前应洗洗净镜面，面，测完完样品后也要用丙品后也要用丙酮或或95乙醇擦洗
19、乙醇擦洗镜面，待晾面，待晾干后再封干后再封锁棱棱镜。 8阿阿贝折射折射仪的量程的量程为13000一一17000，精，精细度度为土土00001，通常用四位有效数字，通常用四位有效数字进展展记录。丈量温度。丈量温度应控制在控制在01范范围内。内。9阿阿贝折射折射仪不能在不能在较高温度下运用。高温度下运用。 物物质名称名称物物质名称名称薄荷油薄荷油1.46001.46001.47001.4700大豆油大豆油1.47221.47221.47601.4760花生油花生油1.46251.46251.46451.4645 乙酸乙乙酸乙酯 1.27251.27251.37451.3745松松节油油1.46001.46001.43001.4300苯甲醇苯甲醇1.53851.53851.54051.5405不同物质的折光率：不同物质的折光率：
