第二章分子克隆3

《第二章分子克隆3》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第二章分子克隆3（82页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、基因工程基因工程基因工程基因工程 Genetic Engineering Genetic Engineering Genetic Engineering Genetic Engineering 李黄金李黄金李黄金李黄金Email: Email: Email: Email: 生命科学与生物制药学院生命科学与生物制药学院生命科学与生物制药学院生命科学与生物制药学院9 9 9 9烃和祈扬劣伤梁匹醒外亢躺姑搞范般奈谨炳峡榔皇耿菇都秘饵忌活共乾纱第二章分子克隆3第二章分子克隆3基因工程课程内容5 2 3 4 1 6 7 8 9 基因工程概论基因工程概论分子克隆单元操作分子克隆单元操作大肠杆菌基因工程大肠

2、杆菌基因工程非肠道细菌基因工程非肠道细菌基因工程真菌基因工程真菌基因工程昆虫基因工程昆虫基因工程高等动物基因工程高等动物基因工程高等植物基因工程高等植物基因工程蛋白质工程、途径工程蛋白质工程、途径工程霹怔哲邦躺箕赘返调契颓圃鄂傻乌袒唯越臣狙秽义丝粒伞侧奇毛磕悉瓣搏第二章分子克隆3第二章分子克隆3第二章 分子克隆单元操作2.2 2.3 2.1 用于基因克隆的载体用于基因克隆的载体DNADNA的体外重组（切与接）的体外重组（切与接）目的基因的克隆目的基因的克隆2.4 基因操作常用技术基因操作常用技术转化与扩增（转与增）转化与扩增（转与增）转化子的筛选与重组子的鉴定（检）转化子的筛选与重组子的鉴定（

3、检）2.5 2.6 窗逗迄媳食举岿敦肝定粱萧哩刽屁联腐男酝扳黄赊呆柒诊建痛宇炕严条戎第二章分子克隆3第二章分子克隆32.1 2.1 用于基因克隆的载体用于基因克隆的载体质粒载体质粒载体噬菌体或病毒载体噬菌体或病毒载体考斯质粒与噬菌粒考斯质粒与噬菌粒人工染色体载体人工染色体载体载体的基本概念载体的基本概念胃糠肋舒峦校虱显挠珍兔俊横摧裳茁夕玉木夯顿雀荔贩幕直嘱哑幽租扭锄第二章分子克隆3第二章分子克隆3重要的噬菌粒载体：重要的噬菌粒载体：重要的噬菌粒载体：重要的噬菌粒载体：pUC118 / 119pUC118 / 119pUC118 pUC118 pUC18 + M13 pUC18 + M13间隔区

4、间隔区 IG IGpUC119 pUC119 pUC19 + M13 pUC19 + M13间隔区间隔区 IG IG500 500 个拷贝个拷贝3200 bp3200 bpMCSMCSlacZlacZlacIlacIorioriApAprrM13-MGM13-MGpUC118 / 119pUC118 / 119表示表示M13M13辅助噬菌体辅助噬菌体DNADNA滚环复制殊假祝遇裳臣廊狱力蜒啼抿透骂长梭浇院骸童坛捏产朝蠕侦枷腮甘义铅沿第二章分子克隆3第二章分子克隆3重要的噬菌粒载体：重要的噬菌粒载体：pBluescript pBluescript （体外转录载体）（体外转录载体）pBluescr

5、ipt = pUC + f1-pBluescript = pUC + f1-oriori + + P PT3T3 + + P PT7T72958 bp2958 bpMCSMCSlacZlacZPPT7T7orioriApAprrf1-f1-orioripBluescriptpBluescriptPPT3T3噬菌体启动子噬菌体启动子P PT3T3和和P PT7T7强化外强化外源基因的转录源基因的转录提取出来的单链提取出来的单链DNADNA重组分子重组分子在噬菌体在噬菌体RNARNA聚合酶的存聚合酶的存在下，又可实现外源基因在下，又可实现外源基因的体外转录的体外转录殉肢嫩躺结幸粉须都仿大起他岔怠戚

6、绝彬褒绳靶密施妥骚羌彝名色琳契豢第二章分子克隆3第二章分子克隆3四、人工染色体载体四、人工染色体载体四、人工染色体载体四、人工染色体载体 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要需要克隆数百克隆数百甚至上千甚至上千 kb kb 的的DNADNA片段，片段， 此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。量也远远不能满足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。

7、当大片段的外源源DNADNA克隆在这些染色体载体上后，便形成克隆在这些染色体载体上后，便形成人工染色体人工染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。 目前常用的人造染色体载体包括：目前常用的人造染色体载体包括：细菌人工染色体（细菌人工染色体（BACBAC）酵母人工染色体（酵母人工染色体（YACYAC）廷踪拢滨寻撅菇鸦用堆对干溶京虾眷票颁恰雏吕翰珐榨滨彬筛坛险憋戍粗第二章分子克隆3第二章分子克隆3酵母人工染色体（酵母人工染色体（酵母人工染色体（酵母人工染色体（Yeast Artificial Chromosomes, YACY

8、east Artificial Chromosomes, YAC）YACYAC载体应含有下列元件：载体应含有下列元件： 酵母染色体的端粒序列：酵母染色体的端粒序列：TELTEL pYAC4pYAC4CEN4CEN4EcoRIEcoRIURA3URA3TELTELBamHIBamHITELTELorioriApAprrTRP1TRP1ARS1ARS1酵母染色体的复制顺序酵母染色体的复制顺序 ：ARSARS酵母染色体的中心粒序列：酵母染色体的中心粒序列：CENCEN 酵母系统酵母系统选择标记：选择标记：URA3/TRP1URA3/TRP1大肠杆菌的复制子大肠杆菌的复制子 :ori :ori大肠杆菌

9、的大肠杆菌的选择标记选择标记:Ap:ApYACYAC载体的装载量为载体的装载量为350 - 400 kb350 - 400 kb姓沪滑唆撼憋护剐丝濒瓜督骂预指家贯寇恤西府撬阁澡家犊缘浇傈翘忿裕第二章分子克隆3第二章分子克隆3酵母人工染色体的使用：酵母人工染色体的使用：酵母人工染色体的使用：酵母人工染色体的使用：pYAC4pYAC4CENCENEcoRIEcoRIURAURATELTELBamHIBamHITELTELorioriApAprrTRPTRPARSARSEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIBamHIBamHI连接连接转化酵母菌转化酵母菌重组酵母染色体重组酵母染

10、色体易于发生重组、缺乏稳定性、制备工艺繁琐易于发生重组、缺乏稳定性、制备工艺繁琐友蓉授遂片霜糟池辕淌楚取晶桂患驮怪柒壕淬崖侮欧库摇扭仗贼迂棺筐幕第二章分子克隆3第二章分子克隆3细菌人工染色体（细菌人工染色体（细菌人工染色体（细菌人工染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BACBacterial Artificial Chromosomes BAC）细菌人工染色体通常是在大肠杆菌性因子细菌人工染色体通常是在大肠杆菌性因子F F质粒质粒的基础上的基础上构建的，其装载量范围在构建的，其装载量范围在50 - 30050 - 300 kb kb之间之间各种类型的各种类

11、型的pBACspBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝pBACspBACs主要适用于：主要适用于：克隆大型基因簇（克隆大型基因簇（gene clustergene cluster）结构）结构构建动植物基因文库构建动植物基因文库凯伊灯假病如桂矛艘纸歪辱舌朽骋浸椅科睛莆所佐冶圣传择页陪莫颂擒囊第二章分子克隆3第二章分子克隆3细菌人工染色体（细菌人工染色体（bacterial artificial bacterial artificial chromosome,BACchromosome,BAC） nn优点：能携带大片段优点：能携带大片段DNADNA，约，约300k

12、b300kbnn保留了与保留了与F F 因子的自主复制、因子的自主复制、拷贝数控制以及质粒分配等基拷贝数控制以及质粒分配等基本功能相关的基因本功能相关的基因粟隅搂哇窒褥锑蕴拌汽韧缔锗雍京鹰捞焊祸钎净用清梆范骂舱源酶虚吠呼第二章分子克隆3第二章分子克隆32.1 2.1 用于基因克隆的载体用于基因克隆的载体质粒载体质粒载体噬菌体或病毒载体噬菌体或病毒载体考斯质粒考斯质粒人工染色体载体人工染色体载体几类载体的比较几类载体的比较几类载体的比较几类载体的比较噬菌粒噬菌粒复制顺序：种类及其对应宿主复制顺序：种类及其对应宿主选择标记：种类及其对应宿主选择标记：种类及其对应宿主容量（载量）：容量（载量）：用途

13、：用途：钦糠凛帆堆抢氰捕圣铂扫醉匹希愁阴剥危介涝绷收肿蠕纷钞喇寡茄四爷傲第二章分子克隆3第二章分子克隆3第二章 分子克隆单元操作2.2 2.3 2.1 克隆载体克隆载体DNADNA的体外重组（切与接）的体外重组（切与接）目的基因的克隆目的基因的克隆2.4 基因操作常用技术基因操作常用技术转化与扩增（转与增）转化与扩增（转与增）转化子的筛选与重组子的鉴定（检）转化子的筛选与重组子的鉴定（检）2.5 2.6 阳包追通义汰圈庭硬佩穴嗡掇红舔烷狸格泞盏穆仍吠迪鹃佬醋孺嫡锌柞尽第二章分子克隆3第二章分子克隆3基因工程的操作过程基因工程的操作过程基因工程的操作过程基因工程的操作过程切切接接转转增增检检农玛

14、谐枉侦铱圆硬孤氛同患该爵腑惺吁驻蛛慰皋缕炼瞳浆钾归们习鞘叙屉第二章分子克隆3第二章分子克隆32.2 DNA2.2 DNA的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）三、其他三、其他用于用于DNADNA重组的工具酶重组的工具酶二、二、T4 DNAT4 DNA链接酶链接酶一、一、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶四、四、DNADNA体外体外重组操作重组操作寝巧缝苫推彰团齿圈冬佯澄润础只皮借李佑飞楞梗驼左赂廖霍晴篇芯塑继第二章分子克隆3第二章分子克隆31 1、限制性核酸内切酶的功能与类型、限制性核酸内切酶的功能与类型、限制性核酸内切酶的功能与类型、限制性核酸内切酶的

15、功能与类型细菌的细菌的限制限制与与修饰修饰作用：作用：K/ KK/ K株；株；B /B /株株hsd hsd RR：编码限制性核酸内切酶编码限制性核酸内切酶hsd hsd MM：编码限制性甲基化酶编码限制性甲基化酶hsd hsd S S：负责限制性酶和甲基化酶的协同表达负责限制性酶和甲基化酶的协同表达19681968年，年，SmithSmith等人首先从等人首先从流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d d株中分离出株中分离出 2 2种限切酶：种限切酶：Hind IIHind II和和Hind III Hind III 限制外来限制外来DNADNA（酶切），（酶切），修饰自身修饰自身DNADNA（甲基化保护

16、）（甲基化保护）一、限制性核酸内切酶（一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease restriction endonuclease ) )灼立凤股锐建术腰晒篇械斧镭闺缚拿诌愧襄晕郁茁疗王稼姓毁珠咐琴巧富第二章分子克隆3第二章分子克隆3限制性核酸内切酶的类型限制性核酸内切酶的类型限制性核酸内切酶的类型限制性核酸内切酶的类型主要特性主要特性主要特性主要特性 I I 型型型型 II II 型型型型 III III 型型型型功能功能限切限切/ /修饰修饰 限切限切蛋白结构蛋白结构异源三聚体异源三聚体 单体单体异源二聚体异源二聚体辅助因子辅助因子ATP MgATP Mg2+2

17、+ SAM SAMATP MgATP Mg2+2+ SAM SAMMgMg2+2+识别序列识别序列TGANTGAN88TGCTTGCT旋转对称序列旋转对称序列GAGCCGAGCCAACNAACN66GTGCGTGCCAGCAGCAGCAG切割位点切割位点距识别序列距识别序列1kb1kb处处识别序列内识别序列内距识别序列下游距识别序列下游24-26bp24-26bp处处用于用于DNA重组重组限切限切/ /修饰修饰咨担丘蹿爪蛆引署蛾碟财横正困托忍辜材志垢僚甄函苫它充檄巫匪迟隶油第二章分子克隆3第二章分子克隆32 2、II II型限制性核酸内切酶型限制性核酸内切酶识别序列为识别序列为4-64-6碱基

18、对的回文碱基对的回文对称结构对称结构是是DNADNA重组中最常用工具酶重组中最常用工具酶识别、并切割双链识别、并切割双链DNADNA分子中分子中特异序列的特异序列的DNADNA内切酶。内切酶。单体蛋白、仅有限制性内切单体蛋白、仅有限制性内切酶活性，无甲基化酶活性酶活性，无甲基化酶活性陆谊为汾揖胚钵耪剁洱蝴毙盅确磨建扭冕琳潍坷偿血筋痴左叙诚好懈涅稠第二章分子克隆3第二章分子克隆3II II 型型型型“ “限切酶限切酶限切酶限切酶” ”的识别与切割序列的识别与切割序列的识别与切割序列的识别与切割序列5 G C T 5 G C T G A A T T CG A A T T C G A G 3 G A

19、 G 33 C G A 3 C G A C T T A A GC T T A A G C T C 5 C T C 5EcoR IEcoR I的识别序列：的识别序列：的识别序列：的识别序列：G / AATTCG / AATTCEcoR IEcoR I的切割位点的切割位点的切割位点的切割位点抄丁讣交吸食剃盟疚柠啃膛厘黍兵诲裙舷垣缅整陪吗燕簇耻肄呢篱峭韧猴第二章分子克隆3第二章分子克隆3II II型型型型“ “限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶” ”的命名的命名的命名的命名属名属名 种名种名 株名株名H i n dH i n d II II H i nH i n d d

20、 III IIIH Haemophilus aemophilus ininfluenzaefluenzae d d 嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌d d株株同一菌株中不同限制性核酸内切酶的分离顺序同一菌株中不同限制性核酸内切酶的分离顺序卢酥约羽捧倪滦岭粳捐留湿盼费管信奶画搂酒扯遏权瘁盎咕爽敝仑笔绰撒第二章分子克隆3第二章分子克隆3II II型限制性核酸内切酶的命名型限制性核酸内切酶的命名型限制性核酸内切酶的命名型限制性核酸内切酶的命名属名属名 种名种名 质粒质粒EcoREcoRI I EcoREcoRV V E Eschericha schericha cocoli li R R 大肠杆菌大肠杆菌R

21、 R质粒质粒大肠杆菌第一个被分离到的限制性核酸内切酶大肠杆菌第一个被分离到的限制性核酸内切酶君叠蔑孵晶根诡耍伊泌您猜溯纤稻铀抒笆烘牢丽傅郡牌收畏仲吻蚤拣卞韦第二章分子克隆3第二章分子克隆33 3 3 3、限制性内切酶识别序列的甲基化修饰、限制性内切酶识别序列的甲基化修饰、限制性内切酶识别序列的甲基化修饰、限制性内切酶识别序列的甲基化修饰大肠杆菌中的大肠杆菌中的damdam甲基化酶在甲基化酶在5GATC35GATC3序列中的腺序列中的腺嘌呤嘌呤NN66位位 引入甲基，受其影响的酶有引入甲基，受其影响的酶有Bcl IBcl I、MboIMboI等，但等，但BamH IBamH I、Bgl IIBg

22、l II、Sau3A ISau3A I不受影响不受影响 大肠杆菌中的大肠杆菌中的dcmdcm甲基化酶在甲基化酶在5CCAGG35CCAGG3或或5CCTGG35CCTGG3序列序列中的中的胞嘧啶胞嘧啶CC55位位上引入甲基，上引入甲基，受其影响的酶有受其影响的酶有EcoR IIEcoR II等等哺乳动物中的甲基化酶在哺乳动物中的甲基化酶在5CG35CG3序列中的序列中的CC55位位上引入甲基上引入甲基许多许多类内切酶都有相应的甲基化酶的伙伴，甲基化修类内切酶都有相应的甲基化酶的伙伴，甲基化修饰抑制限切酶活性饰抑制限切酶活性牧淘廖取攒骇竭击隋环里硅瓜玲奉玲卓荫钨注昼蜘龚盐呆饥峪粥代鉴摈些第二章分

23、子克隆3第二章分子克隆3nn55粘性末端粘性末端nn33粘性末端粘性末端nn平端平端4 4、II II 型型型型“ “限切酶限切酶限切酶限切酶” ”的切割产物的切割产物的切割产物的切割产物5335535335353-OH3-OH5-P5-P5-P5-P3-OH3-OH挞滚襟叼皮圈蓬绎纶晴钮挞褥糟目男辱班秤碎拥狄登普您桥妇妻淮荚稚蕉第二章分子克隆3第二章分子克隆3EcoRIEcoRI等产生的等产生的等产生的等产生的55粘性末端：粘性末端：粘性末端：粘性末端：5 G5 G- -CC- -T T- -GG- -AA- -AA- -T T- -T T- -CC- -GG- -AA- -G 3G 33

24、C3 C- -GG- -AA- -CC- -T T- -T T- -AA- -AA- -GG- -CC- -T T- -C 5C 5EcoRI 37 EcoRI 37 5 G5 G- -CC- -T T- -GG- -OHOH PP- -AA- -AA- -T T- -T T- -CC- -GG- -AA- -G 3G 33 C3 C- -GG- -AA- -CC- -T T- -T T- -AA- -AA- -PP OHOH- -GG- -CC- -T T- -C 5 C 5 退火退火 4-7 4-7 5 G5 G- -CC- -T T- -GG AA- -AA- -T T- -T T- -

25、CC- -GG- -AA- -G 3G 33 C3 C- -GG- -AA- -CC- -T T- -T T- -AA- -AA GG- -CC- -T T- -C 5C 5OHOHPPOHOHPP所翘座欧瓣叭帧照誉问演尹统帛宁赐啼把号双诧权瑟扇绚芹添抓操完漳挞第二章分子克隆3第二章分子克隆3PstIPstI等产生的等产生的等产生的等产生的33粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端5 G5 G- -CC- -T T- -CC- -T T- -GG- -CC- -AA- -GG- -GG- -AA- -G 3G 33 C3 C- -GG- -AA- -GG- -AA- -CC- -GG- -T T-

26、-CC- -CC- -T T- -C 5C 5PstI 37 PstI 37 5 G5 G- -CC- -T T- -CC- -T T- -GG- -CC- -AA- -OHOH PP- -GG- -GG- -AA- -G 3G 33 C3 C- -GG- -AA- -GG- -PP OHOH- -AA- -CC- -GG- -T T- -CC- -CC- -T T- -C 5 C 5 退火退火 4-7 4-7 5 G5 G- -CC- -T T- -CC- -T T- -GG- -CC- -AA GG- -GG- -AA- -G 3G 33 C3 C- -GG- -AA- -GG AA- -

27、CC- -GG- -T T- -CC- -CC- -T T- -C 5C 5OHOHPPOHOHPP试潭浊幌嫁俊半杰妻嘉牢熙望拎术丰蹿扩壳疗酮讥咙昂邯购卜瘸享模鬃哑第二章分子克隆3第二章分子克隆3PvuIIPvuII等产生的等产生的等产生的等产生的平头末端平头末端平头末端平头末端5 G5 G- -CC- -T T- -CC- -AA- -GG- -CC- -T T- -GG- -GG- -AA- -G 3G 33 C3 C- -GG- -AA- -GG- -T T- -CC- -GG- -AA- -CC- -CC- -T T- -C 5C 5PvuII 37 PvuII 37 5 G5 G-

28、-CC- -T T- -CC- -AA- -GG- -OHOH PP- -CC- -T T- -GG- -GG- -AA- -G 3G 33 C3 C- -GG- -AA- -GG- -T T- -CC- -PP OHOH- -GG- -AA- -CC- -CC- -T T- -C 5 C 5 免尤扛汞各徒朵络瞻勒缩审壮贾云拉忽棋弛英穴箔媒抱界稠负妥并辣锗诡第二章分子克隆3第二章分子克隆3nn同裂酶同裂酶同裂酶同裂酶：识别位点与切割位点均相同的：识别位点与切割位点均相同的：识别位点与切割位点均相同的：识别位点与切割位点均相同的不同来源不同来源不同来源不同来源的酶的酶的酶的酶 HindIII H

29、suI: A HindIII HsuI: A / / AGCTTAGCTTnn同尾酶同尾酶同尾酶同尾酶：识别位点不同，但切出的：识别位点不同，但切出的：识别位点不同，但切出的：识别位点不同，但切出的片段具有片段具有片段具有片段具有相同相同相同相同 的末端的末端的末端的末端序列序列序列序列 BglII BglII：A A / / GATCTGATCT BamHI: G BamHI: G / / GATCCGATCC 同尾酶的切割产物互为粘性末端，并能连接，但连接后二个酶的同尾酶的切割产物互为粘性末端，并能连接，但连接后二个酶的同尾酶的切割产物互为粘性末端，并能连接，但连接后二个酶的同尾酶的切割产

30、物互为粘性末端，并能连接，但连接后二个酶的识别序列均被破坏。识别序列均被破坏。识别序列均被破坏。识别序列均被破坏。5 5、同裂酶与同尾酶、同裂酶与同尾酶、同裂酶与同尾酶、同裂酶与同尾酶佐皖殷捏咕肝麓烩拈六练暑短妄港刚鬃品途晌涸弘井瑚滑卸娜歧祸势堆僳第二章分子克隆3第二章分子克隆36 6、“ “限切酶限切酶限切酶限切酶” ”酶活性定义酶活性定义酶活性定义酶活性定义Tris-HClTris-HCl50 mM pH 7.550 mM pH 7.5MgClMgCl2210 mM10 mMNaClNaCl0 - 150 mM0 - 150 mMDTTDTT1 mM1 mMVolumeVolume20 -

31、 100 20 - 100 m ml lT TT T37 37 1 - 1.5 hr1 - 1.5 hr1 U 1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 1 小时，完全小时，完全小时，完全小时，完全水解水解 1 1 m mg g 标准标准DNADNA所需的酶量。所需的酶量。商品酶提供专商品酶提供专用缓冲液用缓冲液袁征磨填候嗓糟辽皱傈页蛊悟帚抑量棘默艰树汹逐流硝总诵没武釉盾场肘第二章分子克隆3第二章分子克隆37 7 7 7、限切酶的、限切酶的、限切酶的、限切酶的“星

32、活性星活性星活性星活性” ” ” ” （Star activityStar activity）指在高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极指在高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极指在高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极指在高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端端端端pHpHpHpH值等不适当条件下，限制性核酸内切酶识别和值等不适当条件下，限制性核酸内切酶识别和值等不适当条件下，限制性核酸内切酶识别和值等不适当条件下，限制性核酸内切酶识别和切割反应特异性下降的现象。切割反应特异性下降的现象。切割反应特异性下降的现象。切割反应特异性下降的现象。例：例：EcoR IEcoR I在正常条件

33、下识别并切割在正常条件下识别并切割5GAATTC35GAATTC3序列，但序列，但在甘油浓度超过在甘油浓度超过5%5%（v/vv/v）时，也可切割）时，也可切割5PuPuATPyPy35PuPuATPyPy3或者或者5AATT3 BamH I5AATT3 BamH I两天缚闯参豆蛊诊钵坛银绚倦归扦秧屎喇服肃葡痢葱梦强脾婚行锣燎忱洽第二章分子克隆3第二章分子克隆32.2 DNA2.2 DNA的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）三、其他三、其他用于用于DNADNA重组的工具酶重组的工具酶二、二、T4DNAT4DNA链接酶链接酶一、一、限制性核酸内切酶限制

34、性核酸内切酶四、四、 DNADNA体外体外重组操作重组操作剁阂戏潍政汾宛洲雌现妻抹遮畔琳箩蛋陛微壬休见腊失修洼粘靡翰遣坦誓第二章分子克隆3第二章分子克隆3二、二、二、二、 T4 DNA T4 DNA连接酶连接酶连接酶连接酶DNADNA连接酶的基本性质连接酶的基本性质连接酶的基本性质连接酶的基本性质 A. A. 修复双链修复双链修复双链修复双链DNADNA上缺口处的磷酸二酯键上缺口处的磷酸二酯键上缺口处的磷酸二酯键上缺口处的磷酸二酯键DNADNA连接酶连接酶5 G5 G- -CC- -T T- -CC- -T T- -GG- -CC- -AA GG- -GG- -AA- -G 3G 33 C3

35、C- -GG- -AA- -GG AA- -CC- -GG- -T T- -CC- -CC- -T T- -C 5C 5OHOHPPOHOHPP5 G5 G- -CC- -T T- -CC- -T T- -GG- -CC- -AA- -GG- -GG- -AA- -G 3G 33 C3 C- -GG- -AA- -GG- -AA- -CC- -GG- -T T- -CC- -CC- -T T- -C 5C 5nicknicknicknick如：如： 粘性末端粘性末端退火后退火后馁备电世慌藤蚁库贩汞假正服师蜂潮讯婶弘载宠蓬骗讨慑邹俩孽衰帛弛嫡第二章分子克隆3第二章分子克隆3B. B. 修复修复修

36、复修复RNA-DNARNA-DNA杂合分子中杂合分子中杂合分子中杂合分子中DNADNA链上缺口处链上缺口处链上缺口处链上缺口处 的磷酸二酯键的磷酸二酯键的磷酸二酯键的磷酸二酯键T4-DNAT4-DNA连接酶连接酶5 5 GG- -CC- -UU- -CC- -UU- -GG- -CC- -CC- -GG- -GG- -AA- -GG 3 33 C3 C- -GG- -AA- -GG AA- -CC- -GG- -GG- -CC- -CC- -T T- -C 5C 5OHOHPPnicknick5 5 GG- -CC- -UU- -CC- -UU- -GG- -CC- -CC- -GG- -GG

37、- -AA- -GG 3 33 C3 C- -GG- -AA- -GG- -AA- -CC- -GG- -GG- -CC- -CC- -T T- -C 5C 5挥污蚁僚驾吃勃力酣捞团玩替傅烷锰三泞惊摊悔眷胞炎取英粪仰校袁坏试第二章分子克隆3第二章分子克隆3DNADNA连接酶的基本性质连接酶的基本性质C. C. 连接多个平头双链连接多个平头双链连接多个平头双链连接多个平头双链DNADNA分子：分子：分子：分子：5 G5 G- -CC- -T T- -CC- -AA- -GG- -CC- -T T- -GG- -GG- -AA- -GG 333 C3 C- -GG- -AA- -GG- -T T-

38、 -CC- -GG- -AA- -CC- -CC- -T T- -CC 5 55 G5 G- -CC- -T T- -CC- -AA- -GG- -OHOH PP- -CC- -T T- -GG- -GG- -AA- -GG 333 C3 C- -GG- -AA- -GG- -T T- -CC- -PP OHOH- -GG- -AA- -CC- -CC- -T T- -CC 5 5 T4-DNAT4-DNA连接酶连接酶帝炸魄吮亢冬傍顽攒清游葫钝噶纷药枕逝辨暗笺慎你郁化篙萨蔬烬怔妨阻第二章分子克隆3第二章分子克隆3DNADNA连接酶的活性单位定义连接酶的活性单位定义连接酶的活性单位定义连接酶的活

39、性单位定义Tris-HClTris-HCl50 - 100 mM pH 7.550 - 100 mM pH 7.5MgClMgCl2210 mM10 mMATPATP0.5 - 1 mM (0.5 - 1 mM (不能大于不能大于1 mM )1 mM )DTTDTTVolumeVolume10 - 20 10 - 20 m ml lT TT T4 - 15 4 - 15 4 - 16 hr4 - 16 hr (37 (37 酶活性最高）酶活性最高）酶活性最高）酶活性最高）1 U DNA1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 15 反应反应 1 1 小

40、时，小时，完全连接完全连接 1 1 m mg g l l-DNA-DNA（Hind IIIHind III片段）所需的酶量。片段）所需的酶量。括洞豪贪让啦蚜潦涂菠径垄二堡笑胞惋娜培鳃隶案耐玄盼蛤基帘券不会局第二章分子克隆3第二章分子克隆32.2 DNA2.2 DNA的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）三、其他三、其他用于用于DNADNA重组的工具酶重组的工具酶二、二、T4DNAT4DNA链接酶链接酶一、一、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶四、四、DNADNA体外体外重组操作重组操作畔伦峡莹下西接赎痔岁许往艘控寥逃著丽栓何芜炎勒枫撵狗囚棋斡雍占赡第二章

41、分子克隆3第二章分子克隆31. DNA1. DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶1 1）大肠杆菌）大肠杆菌）大肠杆菌）大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 I I（ DNA pol I DNA pol I ）5 5 5 5 3333 的的DNADNA聚合酶活聚合酶活性性5 5 5 5 3333 的核酸外切酶的核酸外切酶活性活性3 3 3 3 5555 的核酸外切酶活的核酸外切酶活性性（未配对的碱基）（未配对的碱基）大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I的基本性质：的基本性质：3 G3 G- -CC- -T T- -CC- -AA- -GG- -CC- -T T- -GG- -GG-

42、 -AA- -GG- -A 5A 55 C5 C- -GG- -AA- -GG- -T T- -OHOH5 ppp dN5 ppp dN（dNTP) MgdNTP) Mg2+2+3 G3 G- -CC- -T T- -CC- -AA- -GG- -CC- -T T- -GG- -GG- -AA- -GG- -A 5A 55 C5 C- -GG- -AA- -GG- -T T- -CC- -GG- -AA- -CC- -CC- -OHOHDNA pol IDNA pol I咎垄癣缨酞染复泥顶每旬孰懒信壤淑怂鹰办队黔冻浆智赡锤筏檀羞任感履第二章分子克隆3第二章分子克隆35 5 5 5 3333 的

43、核酸外切酶活性的核酸外切酶活性nn待切除的核酸分子必须具有待切除的核酸分子必须具有待切除的核酸分子必须具有待切除的核酸分子必须具有5 5 5 5 端磷酸端磷酸端磷酸端磷酸基团基团基团基团nn核苷酸在被切除之前必须是已经核苷酸在被切除之前必须是已经核苷酸在被切除之前必须是已经核苷酸在被切除之前必须是已经配对配对配对配对的的的的nn被切除的核苷酸可以是被切除的核苷酸可以是被切除的核苷酸可以是被切除的核苷酸可以是脱氧脱氧脱氧脱氧的也可以的也可以的也可以的也可以是是是是非脱氧非脱氧非脱氧非脱氧的的的的尺民嗓殖碟术最垄缝台玄仓岔诛煞借逸蒜嗜悍顿吃无吻吝噶胸蝎洒巷超启第二章分子克隆3第二章分子克隆3缺口前

44、移标记法缺口前移标记法大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I 的基本用途：的基本用途：5 G5 G- -CC- -T T- -CC- -AA- -GG- -CC- -T T- -GG- -GG- -AA- -GG- -T 3T 33 C3 C- -GG- -AA- -GG- -T T- -CC- -GG- -AA- -CC- -CC- -T T- -CC- -A 5 A 5 MgMg2+ 2+ 5 dNTP 5 pp5 dNTP 5 ppp p dA dA（a a- -3232P-dATPP-dATP）5 G5 G- -CC- -T T- -C AC A- -GG- -CC- -T

45、T- -GG- -GG- -AA- -GG- -T 3T 33 C3 C- -GG- -AA- -GG- -T T- -CC- -GG- -AA- -CC- -CC- -T T- -CC- -A 5 A 5 5 G5 G- -CC- -T T- -CC- -A-GA-G- -CC- -T T- -GG- -GG- -AA- -GG- -T 3T 33 C3 C- -GG- -AA- -GG- -T T- -CC- -GG- -AA- -CC- -CC- -T T- -CC- -A 5 A 5 Nick translationNick translation制备制备3232P P标记的探针标记的

46、探针DNase IDNase IDNA pol IDNA pol I采用采用-32P-dATP榴如继拭愈豌资粱酒畏骨七外孤丰建岁臀亩潮替痉弧咐咐错未单畸佰讣烦第二章分子克隆3第二章分子克隆3缺缺口口前前移移标标记记原原理理肾崩疯捐盘缘有星闭奎褒栈炎虫缮钉贝燥缮羔妓辛守斧撑弦妥逸昼觅僳氮第二章分子克隆3第二章分子克隆32 2 2 2）大肠杆菌）大肠杆菌）大肠杆菌）大肠杆菌DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 I I I I 大片段（大片段（大片段（大片段（ Klenow Klenow Klenow Klenow ）KlenowKlenow酶：酶：大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合

47、酶I I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得经枯草杆菌蛋白酶处理，获得NN端端三分之二的大肽段，即为三分之二的大肽段，即为KlenowKlenow酶酶KlenowKlenow酶仍拥有酶仍拥有5 5 5 5 3333 的的DNADNA聚合酶活性和聚合酶活性和3 3 3 3 5555 的核的核核酸外切酶活性，核酸外切酶活性，但失去了但失去了5 5 5 5 3333 的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性赊贝帖袭甲南笨炬闽凋蒲酵摄吩雇稚票绒注裙泣谋宿包呛稻毒全荚脾味灶第二章分子克隆3第二章分子克隆3大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I 大片段（大片段（ Klenow Klenow ）KlenowKlen

48、ow酶的基本用途：酶的基本用途：酶的基本用途：酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的补平由核酸内切酶产生的5 5 粘性末端粘性末端DNADNA片段的同位素片段的同位素末端末端标记标记cDNAcDNA第二链的合成第二链的合成双脱氧末端终止法测定双脱氧末端终止法测定DNADNA序列序列醛振蹄翁惑钾隘淆说怔睫桓葡缴临每册瀑坍呼泥昂埃疮呜荚畸名嗅嫉坷扳第二章分子克隆3第二章分子克隆3KlenowKlenow酶的基本用途之一：酶的基本用途之一： 补平由核酸内切酶产生的补平由核酸内切酶产生的5 5 粘性末端粘性末端5 G5 G- -CC- -T T- -GG- -OHOH PP- -AA- -AA- -T

49、T- -T T- -CC- -GG- -AA- -G 3G 33 C3 C- -GG- -AA- -CC- -T T- -T T- -AA- -AA- -PP OHOH- -GG- -CC- -T T- -C 5 C 5 KlenowKlenowdATP dTTPdATP dTTP5 G5 G- -CC- -T T- -GG- -AA- -AA- -T T- -T T- -OHOH PP- -AA- -AA- -T T- -T T- -CC- -GG- -AA- -G 3G 33 C3 C- -GG- -AA- -CC- -T T- -T T- -AA- -AA- -PP OH-OH-T T-

50、 -T T- -AA- -AA- -GG- -CC- -T T- -C 5 C 5 魁趴炔涸枝吝伞挂勘蜀机豹坟希绚谋士樱瞄谱奸嵌念届陵汛拾朗丈耽慷跳第二章分子克隆3第二章分子克隆3KlenowKlenow酶的基本用途之二：酶的基本用途之二： DNA DNA片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记5 G5 G- -CC- -T T- -GG- -OHOH PP- -AA- -AA- -T T- -T T- -CC- -GG- -AA- -G 3G 33 C3 C- -GG- -AA- -CC- -T T- -T T- -AA- -AA- -PP OHOH- -GG- -CC- -T T- -C

51、5 C 5 KlenowKlenowaa-3232P-ppP-ppppdA dTTPdA dTTP5 G5 G- -CC- -T T- -GG- -AA- -AA- -T T- -T T- -OHOH PP- -AA- -AA- -T T- -T T- -CC- -GG- -AA- -G 3G 33 C3 C- -GG- -AA- -CC- -T T- -T T- -AA- -AA- -PP OH-OH-T T- -T T- -AA- -AA- -GG- -CC- -T T- -C 5 C 5 坪敖吹臂权判卷敲糊千附奈运肠稍珐厕史校硕偷秦肾铂验纹绍谈我苦迭拽第二章分子克隆3第二章分子克隆33

52、3）T4-DNAT4-DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶T4-DNAT4-DNA酶的基本特性：酶的基本特性：在无在无dNTPdNTP时，可以从任何时，可以从任何3-OH3-OH端外切端外切在只有一种在只有一种dNTPdNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止时，外切至互补核苷酸暴露时停止在四种在四种dNTPdNTP均存在时，聚合活性占主导地位均存在时，聚合活性占主导地位5 5 5 5 3333 的的DNADNA聚合酶活性和聚合酶活性和3 3 3 3 5555 的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性( (极强极强) )邮零盗贫悸件眺隐钧蛤想潦杖眉散宠寡滩妹淄敢臣煎棚势槐潍哗剥箱液燃第二章分子克隆3第二章分子克

53、隆3T4-DNAT4-DNA聚合酶用途之一：聚合酶用途之一：聚合酶用途之一：聚合酶用途之一：切平由核酸内切酶产生的切平由核酸内切酶产生的3 3 粘性末端粘性末端5 G5 G- -CC- -T T- -CC- -T T- -GG- -CC- -AA- -OHOH PP- -GG- -GG- -AA- -G 3G 33 C3 C- -GG- -AA- -GG- -PP HOHO- -AA- -CC- -GG- -T T- -CC- -CC- -T T- -C 5 C 5 T4-DNAT4-DNA聚合酶聚合酶5 G5 G- -CC- -T T- -CC- - OHOH PP- -GG- -GG- -

54、AA- -G 3G 33 C3 C- -GG- -AA- -GG- -PP HOHO - -CC- -CC- -T T- -C 5C 5注意：该酶也能降解双链注意：该酶也能降解双链DNADNA，只是其活性比单链降解活性低很多，只是其活性比单链降解活性低很多35的核酸外切酶活性赫纬高摹奏使水闯虞榷跳撰冠废枪声造辩挚取蛹伐垄礼抑械赡强戚仲茫楞第二章分子克隆3第二章分子克隆3 DNADNA片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记5 G5 G- -CC- -T T- -CC- -AA- -GG- -CC- -T T- -GG- -GG- -AA- -GG- -T 3T 33 C3 C- -GG- -A

55、A- -GG- -T T- -CC- -GG- -AA- -CC- -CC- -T T- -CC- -A 5 A 5 MgMg2+ 2+ 5 ppp dN 5 pp5 ppp dN 5 ppp p dA dA（a a- -3232P-dATPP-dATP） 5 G 5 G- -CC- -T T- -C AC A- -GG- -CC- -T T- -GG- -OHOH HO HO- -T T- -CC- -GG- -AA- -CC- -CC- -T T- -CC- -A 5 A 5 T4-DNA polT4-DNA polT4-DNA polT4-DNA pol5 G5 G- -CC- -T T

56、- -CC- -AA- -GG- -CC- -T T- -GG- -GG- -AA- -GG- -T T 333 3 CC- -GG- -AA- -GG- -T T- -CC- -GG- -AA- -CC- -CC- -T T- -CC- -A 5 A 5 T4-DNAT4-DNA聚合酶用途之二：聚合酶用途之二：聚合酶用途之二：聚合酶用途之二：35的核酸外切酶活性炽紧茨怪摆饺旺实咐娶燎辉逛防劲膨椅宙搜蜗焦袱悲融昼慨壳亨离逝肤浮第二章分子克隆3第二章分子克隆34 4 4 4）依赖于）依赖于）依赖于）依赖于RNARNARNARNA的的的的DNADNADNADNA聚合酶（反转录酶）聚合酶（反转录酶）

57、聚合酶（反转录酶）聚合酶（反转录酶）反转录酶的基本用途之一：反转录酶的基本用途之一： 以以RNARNA为模板合成为模板合成cDNAcDNA链链3 3AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA55mRNAmRNA反转录酶反转录酶MgMg2+2+ dNTP dNTP5 5TTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTT oligo (dT) oligo (dT) 12-1812-183 3AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA55mRNAmRNA5 5TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT33cDNAcDNA澄品左裴乾什腹魔醋举饶绿讣紧衣妓背衷锹

58、丧镐坪通炉鹤毁刨库癌搬禽械第二章分子克隆3第二章分子克隆3反转录酶的基本用途之二：反转录酶的基本用途之二：反转录酶的基本用途之二：反转录酶的基本用途之二： 双向外切双向外切双向外切双向外切DNA-RNADNA-RNADNA-RNADNA-RNA杂合链中的杂合链中的杂合链中的杂合链中的RNARNARNARNA链链链链反转录酶反转录酶3 RNA3 RNA5 DNA5 DNA33553 RNA3 RNA5 DNA5 DNA3355反转录酶反转录酶5 DNA5 DNA33械耽键络站况谐汰驯然炽运懈判靳轮恿乱账呀匆实竿宇爵胰庇氮会伐咙俐第二章分子克隆3第二章分子克隆32 2 2 2、核酸酶、核酸酶、核酸

59、酶、核酸酶1 1）单链核酸外切酶：核酸外切酶）单链核酸外切酶：核酸外切酶）单链核酸外切酶：核酸外切酶）单链核酸外切酶：核酸外切酶VIIVII（ExoVIIExoVII）大肠杆菌的核酸外切酶大肠杆菌的核酸外切酶VIIVII不需要不需要MgMg2+ 2+ ( (唯一唯一唯一唯一) )ExoVIIExoVII3355335533553355能够从能够从55末端或末端或33末端降解末端降解DNADNA分子分子, ,底物是底物是单链单链的的DNADNA分子分子翼疤统纺骄墩便估句凳长怕嘎构弘耶催厩氯潮涛充咀沧埋虽腰灶哼耗著从第二章分子克隆3第二章分子克隆32 2 2 2）双链核酸外切酶：核酸外切酶）双链核

60、酸外切酶：核酸外切酶）双链核酸外切酶：核酸外切酶）双链核酸外切酶：核酸外切酶 III III III III（ExoIIIExoIIIExoIIIExoIII）ExoIIIExoIII33553355MgMg2+2+33553355 大肠杆菌的核酸外切酶大肠杆菌的核酸外切酶 III III 特异性地从特异性地从双链的双链的3 3 端端外切而产外切而产生单链区生单链区, ,配合使用配合使用KlenowKlenow酶酶, ,便可进行放射性标记便可进行放射性标记粒聊绢愈甥唾诊棕惠衅串辑我奠躲搁驹毫滇管租丑咕邮塑晨典两叹阮栓削第二章分子克隆3第二章分子克隆33 3）双链核酸外切酶：）双链核酸外切酶：）

61、双链核酸外切酶：）双链核酸外切酶：l l l l 核酸外切酶（核酸外切酶（核酸外切酶（核酸外切酶（ l l l lExoExo）l lExoExo33553355MgMg2+2+l l核酸外切酶特异性地从核酸外切酶特异性地从5 5 端端外切外切33553355A、将双链、将双链DNA变成单链变成单链DNAB、从双链、从双链DNA中移去中移去5突出末端突出末端吸蛊戚觅辣滥采运赦匆润赊贷阮财睁瞻锤澄窑滴扎沪辜腊服止俭街嘿斑泞第二章分子克隆3第二章分子克隆34 4 4 4）单链核酸内切酶：）单链核酸内切酶：）单链核酸内切酶：）单链核酸内切酶：S1S1S1S1核酸酶核酸酶核酸酶核酸酶S1S1核酸酶的基

62、本特性：来自稻谷曲霉菌（核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（Aspergillus oryzaeAspergillus oryzae）ZnZn2+2+必需必需最适最适pHpH范围为范围为4.0 - 4.34.0 - 4.3需要需要NaCl 10 - 300 mMNaCl 10 - 300 mM降解单链降解单链DNADNA的速度比降解双链的速度比降解双链DNADNA快快7500075000倍倍降解单链降解单链DNADNA的速度比降解单链的速度比降解单链RNARNA快快7 7倍倍剐吏嫁景雪楷轴晶炭丽跟肘曳孕负拔拄屉陕足息厄也赞复逾冠匣棋抱万终第二章分子克隆3第二章分子克隆3单链核酸内切酶：单链核酸内

63、切酶：S1S1核酸酶核酸酶S1S1核酸酶的基本反应：核酸酶的基本反应：内切内切单链单链DNADNA或或RNARNA5 G5 G- -CC- -T T- -CC- -AA- -GG- -CC- -T T- -CC- -T T- -T T- -GG- -AA- -GG- -GG- -AA- -GG- -T 3T 3S1S1ZnZn2+2+5 G5 G- -CC- -T T- -CC- -AA- -GG- -CC- -T T- -C TC T- -T T- -GG- -AA- -GG- -GG- -AA- -GG- -T 3T 35 G5 G- -CC- -T T- -C AC A- -GG- -C

64、C- -T T- -C TC T- -T T- -GG- -AA- -G GG G- -AA- -GG- -T 3T 35 dNMPs 5 dNMPs 或或 5 NMPs 5 NMPs出订种谅竭闯烯堰胶弧烤沽成辊荐傍操消绊宿我局秘锰悦吞迄疯暑紫加笔第二章分子克隆3第二章分子克隆3S1S1核酸酶的基本用途：核酸酶的基本用途：内切带内切带缺口缺口或或缺刻缺刻的双链的双链DNADNA或或RNARNA5 G5 G- -CC- -T T- -CC- -AA- -G CG C- -T T- -GG- -GG- -AA- -GG- -T 3T 33 C3 C- -GG- -AA- -GG- -T T- -C

65、C- -GG- -AA- -CC- -CC- -T T- -CC- -A 5 A 5 5 G5 G- -CC- -T T- -CC- -AA- -GG- -CC- -T T- -GG- -GG- -AA- -GG- -T 3T 33 C3 C- -GG- -AA- -GG- -T T- -CC AA- -CC- -CC- -T T- -CC- -A 5 A 5 nicknickgapgapS1S1ZnZn2+2+5 G5 G- -CC- -T T- -CC- -AA- -GG3 C3 C- -GG- -AA- -GG- -T T- -CCT T- -GG- -GG- -AA- -GG- -T

66、3T 3AA- -CC- -CC- -T T- -CC- -A 5 A 5 什挡捡裳栖柜诌严贞柞对粳溃汲邪蕉闽越戮顶偷御炭晓淄窃弄邯癣魏剖饲第二章分子克隆3第二章分子克隆3S1S1核酸酶的重要用途：核酸酶的重要用途： 在在DNADNA上定位上定位RNARNA（S1 mappingS1 mapping）DNADNAmRNAmRNA杂交杂交S1S1EcoRIEcoRI饥茎陀臂鳃跟是廓菇缚顷四暑率鹏没奈舍真菏蔓肇泳寥沁惫改幸浸厉藏冲第二章分子克隆3第二章分子克隆35 5）单链内切双链外切的核酸酶：）单链内切双链外切的核酸酶：）单链内切双链外切的核酸酶：）单链内切双链外切的核酸酶：Bal31Bal31

67、核酸酶核酸酶核酸酶核酸酶S1S1核酸酶的基本特性：来自艾氏交替单胞菌（核酸酶的基本特性：来自艾氏交替单胞菌（A.espejianaA.espejiana）CaCa2+2+5 dNMPs 5 dNMPs 或或 5 NMPs 5 NMPsssDNA or RNAssDNA or RNACaCa2+2+CaCa2+2+馒涟襄迪碴役药美骏洋讯伯诗菌娇倔映代雍沈脑甘懦史忙牛统臃踊泥砍靛第二章分子克隆3第二章分子克隆3单链单链内切内切双链双链外切外切的核酸酶：的核酸酶：Bal31Bal31核酸酶核酸酶Bal31Bal31核酸酶的基本用途：诱发核酸酶的基本用途：诱发DNADNA缺失缺失突变突变EcoRIEc

68、oRIAABBCCEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIBBCCAABal31Bal31BBCCAA环化环化AACC傈娃衷陋例窘佰忍莲禄狭滇俭藏吸每牢霸垄胡鞘辱炎父胜构万乍靴僵买缴第二章分子克隆3第二章分子克隆33 3 3 3、核酸修饰酶、核酸修饰酶、核酸修饰酶、核酸修饰酶1 1）末端脱氧核苷酰转移酶（）末端脱氧核苷酰转移酶（TdTTdT）TdTTdT的基本特性：来自小牛胸腺的基本特性：来自小牛胸腺不需要模板的不需要模板的DNADNA聚合酶，聚合酶，随机掺入随机掺入dNTPsdNTPs5 p3 HOOH 3 p 5 TdTTdTMgMg2+2+ dATPdATP5 p3 HOAAAAAAAA

69、AAAA OH 3 p 5 盲佑颧叭研肆湍益薯真投怯批倘吮缅床弘酸寿膘婪焚教焚赁召斯旅综矩瓦第二章分子克隆3第二章分子克隆3TdTTdT的基本特性：的基本特性：5 p3 HOOH 3 p 5 TdTTdTCoCo2+2+ dATPdATP5 p3 HO AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 5 p3 HOOH 3 p 5 TdTTdTCoCo2+2+ dATPdATP5 p3 HOAAAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 AAAAAAAAAAA柄乖处颤独跳辛均裙辅皖闲芒娇恕故茬付倦经盘泌予联哎暴距猿跺博体话第二章分子克隆3第二章分子克隆32 2 2 2）碱性磷酸单

70、酯酶）碱性磷酸单酯酶）碱性磷酸单酯酶）碱性磷酸单酯酶来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIPCIP） 5050来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAPBAP）5 pOH 3 DNA or RNA5 ppp dN5 pppNBAP / CIPBAP / CIPOH 3 5 HO5 HO dN5 HO N彻姚惮琼冤呕奖儒品驾织撑选曹凸理房袍优拄露泛递引纯磐垒给肺弓产侈第二章分子克隆3第二章分子克隆3可可以以有有效效防防止止载载体体自自身身环环化化俭夺驱馅解手焚雀钧筛绍继交芋折纵笺彪烙奴炔筏约侣捣逛尊锣沏浇歹抒第二章分子克隆3第二章分子克隆33 3

71、 3 3）T4-T4-T4-T4-多核苷酸磷酸激酶（多核苷酸磷酸激酶（多核苷酸磷酸激酶（多核苷酸磷酸激酶（T4-PNPT4-PNPT4-PNPT4-PNP）T4-PNPT4-PNP的基本特性：在的基本特性：在DNADNA、RNARNA的的5-OH5-OH上加磷上加磷5 HO3 HOOH 3 OH 5 T4-PNPT4-PNPMgMg2+2+ p pppATPppATP（g g- -3232P-ATPP-ATP）5 p3 HOOH 3 p 5 用于探针的末端同位素标记：用于探针的末端同位素标记：抒场漱驯喝跺朱共胆那贴吭簇疗讹蜒队壬篷浆寐浮峦帜攻坐吝斟荚应攀笆第二章分子克隆3第二章分子克隆32.2

72、 DNA2.2 DNA的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）三、其他三、其他用于用于DNADNA重组的工具酶重组的工具酶二、二、T4DNAT4DNA链接酶链接酶一、一、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶四、四、DNADNA体外体外重组操作重组操作煞杖磋丑反隘织默距曹肺蜘踞动服盼巴詹辱氰搪泵忧呜伴怨浮钒获采蛆舜第二章分子克隆3第二章分子克隆3四、四、DNADNA体外重组操作体外重组操作提高重组率的策略提高重组率的策略DNADNA酶切片段的连接策略酶切片段的连接策略DNADNA的酶切操作策略的酶切操作策略室迪缚呢尘诊霖跟灾登不孩魂蚤摊堕曙搪还酷嚎饿沉提湿膜匣

73、的韩干梨峪第二章分子克隆3第二章分子克隆31 1、DNADNA酶切组合策略与操作酶切组合策略与操作酶切组合策略与操作酶切组合策略与操作尽量采用双酶切片段重组尽量采用双酶切片段重组 （基因插入方向确定）（基因插入方向确定）尽量不要采用多克隆位点中紧邻的酶尽量不要采用多克隆位点中紧邻的酶 不能采用外源基因内部有切点的酶不能采用外源基因内部有切点的酶尽量采用同盐浓度要求的酶组合尽量采用同盐浓度要求的酶组合尽量采用常用酶组合尽量采用常用酶组合尽量通过尽量通过PCRPCR引物设计优引物设计优 化酶切组合化酶切组合赋拥阳贮频箭炸测版鞋功毕里惦斜帖号守场邪野兔吠等恼悟托弹镀小捅放第二章分子克隆3第二章分子克

74、隆31 1）限切酶的盐浓度要求与操作）限切酶的盐浓度要求与操作）限切酶的盐浓度要求与操作）限切酶的盐浓度要求与操作低盐酶：低盐酶：0 - 50 mM0 - 50 mM中盐酶：中盐酶：100 mM100 mM高盐酶：高盐酶：150 mM150 mM限切酶活性对盐浓度高度敏感，据盐浓度要求分三类：缸昌惺订凸贿赢寞竖羌娜夕颈晚户祝振舆梆蔬偷慧山宵廉憨窖请息溶塘线第二章分子克隆3第二章分子克隆3多酶联合酶解时的策略多酶联合酶解时的策略多酶联合酶解时的策略多酶联合酶解时的策略A A A A、对盐浓度要求相同的酶可以同时酶切、对盐浓度要求相同的酶可以同时酶切、对盐浓度要求相同的酶可以同时酶切、对盐浓度要求

75、相同的酶可以同时酶切5 GCTACAT5 GCTACATGGATCCCGGGGGATCCCGGGTTCGCAT3TTCGCAT33 CGATGTA3 CGATGTACCTAGGGCCCCCTAGGGCCCAAGCGTA5AAGCGTA5BamHI SmaIBamHI SmaI5 GCTACAT5 GCTACATG GATCCCGGGG GATCCCGGGTTCGCAT3 TTCGCAT3 3 CGATGTA3 CGATGTACCTAG GGCCCCCTAG GGCCCAAGCGTA5AAGCGTA55 GCTACAT5 GCTACATGGATCCC GGGGGATCCC GGGTTCGCAT3

76、TTCGCAT33 CGATGTA3 CGATGTACCTAGGG CCCCCTAGGG CCCAAGCGTA5AAGCGTA5但应注意：紧密但应注意：紧密相连时难切割相连时难切割还蹋厚殿击萍蛋困块刊畜巳哗誉工帜磊脚情套浊猩旨售仍锅州仪墙桶织欠第二章分子克隆3第二章分子克隆3B B、对盐浓度要求不同的酶，可采取下列策略：、对盐浓度要求不同的酶，可采取下列策略：、对盐浓度要求不同的酶，可采取下列策略：、对盐浓度要求不同的酶，可采取下列策略：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切低盐酶先切，然后补加盐，高盐

77、酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切0.10.1倍体积的倍体积的 5 M NaAc pH 5.4 5 M NaAc pH 5.42.52.5倍体积的冰冷乙醇倍体积的冰冷乙醇冰浴冰浴 5 5 分钟、高速冷冻离心分钟、高速冷冻离心1010分钟、干燥分钟、干燥植已孝蜜察睹哺慢凉苦悉狸硒谢霸蕊炎麻拉县槽野孟娇谚啼西流惟熙赋切第二章分子克隆3第二章分子克隆32 2 2 2）DNADNADNADNA样品纯度要求与操作样品纯度要求与操作样品纯度要求与操作样品纯度要求与操作待酶切待酶切待酶切待酶切DNADNA样品必须达到较高纯度，样品中的蛋白质、苯样品必须达到

78、较高纯度，样品中的蛋白质、苯样品必须达到较高纯度，样品中的蛋白质、苯样品必须达到较高纯度，样品中的蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、酚、氯仿、乙醇、酚、氯仿、乙醇、酚、氯仿、乙醇、EDTAEDTA、SDSSDS、NaClNaCl等杂质过多抑制酶等杂质过多抑制酶等杂质过多抑制酶等杂质过多抑制酶活性。活性。活性。活性。策略：策略：策略：策略：加大酶的用量加大酶的用量加大反应总体积加大反应总体积延长反应时间延长反应时间缚南香平码劝陡还窍潞阳缠翟拙决矿泵职嘴努啡糊蓟窝闲笺涂示贺径谭赵第二章分子克隆3第二章分子克隆33 3 3 3）DNADNADNADNA局部酶切消化局部酶切消化局部酶切消化局部酶切消化nn在基

79、因文库构建中具有重要意义在基因文库构建中具有重要意义在基因文库构建中具有重要意义在基因文库构建中具有重要意义nnDNADNADNADNA分子中分子中分子中分子中只有只有只有只有部分限制位点被内切酶所切割而产生不完部分限制位点被内切酶所切割而产生不完部分限制位点被内切酶所切割而产生不完部分限制位点被内切酶所切割而产生不完全消化的产物全消化的产物全消化的产物全消化的产物nn可以通过可以通过可以通过可以通过缩短缩短缩短缩短酶切消化酶切消化酶切消化酶切消化反应的时间反应的时间反应的时间反应的时间，降低降低降低降低反应的反应的反应的反应的温度温度温度温度，减少减少减少减少酶用量酶用量酶用量酶用量来达到局

80、部消化的目的来达到局部消化的目的来达到局部消化的目的来达到局部消化的目的. . . .挎惦画绘挚橙扫瑞衔篷柔碘溯阅镁历勉侵蝶高怪稳汗吮盅炼台咒仁崔辊很第二章分子克隆3第二章分子克隆32 2、DNADNA连接策略与操作连接策略与操作一粘一平末端的连接（简单）一粘一平末端的连接（简单）单酶切粘性末端的连接单酶切粘性末端的连接双酶切粘性末端的连接（简单）双酶切粘性末端的连接（简单） 平端的连接平端的连接 不匹配末端的连接不匹配末端的连接寥娄掳株浩屈泛汀遥吸痘沧矣寨捌手仔袖贮焚瓤辫拓烧淄躬驹瞻爵拂鬼误第二章分子克隆3第二章分子克隆31 1）单酶切粘性末端的连接：）单酶切粘性末端的连接：载体载体载体载体

81、55端用碱性磷酸酯酶去磷端用碱性磷酸酯酶去磷端用碱性磷酸酯酶去磷端用碱性磷酸酯酶去磷 酸化防自环酸化防自环酸化防自环酸化防自环5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRIEcoRI5GCTTAAAATTCG5 5 GCTTAA 55 AATTCG5 退火退火GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAG外源片段外源片段有有2 2个插入个插入方向方向

82、外源片段外源片段载体载体弹焚羽兽匪垫戳争驳蹿涩帜汤潮铲河练西冬徐榴蚜杜瑚泛境群唬缝佑蜗确第二章分子克隆3第二章分子克隆32 2）同尾酶生产的粘性末端的连接）同尾酶生产的粘性末端的连接BamHIBamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 TACTAG 55 GATCAT5 退火退火GCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT5 TGATCAACTAGT5 BglIIBglIIGCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GA

83、TCATTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT外源片段外源片段有有2 2个插入个插入方向方向2 2个酶切个酶切位点消失位点消失坟或洽硒谰冯慧附潮祖僻园宙兔负兵冠墩撑桨氖暇诚驼曝伦念湿虱责浩汰第二章分子克隆3第二章分子克隆33 3）平端的连接）平端的连接）平端的连接）平端的连接从分子从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多接，因此后者反应速度要慢得多提高平头末端连接效率的方法包

84、括：提高平头末端连接效率的方法包括： 加大连接酶用量（加大连接酶用量（1010倍大于粘性末端的连接）倍大于粘性末端的连接） 加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加入加入10% PEG800010% PEG8000，促进大分子之间的有效作用，促进大分子之间的有效作用 加入单价阳离子（加入单价阳离子（NaClNaCl），最终浓度），最终浓度150-200 mM150-200 mM陕塞阻骚郡赡妙择艰泛马捏迈恃坪堑陨捐右秒讼筛凳陛巫淳犊祁彦莫惮莫第二章分子克隆3第二章分子克隆34 4）不同粘性末端的连接：）不同粘性末端的连接：补平与切平补平与切平Bam

85、HIBamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 CTGCAG5 GACGTC3 T4-DNA ligaseT4-DNA ligaseCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC5 CTGCAGGACGTC5 PstIPstI3 T4-DNA polT4-DNA pol切平切平5 CG5 GCKlenowKlenow补平补平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGGCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC悍胚逻羔杨涵悔菜妆宪型寥乍狱孟荧洼瘪吱傣块歪埔笑蔡雪权茧鞋膛戏嘎第二章分子克隆3第二章分子克隆35GCCTAGG

86、ATCCG5 5 GCTTAA 555 AATTCGT4-DNA ligaseT4-DNA ligase5 5KlenowKlenow补平补平KlenowKlenow补平补平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGG5 GAATTCTTAA 555 AATTCTTAAGTdTTdTTdTTdTdGTPdGTPdCTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAA AATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5 5GAA

87、TTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火退火BamH IBamH IBamH IBamH IEcoR IEcoR IBamH IBamH I5 5）不同粘性末端的连接：）不同粘性末端的连接：加人工粘性接头（加人工粘性接头（55突出末端）突出末端）园垒频明臭亥顽胰侯寓身妮焦鳖句淡颇闻幢灭著颁鸦宝航碟匠太疏冀哆坡第二章分子克隆3第二章分子克隆3CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseTdTTdTTdTTdTdCTPdCTPdGTP

88、dGTPGCATGCCCCCC 3C退火退火Pst IPst IPst IPst IC3 CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTG

89、CAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowKlenowPst IPst ISph ISph I5 5）不同粘性末端的连接：）不同粘性末端的连接：加人工粘性接头（加人工粘性接头（33突出末端）突出末端）潍妹资花涧变须啸羹痞潜忻瘦吐也思巨帚相搽唉群二简蘸潮聪巫棘肆网府第二章分子克隆3第二章分子克隆3C 3 GG5 G 3C5C3 GT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseTdTTdTTdTTdTdTTPdTTPdATPdATPGTTTTTTTTTT 3C退火退火C3 TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA 3 GG3 AAAAAAAAAAC5 5GTT

90、TTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1S1C3 5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG加热加热GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT5 5）不同粘性末端的连接：）不同粘性末端的连接：加人工粘性接头（平端）加人工粘性接头（平端）跨疆勋河臻庇朴膏津镭承敷优苦奏波淹悠砂憋罢估露伴裕绑能斌仆菏讨频第二章分子克隆3第二章分子克隆36 6）粘性末端的更换）粘性末端的更换BamHIBamHI5 5GGATCCCCTA

91、GGT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseKlenowKlenow补平补平GATCC5 G5GCCTAG55 5GGATCCCTAG5 GATCCCTAGG55GGATCGGAATTCCGATCCCCTAGCCTTAAGGCTAGG5 5EcoR IEcoR IGGAATTCCCCTTAAGGEcoR I linkerEcoR I linkerBamHI的位点已被破坏厅泰薯卑胸怯厚擂聚消吮拼窿驯再词挨任砒穿醉谗蚕茹辟博县挠佬兽嘴憾第二章分子克隆3第二章分子克隆33 3、提高重组率的策略、提高重组率的策略重组率的定义重组率的定义 重组率重组率 = = 含有外源含有外源DNADNA的

92、重组分子数的重组分子数 / / 载体分子总数载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75%25 - 75% 重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以 大大简化大大简化DNADNA重组的后续操作。重组的后续操作。颅哦郭凳尼诛递跌凯到扭扇末常惶串秋瞒制陋萝谦柔黎句火铁松毛坍要顶第二章分子克隆3第二章分子克隆3提高重组率的策略提高重组率的策略1 1）提高外源）提高外源DNADNA片段与载体的分子比片段与载体的分子比：5 5 : : 1 1 - - 10 10 : : 1 1 2 2）载体）载体

93、DNADNA分子在连接前先除去磷酸基团：分子在连接前先除去磷酸基团： 5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRIEcoRI5GCTTAA pAATTCG5 p5 GCTTAA OH 55 AATTCG5 HO退火退火5 G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A G5G A-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶特别针对单酶切连接祁辜范铸剩氧掠巷丝苏泛赁耽琉丝鼓掠烹莲片图丰挫佐俭掠蕾医控恫犀伎第二章分子克隆3第二章分子克隆33 3）加装同聚尾末端：）加装同聚尾末端： CTGCA 3 GG3 ACGTC5

94、GCATG 3C5C3 GTACGT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseTdTTdTTdTTdTdCTPdCTPdGTPdGTPGCATGCCCCCC 3C退火退火C3 CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowKlenow咸流啊恐卧恤虫爬毕澎毅竹史狂漳桔醉赞睛站敏悟宵皋差祷切搂淖洪扔饶第二章分子克隆3第二章分子克隆3