经典一组织培养技术

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1、组织培养技术组织培养技术组织培养技术组织培养技术 硕士研究生选修课程系列硕士研究生选修课程系列硕士研究生选修课程系列硕士研究生选修课程系列硕士研究生选修课程系列硕士研究生选修课程系列 Tissue culture Tissue culture 绪绪绪绪 论论论论 组织培养技术组织培养技术 绪绪 论论2这是一个真核细胞模型这是一个真核细胞模型这是一个真核细胞模型这是一个真核细胞模型这是一个真核细胞模型这是一个真核细胞模型Can you describe it? Can you describe it? Can you describe it? 3原核细胞与真核细胞比较原核细胞与真核细胞比较4一、

2、基本概念一、基本概念组织培养组织培养组织培养组织培养 tissue culturetissue culture nn从体内取出组织模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营从体内取出组织模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营从体内取出组织模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营从体内取出组织模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。nn使用组织块（使用组织块（使用组织块（使用组织块（O.5O

3、.511立方毫米）或薄片（厚立方毫米）或薄片（厚立方毫米）或薄片（厚立方毫米）或薄片（厚0.2 0.2 毫米）毫米）毫米）毫米）5 细胞培养细胞培养细胞培养细胞培养 Cell CultureCell Culture nn方法同上，培养物是单个细胞或细胞群。方法同上，培养物是单个细胞或细胞群。方法同上，培养物是单个细胞或细胞群。方法同上，培养物是单个细胞或细胞群。 组织培养组织培养组织培养组织培养人工环境人工环境 生存环境改变细胞移动长时间，反复传代 细胞培养细胞培养细胞培养细胞培养单一类型细胞“组织特性” 6 器官培养器官培养器官培养器官培养 Organ CultureOrgan Cultur

4、e nn应用和组织培养相似的条件，培养的是器官的原基、器官的一部应用和组织培养相似的条件，培养的是器官的原基、器官的一部应用和组织培养相似的条件，培养的是器官的原基、器官的一部应用和组织培养相似的条件，培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。nn使用器官原基或器官的一部分或整个器宫使用器官原基或器官的一部分或整个器宫使用器官原基或器官的一部分或整个器宫使用器官原基或器官的一部分或整个

5、器宫 7动物细胞培养用动物细胞培养用容器及培养基容器及培养基Culture vessels and mediumfor animal cell culture 体外培养体外培养 in vitron细胞培养细胞培养 Cell culture n组织培养组织培养 Tissue culture n器官培养器官培养 Organ culture 体外培养种类体外培养种类8二、发展史二、发展史德国人德国人Roux（1885）用温生理盐水体外培养鸡胚组织并用温生理盐水体外培养鸡胚组织并存活数月被认为是组织培养的萌芽试验。存活数月被认为是组织培养的萌芽试验。1903年年Jolly用盖片悬滴培养法，培养蝾螈白细

6、胞生活一用盖片悬滴培养法，培养蝾螈白细胞生活一月，提示组织或细胞离体后，在人工培养条件下，仍能生月，提示组织或细胞离体后，在人工培养条件下，仍能生存。存。1907年年Harrison创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法，在创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法，在无菌条件下，采用淋巴液作培养基，培养蛙胚神经组织生无菌条件下，采用淋巴液作培养基，培养蛙胚神经组织生活了数周，并曾观察到神经细胞凸起的生长过程。由此建活了数周，并曾观察到神经细胞凸起的生长过程。由此建立了体外培养组织和细胞的基本模式系统。立了体外培养组织和细胞的基本模式系统。1923年，年，Carrel设计了卡式瓶培养法，扩大了组织的生存设计了

7、卡式瓶培养法，扩大了组织的生存空间。空间。9 1924年年Maximow的双盖的双盖片培养法，使之更易于传片培养法，使之更易于传代和减少污染。代和减少污染。 1957年年Dulbecco 等采用等采用胰蛋白酶消化处理和应用胰蛋白酶消化处理和应用液体培养基的方法，获得液体培养基的方法，获得了的单层细胞培养，单层了的单层细胞培养，单层培养成了组织培养普遍应培养成了组织培养普遍应用的技术。促进了细胞系用的技术。促进了细胞系(cell line)的建立。的建立。近年各种条件已商品化系近年各种条件已商品化系列化，应用冷冻技术，各列化，应用冷冻技术，各国建立细胞库国建立细胞库 组织培养发展示意图组织培养发

8、展示意图 10我国组织培养的发展我国组织培养的发展20世纪世纪30年代传入我国。年代传入我国。20世纪世纪50年代起步年代起步20世纪世纪70年代，成为年代，成为医学和生物学研究中普遍应用的手医学和生物学研究中普遍应用的手段段。近近20年，建立了人和各种动物肿瘤及其他细胞系，细胞培年，建立了人和各种动物肿瘤及其他细胞系，细胞培养库已初步建成，细胞培养用品，培养剂、学清、试剂等养库已初步建成，细胞培养用品，培养剂、学清、试剂等已商品化。已商品化。高科技的引入和开展，各种培养用具不断被引入，电镜技高科技的引入和开展，各种培养用具不断被引入，电镜技术、标记技术、单细胞显微注射、荧光免疫、电泳技术、术

9、、标记技术、单细胞显微注射、荧光免疫、电泳技术、杂交瘤技术、杂交瘤技术、DNA转染核细胞转化、分子杂交等转染核细胞转化、分子杂交等11实验操作者需要注意的问题实验操作者需要注意的问题1.掌握操作技术，理解各种操作的基本原理掌握操作技术，理解各种操作的基本原理2.有判定细胞生长好坏和是否发生污染的能力有判定细胞生长好坏和是否发生污染的能力3.熟悉体外培养细胞的生存条件、细胞的生物学性熟悉体外培养细胞的生存条件、细胞的生物学性状和相关的基本理论知识。状和相关的基本理论知识。12各种液体要专人配制，并保证做到按规程行事；制备浓度精确、灭菌各种液体要专人配制，并保证做到按规程行事；制备浓度精确、灭菌可

10、靠。所有制备好的溶液和试剂瓶上都要有标签，注上名称、浓度、可靠。所有制备好的溶液和试剂瓶上都要有标签，注上名称、浓度、消毒与否和制备日期。消毒与否和制备日期。一切培养用品都要有固定的存放地点（尤其培养用品与非培养用品应一切培养用品都要有固定的存放地点（尤其培养用品与非培养用品应严格分开；以消毒与未消毒品应严格分开存放），严格分开；以消毒与未消毒品应严格分开存放），目的：避免各种杂质混入细胞生存环境、防止目的：避免各种杂质混入细胞生存环境、防止微生物感染微生物感染和和细胞细胞“污污染染”。n细胞污染：不同细胞之间因操作不严造成的相互混杂，使细胞群体部村的现象。细胞污染：不同细胞之间因操作不严造成

11、的相互混杂，使细胞群体部村的现象。组织培养是一种程序比较复杂、需求条件多而严格的实验性工作。由于工作环节多，为保组织培养是一种程序比较复杂、需求条件多而严格的实验性工作。由于工作环节多，为保证操作上的一致性，避免造成人为的差异，应将所有操作程序制定统一规范，在一定时间证操作上的一致性，避免造成人为的差异，应将所有操作程序制定统一规范，在一定时间内保持相对稳定和人人遵守。内保持相对稳定和人人遵守。实验室管理制度实验室管理制度13三、组织培养优缺点三、组织培养优缺点优点：优点：1.1.能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动 ；可；可用于细胞学、遗传学、

12、免疫学、实验医学和肿瘤学等多用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科的研究工作种学科的研究工作2.2.便于观察、记录、摄影便于观察、记录、摄影 ，直接观察细胞变化，直接观察细胞变化 3.3.可供研究的细胞种类广泛，从低等生物到高等动物，以可供研究的细胞种类广泛，从低等生物到高等动物，以及人类；从胚胎到成体；从正常组织到肿瘤细胞，皆可及人类；从胚胎到成体；从正常组织到肿瘤细胞，皆可 4.4.便于使用不同方法研究细胞（相差显微镜、荧光显微镜、便于使用不同方法研究细胞（相差显微镜、荧光显微镜、电自显微镜、组织化学和同位素标记等）电自显微镜、组织化学和同位素标记等） 145.5.易于施加

13、物理、化学和生物因素进行实验易于施加物理、化学和生物因素进行实验 6.6.培养细胞携带有与体内细胞同等的基因组，也是分培养细胞携带有与体内细胞同等的基因组，也是分子生物学和基因工程学的研究对象和组成部分。子生物学和基因工程学的研究对象和组成部分。7.7.可同时提供大量生物性状相似的实验对象，耗资少，可同时提供大量生物性状相似的实验对象，耗资少，经济。经济。8.8.已成为生物制品、基因工程制品、单克隆抗体生产已成为生物制品、基因工程制品、单克隆抗体生产的必要手段的必要手段 15 作为一种技术，有其局限性作为一种技术，有其局限性 组织和细胞离体以后，独立生存在人工培养环境中，与体内环组织和细胞离体

14、以后，独立生存在人工培养环境中，与体内环境相比，仍有很大差异。故实验结果不能外推至体内，轻易做出境相比，仍有很大差异。故实验结果不能外推至体内，轻易做出与体内等同的结论。与体内等同的结论。 16组织培养基本理论知识组织培养基本理论知识组织培养基本理论知识组织培养基本理论知识 组织培养技术组织培养技术 第一章第一章 17一、组织培养细胞生物学一、组织培养细胞生物学18 1.体内外细胞的差异体内外细胞的差异n当细胞被置于体外培养后，一旦失去神经体液的调节当细胞被置于体外培养后，一旦失去神经体液的调节和细胞相互间的影响，生活在缺乏动态平衡的环境中，和细胞相互间的影响，生活在缺乏动态平衡的环境中，发生

15、变化是必然的。发生变化是必然的。n培养细胞最多见的表现是：失去原有组织结构和细胞培养细胞最多见的表现是：失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显、出现类似形态、分化减弱或不显、出现类似“返祖现象返祖现象”；表；表现为细胞趋向单一化，或获得不死性，或变成具有恶现为细胞趋向单一化，或获得不死性，或变成具有恶性性状的细胞群。性性状的细胞群。19 n可能的机制：组成人体的细胞高度分化，细胞间呈现可能的机制：组成人体的细胞高度分化，细胞间呈现着高度的相互依存性、个体细胞相对失去独立性。从着高度的相互依存性、个体细胞相对失去独立性。从受精卵形成开始，细胞的两个基本过程增殖和分化，受精卵形成开始，细胞的两

16、个基本过程增殖和分化，便协调地进行着。增殖使细胞数量增多，分化使机体便协调地进行着。增殖使细胞数量增多，分化使机体结构和功能多样化，最终演变形成完整的人体。此间结构和功能多样化，最终演变形成完整的人体。此间每个细胞的生命活动，均听命于外源信号，通过相关每个细胞的生命活动，均听命于外源信号，通过相关基因的调控，使之发生增殖或分化的表达。当细胞被基因的调控，使之发生增殖或分化的表达。当细胞被立体培养后，信号来源切断，特定基因分化表达减弱立体培养后，信号来源切断，特定基因分化表达减弱或停止。而进化中保守的细胞增殖活动却可维持；遂或停止。而进化中保守的细胞增殖活动却可维持；遂使体内外细胞出现了差异。使

17、体内外细胞出现了差异。20 2.培养细胞的分化培养细胞的分化n不适应不适应 deadaptionv细胞在体内的分化特性减弱或不表现，如干细胞产生酪氨酸细胞在体内的分化特性减弱或不表现，如干细胞产生酪氨酸转移酶的特性的丧失。转移酶的特性的丧失。v主要因环境改变所致。细胞在体外培养时间越长，分化改变主要因环境改变所致。细胞在体外培养时间越长，分化改变越大；细胞刚立体培养时，先出现的现象可能属不适应，即越大；细胞刚立体培养时，先出现的现象可能属不适应，即由于环境的改变而出现的变化。由于环境的改变而出现的变化。v生存条件的改变是分化发生阻抑；生存条件的改变是分化发生阻抑；21n去分化去分化dediff

18、erentiationv细胞失掉发生分化的能力。如肝脏细胞，当肝细胞失掉产生精细胞失掉发生分化的能力。如肝脏细胞，当肝细胞失掉产生精氨酸酶、氨基转移酶等特性后，则失掉储存肝糖原能力，并很氨酸酶、氨基转移酶等特性后，则失掉储存肝糖原能力，并很难再现。难再现。v从分子水平考虑，去分化可能是基因变异所致。从分子水平考虑，去分化可能是基因变异所致。v体外培养细胞不仅有分化潜能，是脊髓细胞来源中枢和遗传性体外培养细胞不仅有分化潜能，是脊髓细胞来源中枢和遗传性状的不同，很多细胞也呈现一定程度的分化表达现象。如毛细状的不同，很多细胞也呈现一定程度的分化表达现象。如毛细血管内皮细胞在体外培养时，可形成类似血管

19、样结构，但仅限血管内皮细胞在体外培养时，可形成类似血管样结构，但仅限于初代培养和接种在类似基膜物质底物上生长时才可发生。说于初代培养和接种在类似基膜物质底物上生长时才可发生。说明与体内条件越近四是，细胞越易发生分化。细胞离体培养时明与体内条件越近四是，细胞越易发生分化。细胞离体培养时间越长，分化能力越差；培养细胞在体外生存时间与其分化能间越长，分化能力越差；培养细胞在体外生存时间与其分化能力成反向关系。力成反向关系。22 n细胞置于体外培养时，因环境的改变，细胞分化的表细胞置于体外培养时，因环境的改变，细胞分化的表达形式也发生了与体内时不同的变化。如二倍体成纤达形式也发生了与体内时不同的变化。

20、如二倍体成纤维细胞，在体外可传维细胞，在体外可传30-50待，相当于待，相当于150-300个细胞周个细胞周期，最后衰老死亡，呈现着生命发展分化过程。期，最后衰老死亡，呈现着生命发展分化过程。n阐明细胞分化机制不仅是了解癌变机理和攻克癌症的阐明细胞分化机制不仅是了解癌变机理和攻克癌症的核心问题，也是人们支配生物生长、解决人类物质需核心问题，也是人们支配生物生长、解决人类物质需要的极重要的手段，培养细胞是研究分化最理想的实要的极重要的手段，培养细胞是研究分化最理想的实验对象。验对象。23有分化特性的细胞系和细胞株有分化特性的细胞系和细胞株组织来源组织来源细胞系细胞系增殖性增殖性物种物种分化特性分

21、化特性脾脾Friend永生永生小鼠小鼠合成血红蛋白合成血红蛋白Morris肝癌肝癌HTC永生永生 大鼠大鼠酪氨酸转移酶诱导酪氨酸转移酶诱导髓性白血病髓性白血病K562永生永生人人合成血红蛋白合成血红蛋白垂体瘤垂体瘤GH2,GH3永生永生大鼠大鼠产生生长激素产生生长激素黑色素瘤黑色素瘤B16永生永生小鼠小鼠产生色素产生色素髓性白血病髓性白血病HL60永生永生人人合成球蛋白合成球蛋白胶质瘤胶质瘤CCM永生永生人人胶质纤维酸性蛋白胶质纤维酸性蛋白成神经细胞瘤成神经细胞瘤C1300永生永生大鼠大鼠生长轴突生长轴突24 3.培养细胞形态分类培养细胞形态分类n n贴附型贴附型v能贴附在支持物表面生长。大多

22、数培养细胞呈贴附性生长；能贴附在支持物表面生长。大多数培养细胞呈贴附性生长；只依赖于贴附才能生长。只依赖于贴附才能生长。v贴附后，易失去其原有的特征，细胞分化现象常不显著。贴附后，易失去其原有的特征，细胞分化现象常不显著。在形态上表现单一化的现象，并常反应其胚层起源，呈现在形态上表现单一化的现象，并常反应其胚层起源，呈现类似类似“返祖现象返祖现象”v成纤维细胞、上皮型细胞、游走型细胞及多形型细胞成纤维细胞、上皮型细胞、游走型细胞及多形型细胞25 （1）成纤维性细胞：）成纤维性细胞：n细胞体呈梭形或不规则三角细胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质形，中央有卵圆形核，胞质向外伸出向外伸出

23、2-3个长短不同的突个长短不同的突起。起。n细胞生长时多呈放射状、火细胞生长时多呈放射状、火焰状或漩涡状走行。焰状或漩涡状走行。n包括成纤维细胞，中胚层间包括成纤维细胞，中胚层间充质起源组织（心肌、平滑充质起源组织（心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等）肌、成骨细胞、血管内皮等）细胞培养类型细胞培养类型 26 （2）上皮型细胞）上皮型细胞n扁平不规则多角形，中有圆形扁平不规则多角形，中有圆形核，细胞紧密相连成单层膜。核，细胞紧密相连成单层膜。n起源于内、外胚层细胞（皮肤起源于内、外胚层细胞（皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、表皮及其衍生物、消化管上皮、肝、胰和肺泡上皮）肝、胰和肺泡上皮）27 （3

24、）游走型细胞）游走型细胞n在支持物上散在生长，一般不在支持物上散在生长，一般不连接成片。细胞质经常伸出伪连接成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快而且不规则。形运动，速度快而且不规则。n此型细胞不稳定此型细胞不稳定28 （4）多形型细胞）多形型细胞n上述三型细胞，神经组织细上述三型细胞，神经组织细胞等胞等29 悬浮型悬浮型n胞体为圆形胞体为圆形n悬浮在培养液中生长，生存空间大，容许长时间生长，悬浮在培养液中生长，生存空间大，容许长时间生长，能繁殖多量细胞，便于做细胞代谢等研究。能繁殖多量细胞，便于做细胞代谢等研究。30 4.培养细胞的形态结构培

25、养细胞的形态结构n大体形态：大体形态：v液体环境中，胞体呈圆形；当贴附于支持物表面后，开始为圆液体环境中，胞体呈圆形；当贴附于支持物表面后，开始为圆形，很快过渡成扁平形态。细胞大体形态可随支持物的构型而形，很快过渡成扁平形态。细胞大体形态可随支持物的构型而改变。改变。v普通光镜下，细胞是均质而透明的，结构不明显。普通光镜下，细胞是均质而透明的，结构不明显。v相差显微镜可看清细胞的轮廓和内部结构。固定染色法和特殊相差显微镜可看清细胞的轮廓和内部结构。固定染色法和特殊技术可显示细胞器等结构。技术可显示细胞器等结构。一代生存期：潜伏期、指数增生期和停滞期一代生存期：潜伏期、指数增生期和停滞期31n超

26、微结构：超微结构：v电镜下可见细胞膜、细胞器等。电镜下可见细胞膜、细胞器等。v细胞外衣：细胞膜表面常附有由细胞分泌物形成的糖蛋白膜，细胞外衣：细胞膜表面常附有由细胞分泌物形成的糖蛋白膜，对细胞的运动和贴附有作用。用胰蛋白酶消化处理细胞，能改对细胞的运动和贴附有作用。用胰蛋白酶消化处理细胞，能改变其性质，使细胞易从支持物上脱落下来。变其性质，使细胞易从支持物上脱落下来。32 5.培养细胞生长与增殖过程培养细胞生长与增殖过程n n传代传代传代传代 passage / subculturepassage / subculture：v当细胞增值达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更当细胞增值达到一

27、定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存。新营养液，否则将影响细胞的继续生存。n（一）组织培养细胞生命期（一）组织培养细胞生命期n（二）组织培养细胞一代生存期（二）组织培养细胞一代生存期33（一）组织培养细胞生命期（一）组织培养细胞生命期（一）组织培养细胞生命期（一）组织培养细胞生命期n初代培养期初代培养期primary culturev从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1-41-4周。周。v此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。形态相似。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。形态相似。

28、v细胞群是异质的，也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互细胞群是异质的，也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。依存性强。n传代培养期传代培养期v初代培养期一经传代后便改称做细胞系初代培养期一经传代后便改称做细胞系cell linecell line。此期为三此期为三期最长者。可维持二倍体核型（二倍体细胞系）。期最长者。可维持二倍体核型（二倍体细胞系）。v当传代当传代30-5030-50代后，细胞增殖逐渐缓慢，以致完全停止。代后，细胞增殖逐渐缓慢，以致完全停止。Life span of culture cellsLife span of culture cellsLife span o

29、f culture cells34 n衰退期衰退期v细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡后衰退凋亡 少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），细少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），细胞可能发生自发转化胞可能发生自发转化 转化标志：转化标志：n细胞获得永生性（细胞或持久性增殖能力），核型多变成异倍体细胞获得永生性（细胞或持久性增殖能力），核型多变成异倍体3536（二）组织培养（二）组织培养 细胞一代细胞一代 生存期生存期细胞一代细胞一代n从细胞接种到分离再培养时的一段时间。从细

30、胞接种到分离再培养时的一段时间。n为培养工作中的习惯说法为培养工作中的习惯说法 3738体外培养细胞一代增殖生长过程体外培养细胞一代增殖生长过程 潜伏期：潜伏期：潜伏期：潜伏期：n悬浮状态，胞体呈圆球形。接着是贴附在底悬浮状态，胞体呈圆球形。接着是贴附在底物表面上，称为贴壁，贴壁后变成极性细胞。物表面上，称为贴壁，贴壁后变成极性细胞。n0-240-24小时小时指数增生期：指数增生期：指数增生期：指数增生期：n增殖旺盛，是进行各种实验最好的和最主要增殖旺盛，是进行各种实验最好的和最主要的阶段。的阶段。n接触抑制接触抑制n密度抑制密度抑制：培养液中营养成分减少，代谢产：培养液中营养成分减少，代谢产

31、物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，发生密度抑制，导致细胞分裂停止。响，发生密度抑制，导致细胞分裂停止。停滞期停滞期n细胞数量持平，无增值活动，但有代谢活动。细胞数量持平，无增值活动，但有代谢活动。此时需传代此时需传代39 6.培养细胞增殖动力学培养细胞增殖动力学n人体细胞有两种基本状态：增殖态、功能态人体细胞有两种基本状态：增殖态、功能态细胞存在形式和细胞增殖周期关系细胞存在形式和细胞增殖周期关系40 n 有丝分裂有丝分裂n nG G G G1 1 1 1期：期：期：期：v细胞分裂后期，蛋白质合成、RNA合成，胞体逐渐增大。有调节点n nS S S

32、 S期：期：期：期：vDNA合成期，此阶段，易受致突变或致癌因素作用；遗传物质易受致突变物损伤的时期。n nG2G2G2G2期：期：期：期：v细胞分裂前期，对外界环境敏感，易受影响受阻不能进入M期。n nM M M M期：期：期：期：v细胞有丝分裂期，分四期 G1期期 S期期 G2期期 M期期细胞周期细胞周期（一）增殖态（一）增殖态（一）增殖态（一）增殖态Proliferation stateProliferation stateProliferation state41 n细胞进行特定功能活动如分泌、传导、吞噬、收缩等的时期，是细胞进行特定功能活动如分泌、传导、吞噬、收缩等的时期，是细胞的第

33、二种生存状态。细胞的第二种生存状态。n是两次增殖周期间的间期，或称是两次增殖周期间的间期，或称G0期。期。 体外培养细胞属活跃增殖细胞，在培养液中营养充分条件下，可反体外培养细胞属活跃增殖细胞，在培养液中营养充分条件下，可反复进行增殖活动，具有较短的复进行增殖活动，具有较短的G0i期。期。 正常细胞增殖，须提供生长因子；恶性转化细胞可自泌产生生长因正常细胞增殖，须提供生长因子；恶性转化细胞可自泌产生生长因子，降低了血清需求。子，降低了血清需求。（二）功能态（二）功能态（二）功能态（二）功能态Functional stateFunctional stateFunctional state42 7

34、.7.培养细胞遗传学特征培养细胞遗传学特征培养细胞遗传学特征培养细胞遗传学特征n nn核型变化：核型变化：核型变化：核型变化：核型变化：核型变化：vv初代培养时为二倍体细胞，传代后可能长期保持二倍体状态为主，经过长初代培养时为二倍体细胞，传代后可能长期保持二倍体状态为主，经过长期传代后，会偏离二倍体呈多倍体和异倍体期传代后，会偏离二倍体呈多倍体和异倍体vv长期不用的细胞或新引入的细胞应做定期核型检查长期不用的细胞或新引入的细胞应做定期核型检查n nn永生化及恶变永生化及恶变永生化及恶变永生化及恶变永生化及恶变永生化及恶变vv体外培养的正常细胞的两个主要特征：二倍体核型，增殖生长期有限体外培养的

35、正常细胞的两个主要特征：二倍体核型，增殖生长期有限 vv细胞永生化也称不死性，而恶性细胞不仅能长期增殖生长并有异体接种致细胞永生化也称不死性，而恶性细胞不仅能长期增殖生长并有异体接种致瘤性瘤性 n nn细胞型别细胞型别细胞型别细胞型别细胞型别细胞型别vv女性的一条女性的一条XX染色体在间期呈明显的异固缩状态，呈三角形或半月状小体紧染色体在间期呈明显的异固缩状态，呈三角形或半月状小体紧附在核膜内面，称巴氏小体；男性附在核膜内面，称巴氏小体；男性YY染色体在间期则形成颗粒状染色体在间期则形成颗粒状YY小体，位小体，位于胞核的近中央部位。用特殊染色法可显现出巴氏体和于胞核的近中央部位。用特殊染色法可

36、显现出巴氏体和YY小体。小体。 43 8. 细胞间、细胞与基质间的关系细胞间、细胞与基质间的关系 n在体外培养系统中，在一定条件下，单个细胞也能生在体外培养系统中，在一定条件下，单个细胞也能生和增殖生长，表现有很大的独立性。和增殖生长，表现有很大的独立性。n一个有活力的细胞中须经过繁殖形成群体，只有群体一个有活力的细胞中须经过繁殖形成群体，只有群体细胞才是培养细胞的基本存在形式。细胞才是培养细胞的基本存在形式。v在生理活动上，群体细胞生存力强，细胞量多时比少时易于培在生理活动上，群体细胞生存力强，细胞量多时比少时易于培养，说明细胞之间能相互沟通信息。养，说明细胞之间能相互沟通信息。44二、细胞

37、生存条件及代谢二、细胞生存条件及代谢45无污染环境无污染环境n培养环境无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件。培养环境无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件。n细胞被置于体外培养后，失去了对微生物和有毒物质细胞被置于体外培养后，失去了对微生物和有毒物质的防御能力，一旦被污染或自身代谢物积累等，可导的防御能力，一旦被污染或自身代谢物积累等，可导致细胞死亡。致细胞死亡。（一）基本条件（一）基本条件46 适宜温度适宜温度n人体细胞的适宜温度为人体细胞的适宜温度为36.536.5+ +0.50.5，偏离这一温度范围，细胞的正常代，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。谢会受到影响，甚至

38、死亡。n培养细胞对低温的耐受力比对高温强。培养细胞对低温的耐受力比对高温强。v温度不低于0时，对细胞代谢虽有影响，但并无伤害作用；v对培养液中加一定量的保护剂（甘油或二甲基亚砜），封入安瓿中，冻存于液氮中，能长期储存，解冻后细胞复苏，仍能继续增殖生长，细胞生物性状不受任何影响，成为保存细胞最主要的手段。温度对细胞生长的影响温度对细胞生长的影响47 气体和气体和pH值值nO2参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长、增殖和参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。多数细胞缺氧不能生存。合成各种所需成分。多数细胞缺氧不能生存。n开放培养时（碟皿或培养瓶松盖培养），一般要把细开放培养

39、时（碟皿或培养瓶松盖培养），一般要把细胞置于胞置于95%的空气加的空气加5%CO2混合气体环境中。混合气体环境中。CO2既既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，主要作用在于是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，主要作用在于能维持培养基的能维持培养基的pH值。大多数细胞要求值。大多数细胞要求7.2-7.4。CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3-48 nCO2影响培养基的作用在于：影响培养基的作用在于：v为维持培养液的恒定为维持培养液的恒定pH值，最常用为加磷酸缓冲液的方法。值，最常用为加磷酸缓冲液的方法。其中的其中的NaHCO3能供给能供给CO2，但但CO2易于逸出，故只适用于封闭式易于逸

40、出，故只适用于封闭式培养。常用培养。常用Hanks平衡盐溶液中含有低浓度的平衡盐溶液中含有低浓度的NaHCO3，当打开含当打开含有有Hanks液培养瓶时，则液培养瓶时，则CO2迅速逸出而导致酚红指示剂变红，迅速逸出而导致酚红指示剂变红，表明培养液变碱。细胞在碱性环境中时间过长可使细胞碱中毒；表明培养液变碱。细胞在碱性环境中时间过长可使细胞碱中毒；因此开放式培养时，需放在含有因此开放式培养时，需放在含有5%CO2的气体环境中培养。的气体环境中培养。也可用羟乙基哌嗪乙硫磺酸也可用羟乙基哌嗪乙硫磺酸HEPES，它对细胞无毒性，也不它对细胞无毒性，也不起缓冲作用，主要防止起缓冲作用，主要防止pHpH值

41、的迅速变动，其最大的优点是在开值的迅速变动，其最大的优点是在开瓶通气培养或活细胞观察时能维持较恒定的瓶通气培养或活细胞观察时能维持较恒定的pHpH值。值。 49 营养物质营养物质n糖、无机盐糖、无机盐n氨基酸、维生素氨基酸、维生素n促细胞生长因子促细胞生长因子v血清是提供生长因子和细胞所需物质的来源渗透压渗透压n离子强度：离子强度：260-320 mOsm/Kg 人工培养基人工培养基 50 人工培养基人工培养基人工培养基人工培养基nn按物质形态分为：液体及半固体培养基（软琼脂按物质形态分为：液体及半固体培养基（软琼脂按物质形态分为：液体及半固体培养基（软琼脂按物质形态分为：液体及半固体培养基（

42、软琼脂-）nn按来源分：按来源分：按来源分：按来源分：vvv合成培养基合成培养基合成培养基合成培养基合成培养基合成培养基 synthetic mediumsynthetic mediumsynthetic mediumsynthetic mediumsynthetic mediumsynthetic mediumnn根据已知细胞所需物质的种类和数量严格配置而成的。根据已知细胞所需物质的种类和数量严格配置而成的。vvv天然培养基天然培养基天然培养基天然培养基天然培养基天然培养基 natural mediumnatural mediumnatural mediumnatural mediumnat

43、ural mediumnatural mediumnn仍需加入一些天然成分如人或动物的血清、血浆和胎汁等，否则细胞仍不能仍需加入一些天然成分如人或动物的血清、血浆和胎汁等，否则细胞仍不能很好生长繁殖，当前主要使用血清，其中以牛血清为主。血清中有多种促细很好生长繁殖，当前主要使用血清，其中以牛血清为主。血清中有多种促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质等。胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质等。nn细胞培养在合成培养基中，不能很好生长增殖；当加入细胞培养在合成培养基中，不能很好生长增殖；当加入5%5%血清时，大多数细血清时，大多数细胞能维持细胞不死和缓慢生长。一般需加胞能维持细胞不死和缓慢生长

44、。一般需加10-20%10-20%的血清，细胞才能顺利增殖的血清，细胞才能顺利增殖生长。生长。nn但是添加血清后不明成分增多，对分析实验结果增加了困难。但是添加血清后不明成分增多，对分析实验结果增加了困难。vvv无血清培养基无血清培养基无血清培养基无血清培养基无血清培养基无血清培养基 51附着物附着物附着物附着物nn玻璃玻璃玻璃玻璃vv透明、便于观察、易洗涤和能反复使用等优点，中性玻璃最好，适合透明、便于观察、易洗涤和能反复使用等优点，中性玻璃最好，适合各种细胞附着生长。缺点为易碎。各种细胞附着生长。缺点为易碎。nn聚苯乙烯聚苯乙烯聚苯乙烯聚苯乙烯vv疏水性，光洁平坦，用于培养正常细胞、无限细

45、胞系、转化细胞和肿疏水性，光洁平坦，用于培养正常细胞、无限细胞系、转化细胞和肿瘤细胞生长均可。瘤细胞生长均可。nn微载体微载体微载体微载体vv聚苯乙烯和聚丙烯酰胺制成的小球体聚苯乙烯和聚丙烯酰胺制成的小球体 凡对细胞无毒性的物质都可用作底物，不同细胞对底物要求各异。凡对细胞无毒性的物质都可用作底物，不同细胞对底物要求各异。52（二）体外培养成功率分析（二）体外培养成功率分析v 关键在初代培养关键在初代培养v “ “培养成功培养成功”的定义：的定义： 不论用细胞消化分散法或组织块培养法进行培养时，不论用细胞消化分散法或组织块培养法进行培养时，培养物必须能贴附在底物上，继而细胞才能发生运动、培养物

46、必须能贴附在底物上，继而细胞才能发生运动、生长增殖、细胞数量增多生长增殖、细胞数量增多 扩大再培养扩大再培养53供体条件供体条件培养条件培养条件n不同细胞选用相应的培养基不同细胞选用相应的培养基贴附底物贴附底物n贴附使细胞增殖生长的条件。尤其对初代培养更重要贴附使细胞增殖生长的条件。尤其对初代培养更重要 培养方法培养方法v选择适宜的消化法和培养法选择适宜的消化法和培养法 54三、细胞系或细胞株的建立三、细胞系或细胞株的建立 各种已被命名和经过细胞生物学鉴定的细胞系或细各种已被命名和经过细胞生物学鉴定的细胞系或细各种已被命名和经过细胞生物学鉴定的细胞系或细各种已被命名和经过细胞生物学鉴定的细胞系

47、或细胞株，都是一些形态比较均一、生长增殖比较稳定的和胞株，都是一些形态比较均一、生长增殖比较稳定的和胞株，都是一些形态比较均一、生长增殖比较稳定的和胞株，都是一些形态比较均一、生长增殖比较稳定的和生物性状清楚的细胞群。生物性状清楚的细胞群。生物性状清楚的细胞群。生物性状清楚的细胞群。55初代培养细胞（原代）初代培养细胞（原代）初代培养细胞（原代）初代培养细胞（原代）n直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。传代细胞系：传代细胞系：传代细胞系：传代细胞系：n初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。初代培养物开始第一

48、次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。n如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系；已获无限繁殖能如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称无限细胞系（多发生异倍化，具异倍力能持续生存的细胞系，称无限细胞系（多发生异倍化，具异倍体核型，永生性，有些仍保留接触抑制和无异体接种致瘤性）体核型，永生性，有些仍保留接触抑制和无异体接种致瘤性） （一）培养细胞的种类及命名（一）培养细胞的种类及命名56克隆细胞株克隆细胞株克隆细胞株克隆细胞株n从一个经过生物学鉴定地细胞系用单细胞分离培养获通过筛选的从一个经过生物学鉴定地细胞系用单细胞分离培养获通过筛选的方法，由单细胞增殖

49、形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原细胞株性状不同的细胞群，称亚株一步分离培养出与原细胞株性状不同的细胞群，称亚株 subunit二倍体细胞二倍体细胞二倍体细胞二倍体细胞n细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同的细胞群。属有限细胞系，寿命长短各异，人胚肺成纤维细胞同的细胞群。属有限细胞系，寿命长短各异，人胚肺成纤维细胞可传可传50+10代，人胚肾只有代，人胚肾只有8-10代。代。n为保持二倍体细胞能长期被利用，一般在初代或为保持二倍体细胞能长期

50、被利用，一般在初代或2-5代即大量冻存代即大量冻存作为原种作为原种，用时再进行繁殖，用后再继续冻存，可供长期使用和用时再进行繁殖，用后再继续冻存，可供长期使用和延缓细胞的衰老。延缓细胞的衰老。57遗传缺陷细胞遗传缺陷细胞遗传缺陷细胞遗传缺陷细胞n从先天缺陷者取材培养的细胞从先天缺陷者取材培养的细胞n先天或人工诱变（先天或人工诱变（2n或异倍）或异倍）肿瘤细胞系（株）肿瘤细胞系（株）肿瘤细胞系（株）肿瘤细胞系（株）n现有细胞系中最多的一类，多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，现有细胞系中最多的一类，多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性；和异体接种致瘤性。常已传几十代或

51、百代以上，并具有不死性；和异体接种致瘤性。n n举例：举例：举例：举例：vHeLa 供体患者姓名vCHO 中国地鼠卵巢细胞 vNIH3T3 美国国立卫生院建立v宫-743： 宫颈癌上皮细胞 58记录要求：记录要求：n组织来源、细胞生物学检测、培养条件和方法组织来源、细胞生物学检测、培养条件和方法鉴定、管理和使用鉴定、管理和使用n按国际惯例，在杂志或刊物上报道，详细介绍上述各项目即可。按国际惯例，在杂志或刊物上报道，详细介绍上述各项目即可。n各国管理中心、细胞库各国管理中心、细胞库vv美国标准细胞库美国标准细胞库美国标准细胞库美国标准细胞库ATCCATCCATCCATCC、人遗传突变细胞库人遗传

52、突变细胞库HGMRHGMR、细胞衰老细胞库细胞衰老细胞库CARCAR（二）细胞株建立要求及管理（二）细胞株建立要求及管理59ATCC入库细胞要求检测项目（基本要求）：入库细胞要求检测项目（基本要求）： 培养简历：培养简历：组织来源日期、物种、供体情况、细胞传代情况等冻存液：冻存液：培养基和防冻液名称细胞活力：细胞活力：融解前后细胞接种存活率和生长特性培养液：培养液：培养基种类和名称、血清来源和含量细胞形态：细胞形态：类型核型：核型：二倍体或多倍体，标记染色体的有无无误染测验：无误染测验：包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等物种鉴定：物种鉴定：检测同工酶，主要为G6PD和LDH，以证明细胞有否交

53、叉污染免疫检测：免疫检测：一两种血清学检测细胞建立者：细胞建立者：建立者姓名；检测者姓名60组织培养技术的应用组织培养技术的应用组织培养技术的应用组织培养技术的应用 组织培养技术组织培养技术 第二章第二章 61一、病毒学研究的应用一、病毒学研究的应用检测病毒检测病毒n病毒的增殖，分离病原体的重要手段，还为研究病毒病毒的增殖，分离病原体的重要手段，还为研究病毒的亲细胞性和亲组织性提供了非常方便的方法。的亲细胞性和亲组织性提供了非常方便的方法。v增殖指标：增殖指标：CPECPE、PhPh变化、包涵体等变化、包涵体等n病毒定量：病毒定量：PFU、TCID50n病毒和细胞间关系病毒和细胞间关系v致病机

54、理致病机理 病毒性感染的血清学诊断病毒性感染的血清学诊断肿瘤病毒致癌机理的研究（肿瘤病毒致癌机理的研究（转化）转化）62病病 毒毒 检验检验方方 法法 病毒培养养 全程5-30天病毒培病毒培病毒培病毒培养养养养：1.1.1.1.细细细细胞培胞培胞培胞培养养养养2.2.2.2.接接接接种种种种至至至至细细细细胞胞胞胞细细细细胞病胞病胞病胞病变判定变判定变判定变判定荧荧荧荧光染色：光染色：光染色：光染色：1. 1. 1. 1. 病毒病毒病毒病毒涂涂涂涂片片片片2. 2. 2. 2. 血清型血清型血清型血清型专专专专一一一一 抗抗抗抗体荧体荧体荧体荧光染色光染色光染色光染色中和中和中和中和试验试验试

55、验试验：培培培培养养养养出出出出的的的的病毒病毒病毒病毒与与与与血血血血清型清型清型清型专专专专一性抗血清一性抗血清一性抗血清一性抗血清作用，再接作用，再接作用，再接作用，再接种种种种至至至至细细细细胞胞胞胞63用培养方法研究病毒学的优点：用培养方法研究病毒学的优点：用培养方法研究病毒学的优点：用培养方法研究病毒学的优点： 没有隐性感染，避免体内实验的假阳性或假阴性结果。没有隐性感染，避免体内实验的假阳性或假阴性结果。 没有免疫抵抗力没有免疫抵抗力 可选出培养方法可以选择出最易感的细胞进行研究可选出培养方法可以选择出最易感的细胞进行研究 可增加接种量可增加接种量 获取减毒株或无毒株较其他方法容

56、易获取减毒株或无毒株较其他方法容易 大规模植被病毒疫苗，可提高产量，降低成本，还可以是大规模植被病毒疫苗，可提高产量，降低成本，还可以是培养液中的异性蛋白减低至最低限度培养液中的异性蛋白减低至最低限度, ,提高疫苗质量。提高疫苗质量。 可快速分离鉴定病毒可快速分离鉴定病毒 6465二、免疫学研究的应用二、免疫学研究的应用 免疫细胞检测免疫细胞检测nT T、B B淋巴细胞分离培养技术淋巴细胞分离培养技术n淋巴细胞转化试验淋巴细胞转化试验n混合淋巴细胞培养混合淋巴细胞培养n抗体产生细胞检测抗体产生细胞检测66 杂交瘤细胞培养技术杂交瘤细胞培养技术 目前，已能够利用大规模培养技目前，已能够利用大规模

57、培养技术培养杂交瘤细胞生产抗体、不术培养杂交瘤细胞生产抗体、不仅可以提高产量、简化工艺、降仅可以提高产量、简化工艺、降低成本，而且可以提高抗体质量。低成本，而且可以提高抗体质量。67HybridomasHybridomas杂交瘤技术杂交瘤技术杂交瘤技术杂交瘤技术68单克隆抗体制备单克隆抗体制备单克隆抗体制备单克隆抗体制备流程：流程：流程：流程：流程：流程：用特异抗原免疫实验动物用特异抗原免疫实验动物取含大量取含大量BB细胞的脾细胞细胞的脾细胞 鼠骨髓瘤细胞鼠骨髓瘤细胞 细胞融合细胞融合 筛选杂交瘤细胞筛选杂交瘤细胞 生产单克隆抗体生产单克隆抗体69杂交交瘤瘤细胞胞产生生 单克克隆隆抗抗体体示示

58、意意图70细胞因子检测技术细胞因子检测技术免疫酶技术免疫酶技术71三、分子生物学研究的应用三、分子生物学研究的应用1. 体外培养细胞的转化体外培养细胞的转化n细胞自发转化和人工诱发转化细胞自发转化和人工诱发转化vBHK-21, NIH/3T3, Rat-1, PC-12BHK-21, NIH/3T3, Rat-1, PC-12722. DNA转导技术转导技术基因转基因转导细胞导细胞染色体转导染色体转导基因转导基因转导细胞融合、显微注射细胞融合、显微注射染色体转导染色体转导基因转染（体细胞）基因转染（体细胞）转基因（生殖细胞）转基因（生殖细胞）磷酸钙、电击、脂质体、磷酸钙、电击、脂质体、逆转录病

59、毒介导法、逆转录病毒介导法、其他其他DEAE-葡聚糖法葡聚糖法个体发育、检测目的基因个体发育、检测目的基因表达（转基因技术表达（转基因技术）733. 基因诊断和基因治疗基因诊断和基因治疗1.1.原位修复有缺陷的基因原位修复有缺陷的基因2.2.基因替代疗法基因替代疗法3.3.重新开放已关闭的基因重新开放已关闭的基因4.4.导入基因（导入基因（p53 ,RBp53 ,RB）5.5.封闭基因封闭基因 （反义（反义RNARNA）74四、遗传学研究的应用四、遗传学研究的应用性染色体的检测性染色体的检测n间期细胞核内女性间期细胞核内女性X染色体和男性染色体和男性Y染色体均可用特殊染色体均可用特殊染色法显示

60、出来，女性的两个染色法显示出来，女性的两个X染色体中的一个，在间染色体中的一个，在间其时的染色质呈异固缩，呈深染的小体称巴氏小体，其时的染色质呈异固缩，呈深染的小体称巴氏小体，位于间期细胞核内面，呈三角形或半月形小体易为炭位于间期细胞核内面，呈三角形或半月形小体易为炭酸复红或硫堇等染料着色。正常女性巴氏体阳性酸复红或硫堇等染料着色。正常女性巴氏体阳性,男性男性为阴性。男性为阴性。男性Y染色质位于间期细胞核近中央部，荧光染色质位于间期细胞核近中央部，荧光染色发较强荧光，呈点状小体，发光部分为染色发较强荧光，呈点状小体，发光部分为Y染色体异染色体异固缩的长臂。固缩的长臂。n初代培养细胞和二倍体细胞

61、株均可观察到性染色质，初代培养细胞和二倍体细胞株均可观察到性染色质，传代细胞系表现不规律。传代细胞系表现不规律。75培养细胞染色体显示培养细胞染色体显示n n显示染色体主要是显示分裂中期细胞。因细胞分裂出于显示染色体主要是显示分裂中期细胞。因细胞分裂出于显示染色体主要是显示分裂中期细胞。因细胞分裂出于显示染色体主要是显示分裂中期细胞。因细胞分裂出于中期时，染色体的长短和大小适合，是研究染色体的最中期时，染色体的长短和大小适合，是研究染色体的最中期时，染色体的长短和大小适合，是研究染色体的最中期时，染色体的长短和大小适合，是研究染色体的最好阶段。好阶段。好阶段。好阶段。n n准备工作的原则：准备

62、工作的原则：准备工作的原则：准备工作的原则：vv获得多量的中期分裂相获得多量的中期分裂相获得多量的中期分裂相获得多量的中期分裂相vv分散密集并相互缠绕的分散密集并相互缠绕的分散密集并相互缠绕的分散密集并相互缠绕的46464646条染色体条染色体条染色体条染色体76 n n措施：措施：措施：措施：vv提高提高提高提高细胞分裂相数细胞分裂相数n刺激细胞增殖：PHAn阻抑中期分裂：秋水仙素vv促染色体分散措施促染色体分散措施促染色体分散措施促染色体分散措施n低渗处理：低渗盐溶液n醋酸固定：膨胀固定组织细胞，和醇类混合固定有利于染色体松散效应。77染色体结构显带和检测染色体结构显带和检测n n染色体显

63、带、染色体脆性部位的检测、微核检测染色体显带、染色体脆性部位的检测、微核检测染色体显带、染色体脆性部位的检测、微核检测染色体显带、染色体脆性部位的检测、微核检测染色体基因定位染色体基因定位n n核素标记原位杂交基因定位技术核素标记原位杂交基因定位技术核素标记原位杂交基因定位技术核素标记原位杂交基因定位技术n n荧光标记原位杂交基因定位技术荧光标记原位杂交基因定位技术荧光标记原位杂交基因定位技术荧光标记原位杂交基因定位技术 染色体显微切割法染色体显微切割法 78五、五、 药理学研究的应用药理学研究的应用体外细胞培养测定药效研究的优点：体外细胞培养测定药效研究的优点：体外细胞培养测定药效研究的优点

64、：体外细胞培养测定药效研究的优点：n n已建的细胞系（株）提供大量的遗传特性均一或相似已建的细胞系（株）提供大量的遗传特性均一或相似已建的细胞系（株）提供大量的遗传特性均一或相似已建的细胞系（株）提供大量的遗传特性均一或相似的细胞来源，使药物筛选研究工作稳定、方便、经济。的细胞来源，使药物筛选研究工作稳定、方便、经济。的细胞来源，使药物筛选研究工作稳定、方便、经济。的细胞来源，使药物筛选研究工作稳定、方便、经济。n n可准确控制药物作用的对象、作用时间和剂量以及细可准确控制药物作用的对象、作用时间和剂量以及细可准确控制药物作用的对象、作用时间和剂量以及细可准确控制药物作用的对象、作用时间和剂量

65、以及细胞的生长条件。胞的生长条件。胞的生长条件。胞的生长条件。n n将待检测药物或其他化合物直接加到培养系统中，使将待检测药物或其他化合物直接加到培养系统中，使将待检测药物或其他化合物直接加到培养系统中，使将待检测药物或其他化合物直接加到培养系统中，使之直接与效应细胞相接触。之直接与效应细胞相接触。之直接与效应细胞相接触。之直接与效应细胞相接触。79 不足：不足：n n体外检测的细胞生长环境简单而体内复杂体外检测的细胞生长环境简单而体内复杂体外检测的细胞生长环境简单而体内复杂体外检测的细胞生长环境简单而体内复杂n n进行活性检测时，比较容易和适宜于单质药物，水溶进行活性检测时，比较容易和适宜于

66、单质药物，水溶进行活性检测时，比较容易和适宜于单质药物，水溶进行活性检测时，比较容易和适宜于单质药物，水溶性药物较容易。性药物较容易。性药物较容易。性药物较容易。80适用范围：适用范围： n较适宜于研究抗癌药物和能够致畸、致癌、致突变的较适宜于研究抗癌药物和能够致畸、致癌、致突变的化合物。及抗病毒药物化合物。及抗病毒药物细胞选择细胞选择n选择适当的效应细胞和对照细胞选择适当的效应细胞和对照细胞n结果观察：结果观察：形态学观察、细胞生物学检测、生物化学测定、分子生物学检测以及细胞死亡评价等方面。药效测定法药效测定法n抗病毒药效测定抗病毒药效测定n抗癌药效测定抗癌药效测定 81六、组织胚胎与细胞生

67、物学的应用六、组织胚胎与细胞生物学的应用器官培养与发育分化研究器官培养与发育分化研究体外培养整个胚胎的生长发育体外培养整个胚胎的生长发育胚胎致畸作用的研究胚胎致畸作用的研究器官的功能及其代谢的研究器官的功能及其代谢的研究器官移植中的应用器官移植中的应用器官细胞的体外培养器官细胞的体外培养n胚胎干细胞的体外培养胚胎干细胞的体外培养n造血干细胞的体外培养造血干细胞的体外培养n其他器官细胞的体外培养其他器官细胞的体外培养82 细胞生物学上的应用：细胞生物学上的应用：n n细胞形态学：细胞形态学：细胞形态学：细胞形态学：借助体外培养技术尤其是通过与显微缩借助体外培养技术尤其是通过与显微缩时电影技术结合

68、，观察到许多细胞生长行为。时电影技术结合，观察到许多细胞生长行为。n细胞生理方面：确定了培养细胞的营养需求，建立了细胞生理方面：确定了培养细胞的营养需求，建立了培养基的合理配方；细胞代谢研究；从条件培养液中培养基的合理配方；细胞代谢研究；从条件培养液中收集细胞分泌产物用于生产实践；收集细胞分泌产物用于生产实践；n细胞遗传学：利用培养的细胞进行染色体分析及其他细胞遗传学：利用培养的细胞进行染色体分析及其他分子生物学研究是一种常见的方法，借此实现对细胞分子生物学研究是一种常见的方法，借此实现对细胞遗传基础的分析和改造；研究细胞周期及其调控因素遗传基础的分析和改造；研究细胞周期及其调控因素和过程。和

69、过程。83七、肿瘤学的应用七、肿瘤学的应用 肿瘤细胞生物特性学研究肿瘤细胞生物特性学研究n比较肿瘤细胞与正常细胞在体外培养条件下生长比较肿瘤细胞与正常细胞在体外培养条件下生长行为的差异，研究肿瘤细胞生物学特性的改变，行为的差异，研究肿瘤细胞生物学特性的改变，对于建立诊断标准有益。对于建立诊断标准有益。 v肿瘤细胞体外生长形态学研究肿瘤细胞体外生长形态学研究v 肿瘤细胞生长特性肿瘤细胞生长特性v 细胞接触抑制实验细胞接触抑制实验84 肿瘤发病机制研究肿瘤发病机制研究n肿瘤产生诱发因素的研究肿瘤产生诱发因素的研究n肿瘤细胞侵润机制和过程的研究肿瘤细胞侵润机制和过程的研究 肿瘤于正常细胞肿瘤于正常细

70、胞 共同培养法共同培养法 n研究肿瘤药物筛选研究肿瘤药物筛选85 异种移植研究异种移植研究v裸鼠发现与应用裸鼠发现与应用v建立了动物移植瘤模型建立了动物移植瘤模型抗肿瘤药物筛选抗肿瘤药物筛选v研究肿瘤细胞调亡以及肿瘤细胞体外分化又成为新热点研究肿瘤细胞调亡以及肿瘤细胞体外分化又成为新热点 86八、八、 毒理学研究的应用毒理学研究的应用化学物质对细胞毒性作用化学物质对细胞毒性作用n形态、存活率、增殖情况、形态、存活率、增殖情况、DNA合成合成染色体异常测定染色体异常测定n细胞培养细胞培养-加药加药-培养培养24小时小时-秋水仙素秋水仙素-观察染色体观察染色体突变实验突变实验n利用嘌呤类似物选择突变细胞的实验（利用嘌呤类似物选择突变细胞的实验（HGPRT）87 生物治疗生物治疗n活细胞活细胞-体细胞体细胞-体内体内n活化细胞（活化细胞（LAK）-患者患者n组织组织-悬液悬液-培养培养-回输机体回输机体88生物化制造生物化制造 _ _2121世纪的技术世纪的技术Biomanufacturing Skills for the 21st Century89This is the end! This is the end of this electiveThis is the end of this elective90