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1、中国检验检疫科学研究院食品安全研究所阪崎肠杆菌研究进展阪崎肠杆菌研究进展 中国检验检疫科学研究院食品安全研究所中国检验检疫科学研究院食品安全研究所赵贵明赵贵明 20092009年年8 8月月中国检验检疫科学研究院食品安全研究所内容提要第一部分：阪崎肠杆菌的分类学变化第二部分：阪崎肠杆菌检验研究进展中国检验检疫科学研究院食品安全研究所阪崎肠杆菌的重视程度阪崎肠杆菌的重视程度CODE OF HYGIENIC PRACTICE FOR POWDERED FORMULAE FOR INFANTS AND YOUNG CHILDRENCAC/RCP 66 - 2008替代 CAC/RCP 21-1979
2、由争论到定论给出了制定阪崎肠杆菌监控计划的指南脑膜炎小肠结肠炎菌血症中国检验检疫科学研究院食品安全研究所我国对阪崎肠杆菌方面的管理规定我国对阪崎肠杆菌方面的管理规定关于对进口乳制品进行阪崎肠杆菌检测的通知(国质检食函2005690号)；关于加强进口乳制品检验检疫监督管理工作的通知国质检食函2007298号）； 婴幼儿配方乳粉生产许可证审查细则(2006、2008版)中国检验检疫科学研究院食品安全研究所阪崎肠杆菌对配方粉的污染点、存活时间和传播线路阪崎肠杆菌对配方粉的污染点、存活时间和传播线路监控时间：2005.42006.3分离出阪崎肠杆菌：80株中间产品和终产品的阳性检出率：2.5%阳性样品
3、检出点占全部取样点的比例：31%中国检验检疫科学研究院食品安全研究所第一部分：阪崎肠杆菌的分类学变化阪崎肠杆菌分类学及命名的发展历史 阪崎肠杆菌的发现及其命名历史 阪崎肠杆菌为新种的分类依据 克罗诺杆菌分类学、词源学及其属和种生物学特性 克罗诺杆菌（Cronobacter spp.）属名、种名词源学 属及其各个种的生物学特性、代表性种 中国检验检疫科学研究院食品安全研究所阪崎肠杆菌分类学及命名的发展历史阪崎肠杆菌的发现及其命名历史1929年Pangalos报道的一种引起婴儿败血症的产黄色素的大肠菌，称为“黄色大肠菌、黄色肠杆菌”;1961年Urmenyi和Franklin根据1958年发生在英
4、国奥尔本的两例新生儿死亡病理研究，在报道中描述了其病因源于一种少见的产黄色素的阴沟肠杆菌菌群，并取日本细菌学家Riichi Sakazaki的名字作为该菌的名称;有人称之为：“Urmenyi和Franklin杆菌”；1965年Joker等分析了发生在丹麦的一个相同病例，并报道该种菌可导致新生儿脑膜炎并产生神经损伤，根据两起报道首次明确了该种病原菌为“非典型的产黄色素的阴沟肠杆菌”. 直到1980年，Farmer等发表了题为“Enterobacter sakazakii, new species of Enterobacteriaceae isolated from clinical speci
5、mens.”的文章，该菌才被统一命名并定义，该篇文章是对阪崎肠杆菌研究的阶段性成果总结。阴沟肠杆菌阴沟肠杆菌阪崎肠杆菌阪崎肠杆菌中国检验检疫科学研究院食品安全研究所阪崎肠杆菌为新种的分类依据统一了该菌的名称；确证了“产黄色素的阴沟肠杆菌”是一个新种，而不是阴沟肠杆菌的一个生物群。 依据什么？uDNA相关性u产黄色素u生化试验u抗生素易感性细菌不同株属于同一种水平DNA的相关性通常应在70%或更高 中国检验检疫科学研究院食品安全研究所DNA相关性实验ATCC29544阴沟肠杆菌阴沟肠杆菌 差异柠檬酸杆菌差异柠檬酸杆菌 51%51%中国检验检疫科学研究院食品安全研究所生化试验不利用山梨醇36C下培
6、养7d，DNA酶为阳性 中国检验检疫科学研究院食品安全研究所Farmer实验结论阪崎肠杆菌与阴沟肠杆菌不是同一个种；阪崎肠杆菌生化反应与肠杆菌属细菌更为相近；阪崎肠杆菌应作为一个独立种，归属于肠杆菌属，鉴于所分离出的阪崎肠杆菌之间也有差异，被分成15个生物型或群。中国检验检疫科学研究院食品安全研究所细菌分类方面的问题种是生物分类中基本分类单位，是具有高度特征相似性的菌株群，该菌株群与其它类群的菌株有很明显的区别；细菌学家和分类学家存在一定分歧；DNA杂交同源性在60-70%以上，或16SrRNA序列同源性达到97%以上的菌株，被认为是同一种。中国检验检疫科学研究院食品安全研究所阪崎肠杆菌的分类
7、学变化16SrRNA序列同源性在细菌分类学上的重要作用中国检验检疫科学研究院食品安全研究所阪崎肠杆菌重新分类的依据及结果重新分类的依据：的扩增片段长度多态性分析（Amplified fragment length polymorphismas, AFLP）16S rRNA全序列比较DNA- DNA杂交实验结果。2008年Iversen等在记录新细菌类群包括分类、命名、鉴定和系统发育的官方杂志“国际期刊系统与进化微生物学（International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, IJSB）”上发表文章。建议将阪崎肠杆菌重
8、新分类命名，成为肠杆菌科1个新属，即克罗诺杆菌属（Cronobacter spp.）包括5个新种（其中Cronobacter sakazakii称为新组合）、1个克罗诺杆菌基因种（genomospeciese）和三个新亚种，在该杂志通知清单上（2008年，58卷，第6部分）1个新属、5个新种和三个新亚种已公布。 中国检验检疫科学研究院食品安全研究所“系统与进化微生物学国际期刊（系统与进化微生物学国际期刊（International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, IJSB）” 记录新细菌类群包括分类、命名、鉴定和系统发育
9、的官方杂志记录新细菌类群包括分类、命名、鉴定和系统发育的官方杂志 中国检验检疫科学研究院食品安全研究所包括包括5个新种个新种,（其中（其中Cronobacter sakazakii称为新组合）、称为新组合）、1个克罗诺个克罗诺杆菌基因种（杆菌基因种（genomospeciese）和三个新亚种）和三个新亚种. 克罗诺杆菌属（克罗诺杆菌属（Cronobacter spp.）中国检验检疫科学研究院食品安全研究所DNADNA相关性：同种相关性：同种 70%70%；其它；其它 70%70%；支持克罗诺杆菌应由不；支持克罗诺杆菌应由不同种组成的说法同种组成的说法中国检验检疫科学研究院食品安全研究所克罗诺杆
10、菌及相近种细菌的克罗诺杆菌及相近种细菌的16SrRNA基因进化树基因进化树中国检验检疫科学研究院食品安全研究所中国检验检疫科学研究院食品安全研究所克罗诺杆菌属（克罗诺杆菌属（Cronobacter spp.）lCronobacter sakazakii，仍以日本细菌学家名字命名，中文应为阪崎克罗诺杆菌；lCronobacter malonaticus，“malonaticus”意为可利用丙二酸盐，中文应为丙二酸盐阳性克罗诺杆菌；lCronobacter turicensis，“turicensis”是瑞士苏黎世的拉丁文名字，中文应为苏黎世克罗诺杆菌；lCronobacter muytjensi
11、i，“muytjensii”即Muytjens，是荷兰著名微生物学家，早期从事过大量阪崎肠杆菌方面的研究工作，中文穆汀斯克罗诺杆菌；lCronobacter dublinensis，都柏林克罗诺杆菌，菌株的分离地点，lCronobacter dublinensis subsp. dublinensis，都柏林克罗诺杆菌都柏林亚种；lCronobacter dublinensis subsp. lausannensis，都柏林克罗诺杆菌洛桑亚种；lCronobacter dublinensis subsp. lactaridi，都柏林克罗诺杆菌乳粉亚种，“lactaridi”意为乳粉或奶粉。l一
12、个克罗诺杆菌基因种1，Cronobacter genomospecies 1。中国检验检疫科学研究院食品安全研究所克罗诺杆菌词源学名字起源于希腊神话中“Cronos”，克罗诺斯是十二个泰坦巨神之一，传说中的天空间神，当他每个孩子一出生就被他一口吃掉，行为表现形式和该菌的致病特性很吻合，因此，笔者建议将Cronobacter spp.中文翻译成“克罗诺杆菌属”。 中国检验检疫科学研究院食品安全研究所克罗诺杆菌属生物学特性克罗诺杆菌属生物学特性革兰氏阴性杆菌氧化酶阴性触酶反应阳性兼性厌氧通常有动力3m1m中国检验检疫科学研究院食品安全研究所生长条件范围生长条件范围6C -45C下可以在BHI中生长
13、；pH5-10可以生长，低于4.5不生长；0-7%的NaCI中生长；超过10%不生长；100mM硫酸铵，硝酸钠、亚硝酸钠中仍可生长；200mM磷酸钠，5%硫酸钠和20%乙二醇中也可生长；20mM苯甲酸钠中不生长。中国检验检疫科学研究院食品安全研究所糖醇利用还原硝酸盐利用柠檬酸盐水解七叶苷水解精氨酸鸟氨酸 脱羧酶阳性产酸葡萄糖、蔗糖、棉子糖、蜜二糖 、纤维二塘、甘露醇、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、海藻糖半乳糖醛酸酯(盐) 、麦芽糖。VP阳性甲基红阴性中国检验检疫科学研究院食品安全研究所阪崎肠杆菌主要生化特征阪崎肠杆菌主要生化特征中国检验检疫科学研究院食品安全研究所克罗诺杆菌不同种和亚种的生化反应克
14、罗诺杆菌不同种和亚种的生化反应吲哚卫矛醇果糖丙二酸盐麦芽糖帕拉金糖丁二胺松三糖松二糖肌醇乌头酸盐 甲基-葡萄糖苷氨基丁酸 中国检验检疫科学研究院食品安全研究所简单区分各种的生化反应简单区分各种的生化反应中国检验检疫科学研究院食品安全研究所阪崎肠杆菌的检测方法FDA ，Isolation and Enumeration of Enterobacter sakazakii from Dehydrated Powdered Infant Formula 2002SN/T 16322005 奶粉中阪崎肠杆菌检验方法SN/T 1632.12005 分离与计数方法SN/T 1632.22005 PCR检验
15、方法SN/T 1632.32005 荧光PCR检验方法ISO/TS 22964 IDF/RM210 Milk and milk products Detection of Enterobacter sakazakii 2006GB/T 4789.402008 食品卫生微生物学检验 阪崎肠杆菌检验第一法 定性方法第二法 MPN方法Keith Lampel 基思.蓝佩尔中国检验检疫科学研究院食品安全研究所阪崎肠杆菌检测方法的实验设计阪崎肠杆菌检测方法的实验设计 传统方法传统方法前增菌前增菌蒸馏水BPW选择性增菌选择性增菌mLSTEE选择性分离选择性分离显色培养基（DFI、ESIA，其他）VRBGA
16、主要生化特征的鉴别主要生化特征的鉴别产黄色素DNA酶生化鉴定生化鉴定APIVITEK其他分子生物学方法分子生物学方法前增菌前增菌选择性增菌选择性增菌目标片段扩增目标片段扩增dnaG.基因，大分子合成操纵子；基因，大分子合成操纵子；gluA.基因，基因，-葡萄糖苷葡萄糖苷酶； ；rpob基因，编码基因，编码RNA聚合酶聚合酶亚单亚单位的基因位的基因分离分离鉴定鉴定中国检验检疫科学研究院食品安全研究所增菌过程发现的问题增菌过程发现的问题EE肉汤抑制了部分肠杆菌属细菌生长，包括阪崎肠杆菌；当含量低的目标菌被有效回收时，竞争性的革兰氏阳性菌也能检测的到；提出在前增菌的BPW中增补：40M8-羟基喹啉、
17、0.5g柠檬酸鉄铵、0.1g去氧胆酸钠、0.1g丙酮酸钠中国检验检疫科学研究院食品安全研究所分离克罗诺杆菌新筛选方法FDA方法：ISO/TS 22964:CSB增菌肉汤结合DFI琼脂：中国检验检疫科学研究院食品安全研究所CSB克罗诺杆菌筛选肉汤（克罗诺杆菌筛选肉汤（g/L）蛋白胨 10；肉浸粉 3；氯化钠 5；溴甲酚紫 0.04；蔗糖 10；万古霉素 10mg；pH7.40.1最佳培养温度：42C中国检验检疫科学研究院食品安全研究所两种显色培养基的成分差别两种显色培养基的成分差别中国检验检疫科学研究院食品安全研究所底物的种类和特点荧光类 水溶性；受pH值影响；强烈扩散；需紫外灯吲哚类（吲哚衍生
18、物）（新型酶底物） 稳定性好；5-Br-4-Cl-3-吲哚（X）：蓝绿色 5-Br-6-Cl-3-吲哚（Y）：洋红色 6-Cl-3-吲哚：鲜肉色 6-F-3-吲哚：胭脂红酚类 如：儿茶酚，苯磷二酚其他 间接反应直直接接反反应应中国检验检疫科学研究院食品安全研究所克罗诺杆菌表型特征和遗传特征试验的结果区别克罗诺杆菌表型特征和遗传特征试验的结果区别lX-Glu，0.1g/L,3.8%克罗诺杆菌在显色培养基为阴性，当增加到0.15g/L时，又可以变成蓝绿色菌落；l肠杆菌科其他菌32%-46%也是阳性。中国检验检疫科学研究院食品安全研究所表型和遗传试验鉴定克罗诺杆菌的结果差异评价表型和遗传试验鉴定克罗
19、诺杆菌的结果差异评价底物反应比商品化显色培养基灵敏度更高，尤其是Cronobacter sakazakii和Cronobacter dublinensis；-葡萄糖苷酶并非100%都能表达，传统反分离方法存在漏检可能0.5-4.3%；通过遗传特征的鉴定效率更高一些；API20E鉴定克罗诺杆菌属的符合率（从好的鉴定到最好的鉴定）仅70%；中国检验检疫科学研究院食品安全研究所根据根据rpoBrpoB基因设计的引物可以将克罗诺杆菌属各种区分开基因设计的引物可以将克罗诺杆菌属各种区分开中国检验检疫科学研究院食品安全研究所建议重新修订阪崎肠杆菌行业标准建议重新修订阪崎肠杆菌行业标准阪崎肠杆菌的命名及分类
20、学方面已产生变化国标没有快速筛选方法附录中增加阪崎肠杆菌可以鉴定到种的方法中国检验检疫科学研究院食品安全研究所影响乳粉安全的食源性致病菌研究 背景： 乳粉作为一种特殊食品，近年来连续引发了与安全相关的事件而受到国际相关组织、各国政府的高度重视及国民的广泛关注，但现行的乳粉卫生标准已不能够满足乳粉安全的要求，开展影响乳粉安全的食源性致病菌方面的研究急需而紧迫。获得的资助：科技部社会社会公益研究专项“乳粉中新出现的致病菌研究及其风险评估” (2004DIA2J004) ；国家质检总局“乳品中阪崎肠杆菌检测方法研究” （2004IK097）的资助。 中国检验检疫科学研究院食品安全研究所研究成果应用分
21、子生物学手段和对传统方法进行创新性改进技术，形成了对肺炎克雷伯氏菌等16种潜在致病菌的检测方法体系；制订了乳粉卫生微生物学检测方法13项行业标准、10项进出口婴幼儿配方粉柠檬酸杆菌等计数与检测方法国家标准；对乳粉中16种潜在致病菌进行了风险评估；首次对我国进口及进口原料生产的487份奶粉样品中阪崎肠杆菌污染状况进行了调查。发表文章47篇；申请专利1项。中国检验检疫科学研究院食品安全研究所对阪崎肠杆菌的分离鉴别方法、表型特征分类进行了系列研究对阪崎肠杆菌的分离鉴别方法、表型特征分类进行了系列研究中国检验检疫科学研究院食品安全研究所小结1980年，该菌被正式定名为阪崎肠杆菌，属于肠杆菌属的一个种，
22、分为15个生物群；2008年，分类学方面发生变化，根据系统与进化微生物学国际期刊系统与进化微生物学国际期刊官方杂志公布，官方杂志公布，1个新组合，个新组合，4个新种，三个新亚种，克罗诺杆菌属个新种，三个新亚种，克罗诺杆菌属为新属。目前阪崎肠杆菌已分为为新属。目前阪崎肠杆菌已分为6个种。个种。克罗诺杆菌属各代表种：克罗诺杆菌属各代表种：C. sakazakii ，ATCC 29544（相当于（相当于NCTC 11467）；）；C. malonaticus ，CDC 1058-77，相当于，相当于LMG 23826和和DSM 18702；C. turicensis，z3032，（相当于，（相当于L
23、MG 23827和和DSM 18703）；）；C. genomospecies 1 ，NCTC 9529；C. muytjensii，ATCC 51329（相当于（相当于CIP 103581）；）；C. dublinensis，DES 187（相当于（相当于LMG 23823和和DSM 18705）。）。C. dublinensis subsp. dublinensis，DES 187（相当于（相当于LMG 23823和和DSM 18705）；）；C. dublinensis subsp. lausannensis，E515（相当于（相当于LMG 23824和和DSM 18706）；）；C. dublinensis subsp. lactaridi，E464（相当于（相当于LMG23825和和DSM 18707）。）。中国检验检疫科学研究院食品安全研究所
