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1、微生物代谢调节与微生物代谢调节与代谢工程代谢工程n n发酵是具有生物属性的，以微生物为手段的生产方式n n生物的利己性n n生物的经济性n n什么叫代谢？（分解与合成）n n微生物的代谢有何特别之处？n n微生物细胞能为其自身提供代谢能微生物细胞能为其自身提供代谢能n n 微生物细胞的生存方式与动物、植物等高等生物的细胞不同，微生物细胞能独立存在，自主生活。可塑性强，细胞水平的代谢调节能力代谢调节能力超过高等生物。（高效，适应，可变）n n生化反应途径，代谢途径与代谢网络生化反应途径，代谢途径与代谢网络 一系列按序进行的生物化学反应构成生化反应途径；若这条途径在活细胞里运行，则为代谢途径代谢途
2、径。n n 代谢途径与跨膜输送系统按代谢规律汇成（物质）代谢网络代谢网络。1. 1. 起始段，起始段，2. 2. 向心段，向心段，3. 3. 中心段，中心段，4. 4. 离心段，离心段，5. 5. 完成段完成段 微微 生生 物物 代代 谢谢 的的 五五 段段 式式胞外降解胞外降解及跨膜步及跨膜步骤骤向向心心途途径径中心（代谢）途径中心（代谢）途径离离心心途途径径跨膜步骤跨膜步骤和胞外修和胞外修饰饰n n微生物的代谢网络的“断网”与“联网”问题。n n代谢网络的联网问题代谢网络的联网问题代谢网络的联网问题代谢网络的联网问题 代谢中间化合物都在代谢网络上，有些有机化代谢中间化合物都在代谢网络上，有
3、些有机化合物虽然不在代谢网络上但仍有可能与代谢网络合物虽然不在代谢网络上但仍有可能与代谢网络“ “联网联网” ”。所谓。所谓“ “联网联网” ”就是用化学或生物化学反应就是用化学或生物化学反应把指定的化合物连接到代谢网络上去，从而使它与把指定的化合物连接到代谢网络上去，从而使它与微生物的代谢建立联系。微生物的代谢建立联系。“ “联网联网” ”可以用化学或生可以用化学或生物学方法（物学方法（ 含含DNADNA重组技术重组技术 ）来实现。）来实现。 广义的广义的 “ “联网联网” ” 包含代谢网络细节不同的生命有机体之包含代谢网络细节不同的生命有机体之间接力赛式的代谢联系。已在间接力赛式的代谢联系
4、。已在“ “网网” ” 上或者可以上或者可以“ “联网联网” ” 的化合物都可能被开发为工业发酵的产的化合物都可能被开发为工业发酵的产物或原料。物或原料。n n三羧酸循环的中间产物是许多物质合成的前体 n n什么叫代谢流？n n由于微生物代谢网络所带来的代谢主流多向性和选择性问题。n n代谢流和碳架物质流代谢流和碳架物质流 代谢物在代谢网络中流动形成代谢流。广义的代谢流还包括能量流和信息流。在代谢分析和代谢工程中，代谢流往往首先是指有机物流（碳架物质流）。有机物流（碳架物质流）。n n代谢主流代谢主流 在一定的培养条件下，代谢物在代谢网在一定的培养条件下，代谢物在代谢网络中流动，流量相对集中的
5、代谢流叫做络中流动，流量相对集中的代谢流叫做该该培养条件下培养条件下的代谢主流。代谢主流的流量的代谢主流。代谢主流的流量测定是代谢工程的重要组成部分。测定是代谢工程的重要组成部分。n n代谢主流的变动性和选择性代谢主流的变动性和选择性 微生物的代谢主流的方向、流量甚至所流经的途径都可能发生变化。这就是微生物代谢主流的变动性变动性和代谢主流对代谢网络中的途径的选择性选择性。这种变动和选择的根据在微生物细胞的遗传物质，微生物所处的环境条件的变化。n n理想载流路径理想载流路径 为了提高产物对原料的转化率， 就要求代谢主流（根据代谢分析的结果）经设定的载流路径流到目的产物。因为这样的载流路径是带有主
6、观导向性的虚拟的载流途径，所以把它们叫做理想载流路径。n n代谢工程（定义）：代谢工程（定义）： 在对代谢流及其控制进行定量分析的基础上，提出精确的遗传修饰方案并借助分子生物学技术付诸实施。如此按部就班反复进行实践，从代谢的整体上改善细胞的性能和应用前景。工业发酵的五字策略的示意图NPP进进出出通通节节堵堵n n这五个字的含义分别是：这五个字的含义分别是：这五个字的含义分别是：这五个字的含义分别是：进：促进细胞对碳源等营养物质的吸收；进：促进细胞对碳源等营养物质的吸收；通：使来自上游和各个注入分支的碳架物质通：使来自上游和各个注入分支的碳架物质 能畅通地流向目的产物；能畅通地流向目的产物；节：
7、阻塞与目的产物的形成无关或关系不大节：阻塞与目的产物的形成无关或关系不大 的代谢支流，使碳架物质相对集中地流的代谢支流，使碳架物质相对集中地流 向目的产物；向目的产物；堵：消除或削弱目的产物进一步代谢的途径；堵：消除或削弱目的产物进一步代谢的途径；出：促进目的产物向胞外空间分泌。出：促进目的产物向胞外空间分泌。 微生物自身的代谢调节，往往不利于人微生物自身的代谢调节，往往不利于人类的工业生产。因此，人们通过改变微生类的工业生产。因此，人们通过改变微生物遗传特性、控制生产过程中的各种条件物遗传特性、控制生产过程中的各种条件等措施来实现对微生物代谢调节的人工控等措施来实现对微生物代谢调节的人工控制
8、，使微生物能最大限度地积累对人类有制，使微生物能最大限度地积累对人类有用的代谢产物。用的代谢产物。微生物代谢调节的机制微生物代谢调节的机制n n酶合成的调节：诱导与反馈阻遏n n酶活性的调节：激活与反馈抑制（变构调节）酶合成的调节酶合成的调节酶合成的调节酶合成的调节酶活性的调节酶活性的调节酶活性的调节酶活性的调节不不不不同同同同点点点点调节调节调节调节对象对象对象对象通过酶量的变化控通过酶量的变化控通过酶量的变化控通过酶量的变化控制代谢速率制代谢速率制代谢速率制代谢速率控制酶活性，不涉及酶量控制酶活性，不涉及酶量控制酶活性，不涉及酶量控制酶活性，不涉及酶量变化变化变化变化调节效果调节效果调节效
9、果调节效果相对缓慢相对缓慢相对缓慢相对缓慢快速、精细快速、精细快速、精细快速、精细调节调节调节调节机制机制机制机制基因水平调节，调基因水平调节，调基因水平调节，调基因水平调节，调节控制酶合成节控制酶合成节控制酶合成节控制酶合成代谢调节，它调节酶活性代谢调节，它调节酶活性代谢调节，它调节酶活性代谢调节，它调节酶活性相同点相同点相同点相同点细胞内两种方式同时存在，密切配合，高效、准确控制代谢的细胞内两种方式同时存在，密切配合，高效、准确控制代谢的细胞内两种方式同时存在，密切配合，高效、准确控制代谢的细胞内两种方式同时存在，密切配合，高效、准确控制代谢的正常进行。正常进行。正常进行。正常进行。微生物
10、细胞内的酶可分为组成酶和诱导酶 组成酶 微生物有些酶总是适量地存在,它们是不依赖于酶底物或底物的结构类似物的存在而合成的酶,如葡萄糖转化为丙酮酸过程中的各种酶。 诱导酶 适应性酶,是依赖于某种底物或底物的结构类似物的存在而合成的酶。诱导酶合成的基因以隐性状态存在于染色体中。n n操纵子学说：操纵子学说：基因表达和控制的一个完整单元，其中包括结构基因，调节基因，操作基因和启动基因。n n诱导型操纵子：效应物存在导致基因表达。诱导型操纵子：效应物存在导致基因表达。n n阻遏型操纵子：效应物存在导致基因表达的阻遏型操纵子：效应物存在导致基因表达的关闭。关闭。代谢的分类代谢的分类n n分解代谢分解代谢
11、（异化作用）n n合成代谢合成代谢（同化作用）初级代谢和次级代谢初级代谢和次级代谢 初级代谢：与生物生存有关的，涉及能量产生初级代谢：与生物生存有关的，涉及能量产生和能量消耗的代谢类型。产物都是有机体生存必和能量消耗的代谢类型。产物都是有机体生存必不可少的物质，如单糖、核苷酸、脂肪酸，以及不可少的物质，如单糖、核苷酸、脂肪酸，以及蛋白质、核酸、多糖、脂类等。蛋白质、核酸、多糖、脂类等。 次级代谢：次级代谢：是指微生物生长到一定阶段才产生是指微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该微生物本身无明显生的化学结构十分复杂、对该微生物本身无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖所必需的物理功
12、能，或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质。但质。但有利于生存的代谢类型，通常是在生长后有利于生存的代谢类型，通常是在生长后期产生。产物种类很多，最著名的是抗生素。期产生。产物种类很多，最著名的是抗生素。产生产生产生产生功能功能功能功能例子例子例子例子存在存在存在存在部位部位部位部位不同微生不同微生不同微生不同微生物比较物比较物比较物比较初级代谢初级代谢初级代谢初级代谢产物产物产物产物不停不停不停不停地合地合地合地合成成成成生长和生长和生长和生长和繁殖的繁殖的繁殖的繁殖的必需物必需物必需物必需物质质质质氨基酸、氨基酸、氨基酸、氨基酸、核苷酸、核苷酸、核苷酸、核苷酸、多糖、脂多糖、脂多糖、脂多糖、
13、脂类、维生类、维生类、维生类、维生素素素素细胞内细胞内细胞内细胞内基本相同基本相同基本相同基本相同 次级代谢次级代谢次级代谢次级代谢产物产物产物产物一定一定一定一定阶段阶段阶段阶段才合才合才合才合成成成成生长和生长和生长和生长和繁殖的繁殖的繁殖的繁殖的非必需非必需非必需非必需物质物质物质物质抗生素、抗生素、抗生素、抗生素、毒素、激毒素、激毒素、激毒素、激素、色素素、色素素、色素素、色素细胞内细胞内细胞内细胞内或外环或外环或外环或外环境中境中境中境中不相同不相同不相同不相同 次级代谢与初级代谢的关系 1.从代谢方面分析：许多次级代谢产物的基本结构是由少数几种初级代谢产物构成的，所以次级产物是以初
14、级产物为母体衍生出来的，次级代谢途径并不是独立的，而是与初级代谢途径有密切联系的。 某些糖代谢的中间体，即可以来合成初级代谢产物，又可以来合成次级代谢产物，这种中间体叫分叉中间体分叉中间体，如丙二酰Co。G 乙酰 Co 丙二酰 CoA 脂肪酸（初级） 四环素或其他抗生素（次级） 初级代谢和次级代谢的分叉中间体初级代谢和次级代谢的分叉中间体分叉中间体初级终点产物次级终点产物分叉中间体初级终点产物次级终点产物氨基己二糖氨基己二糖 赖氨酸赖氨酸 青霉素青霉素, ,头孢酶素头孢酶素丙二酰丙二酰CoCo脂肪酸脂肪酸 四环素族四环素族, ,利福霉素族利福霉素族乙酰乙酰CoCo 大环内酯族大环内酯族, ,多
15、烯族抗生素多烯族抗生素莽草酸莽草酸 对氨基苯丙氨酸氯霉素对氨基苯丙氨酸氯霉素, ,绿脓菌素绿脓菌素苯丙氨酸苯丙氨酸, ,酪氨酸新生霉素酪氨酸新生霉素由初级代谢产物衍生的次级代谢产物的途径有七种：由初级代谢产物衍生的次级代谢产物的途径有七种：葡萄糖碳架掺入途径、莽草酸途径、与核苷有关的途径、葡萄糖碳架掺入途径、莽草酸途径、与核苷有关的途径、聚酮糖途径、由氨基酸衍生的途径、甲羟戊酸途径、其聚酮糖途径、由氨基酸衍生的途径、甲羟戊酸途径、其它复合途径。它复合途径。2.从遗传方面分析：从遗传方面分析：初级产物和次级产物同样都受到核内初级产物和次级产物同样都受到核内DNA的调节的调节控制的。控制的。所不同
16、的是次级代谢产物还受到所不同的是次级代谢产物还受到“与初级代谢产与初级代谢产物合成无关的遗传物质物合成无关的遗传物质”的控制，即受核内遗传物质的控制，即受核内遗传物质（染色体遗传物质）和核外遗传物质（质粒）的控制。（染色体遗传物质）和核外遗传物质（质粒）的控制。有一部分代谢产物的形成，取决于由质粒信息产生的有一部分代谢产物的形成，取决于由质粒信息产生的酶所控制的代谢途径，这类物质称为质粒产物。当然酶所控制的代谢途径，这类物质称为质粒产物。当然也有只由染色体也有只由染色体DNA控制的抗生素。控制的抗生素。因此，两者在遗传上既有相同的部分，又有不同因此，两者在遗传上既有相同的部分，又有不同的部分。
17、的部分。n n初级代谢可以为次级代谢产物合成提供前体物和为次级代谢产物合成提供所需要的能量，而次级代谢则是初级代谢在特定条件下的继续和发展。次级代谢产物的类型次级代谢产物的类型 n n1，根据产物合成途径区分 根据产物合成途径可以分为五种类型：n n（1）与糖代谢有关的类型n n（2）与脂肪酸代谢有关的类型n n（3）与萜烯和甾体化合物有关的类型n n（4）与TCA环有关的类型n n（5）与氨基酸代谢有关的类型n n 2，根据产物的作用区分类型 抗生素、激素、生物碱、毒素、色素及维生素等类型。 次级代谢物的生物合成次级代谢物的生物合成n n1.养分的摄入n n2.通过中枢代谢途径转化为中间体n
18、 n3.前体的合成与修饰n n4.前体进入次级代谢产物合成途径，并最终形成产物n n前体的来源：前体大多数源自初级代谢途径的产物或中间体，所以，中间体的走向是前体合成的关键。次级代谢的特点次级代谢的特点1，次级代谢以初级代谢产物为前体，并受初级代谢的调节 微生物体内的次级代谢和初级代谢一样，都受菌体代谢的调节。次级代谢产物生物合成的调节与初级代谢产物生物合成的调节基本是相同的，也是调节参与生物合成的酶合成（诱导或阻遏）和酶活性（激活或抑制）。 当初级代谢和次级代谢具有共同的合成途径时，初级代谢的终产物过量，往往会抑制次级代谢的合成，这是因为这些终产物抑制了在次级代谢产物合成中重要的分叉中间体的
19、合成。 如赖氨酸和青霉素的生物合成过程中有共同中间体-氨基己二酸，当培养液中赖氨酸过量时，则抑制-氨基己二酸的合成，进而影响到青霉素的合成。n n2，次级代谢产物一般在菌体生长后期合成 次级代谢产物发酵经历两个阶段，即营养增殖期和产物形成期。如在菌体活跃增殖阶段几乎不产生抗生素。待到细胞停止生长，进入到恒定期才开始活跃地合成抗生素，成为生产期。 3、生产能力受微量金属离子（、生产能力受微量金属离子（Fe2+、 Fe3+、Mn2+、Co2+、Zn2+）和）和 磷酸盐等无机离子磷酸盐等无机离子的影响。的影响。 4、 次级代谢酶的底物特异性较广。可同时次级代谢酶的底物特异性较广。可同时产生结构上类似
20、的多种副组分。若提供底产生结构上类似的多种副组分。若提供底物结构类似物，则可得到与天然物不同的物结构类似物，则可得到与天然物不同的次级代谢物。次级代谢物。 微生物次级代谢的调节微生物次级代谢的调节 碳代谢物的调节碳代谢物的调节 一般情况下，凡是能被微生物快速利用、促一般情况下，凡是能被微生物快速利用、促进产生菌快速生长的碳源，对次级代谢产物的生进产生菌快速生长的碳源，对次级代谢产物的生物合成都表现出抑制作用。物合成都表现出抑制作用。 这种阻遏作用是由于菌体在生长阶段，速效这种阻遏作用是由于菌体在生长阶段，速效碳源（如葡萄糖和柠檬酸等）的分解产物阻遏了碳源（如葡萄糖和柠檬酸等）的分解产物阻遏了次
21、级代谢过程中酶系的合成，只有当这类碳源耗次级代谢过程中酶系的合成，只有当这类碳源耗尽时，才能解除其对参与次级代谢的酶的阻遏，尽时，才能解除其对参与次级代谢的酶的阻遏，菌体才能转入次级代谢产物的合成阶段。菌体才能转入次级代谢产物的合成阶段。 氮代谢物的调节氮代谢物的调节 许多次级代谢产物的生物合成同样受到氮分解许多次级代谢产物的生物合成同样受到氮分解产物的影响。对不同氮源的研究发现，黄豆饼粉等产物的影响。对不同氮源的研究发现，黄豆饼粉等利用较慢的氮源，可以防止和减弱氮代谢物的阻遏利用较慢的氮源，可以防止和减弱氮代谢物的阻遏作用，有利于次级代谢产物的合成；而以无机氮或作用，有利于次级代谢产物的合成
22、；而以无机氮或简单的有机氮等容易利用的氮作为氮源（铵盐、硝简单的有机氮等容易利用的氮作为氮源（铵盐、硝酸盐、某些氨基酸）时，能促进菌体的生长，却不酸盐、某些氨基酸）时，能促进菌体的生长，却不利于次级代谢产物的合成。利于次级代谢产物的合成。例如，易利用的铵盐有利于灰色链霉菌迅速生长，例如，易利用的铵盐有利于灰色链霉菌迅速生长，但对链霉素合成则是最差的氮源。但对链霉素合成则是最差的氮源。磷酸盐的调节磷酸盐的调节 磷酸盐是菌体生长的主要限制性营养磷酸盐是菌体生长的主要限制性营养成分，还是调节次级代谢产物生物合成的成分，还是调节次级代谢产物生物合成的重要因素。过量的磷酸盐也象葡萄糖一样重要因素。过量的
23、磷酸盐也象葡萄糖一样抑制次级代谢产物的合成，这种抑制作用抑制次级代谢产物的合成，这种抑制作用被称为磷酸盐调节。被称为磷酸盐调节。 磷酸盐浓度的高低还能调节次级代谢产物磷酸盐浓度的高低还能调节次级代谢产物合成期出现的早晚，当磷酸盐接近耗尽时，合成期出现的早晚，当磷酸盐接近耗尽时，才开始进入次级代谢产物的合成期。磷酸盐才开始进入次级代谢产物的合成期。磷酸盐起始浓度高，耗尽时间长，合成期就向后拖起始浓度高，耗尽时间长，合成期就向后拖延。延。 磷酸盐还能使处于非生长状态的、产抗生磷酸盐还能使处于非生长状态的、产抗生素的菌体逆转成生长状态的、不产抗生素的素的菌体逆转成生长状态的、不产抗生素的菌体。菌体。
24、细胞膜通透性调节细胞膜通透性调节 菌体吸收外界营养物质或分泌细胞内的菌体吸收外界营养物质或分泌细胞内的代谢物都必须经过细胞质膜的运输。如果代谢物都必须经过细胞质膜的运输。如果细胞对某种物质不能运输，或是运输功能细胞对某种物质不能运输，或是运输功能发生了障碍，将导致细胞内合成代谢的产发生了障碍，将导致细胞内合成代谢的产物不能分泌出去，影响发酵产物的生成和物不能分泌出去，影响发酵产物的生成和收获；或者是细胞外的营养物质不能进入收获；或者是细胞外的营养物质不能进入菌体或进入很少，从而影响产生菌的生长菌体或进入很少，从而影响产生菌的生长和产物的合成，造成产量下降。和产物的合成，造成产量下降。金属离子和
25、溶解氧的调节金属离子和溶解氧的调节 在多数情况下，微量的金属离子是参与在多数情况下，微量的金属离子是参与次级代谢产物合成酶的活化因子，甚至有次级代谢产物合成酶的活化因子，甚至有时在转录和转译水平上起作用。如，时在转录和转译水平上起作用。如， Mg 2+可增加卡那霉素合成中的卡那霉素乙酰化可增加卡那霉素合成中的卡那霉素乙酰化酶、乙酰卡那霉素胺基化酶和弗氏链霉菌酶、乙酰卡那霉素胺基化酶和弗氏链霉菌的碱性磷酸酶的活力，促进这些酶的合成。的碱性磷酸酶的活力，促进这些酶的合成。n n思考题n n为什么次级代谢相关合成酶多是诱导酶？n n为什么初级代谢产物合成的酶专一性强，催化次级代谢产物合成的酶专一性不强 ？
