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1、组织培养技术组织培养技术Tissue Culture Techniques(In Vitro Culture)概述概述. 绪言绪言/Introduction. 细胞生长的基本需要细胞生长的基本需要/ Basic requirement of Basic requirement of cell growthcell growth . 细胞培养的配备细胞培养的配备/Equipment. 清洁、消毒与灭菌清洁、消毒与灭菌/Cleaning , DisinfectionDisinfection and Sterilization. . 无菌操作无菌操作无菌操作无菌操作/Aseptic techniqu
2、e/Aseptic technique. . 培养细胞的形态培养细胞的形态培养细胞的形态培养细胞的形态/Morphology of culture cell/Morphology of culture cellI.绪言绪言/ Introduction1.1.概念概念概念概念/Concept/Concept2.2.发展史发展史发展史发展史/Developing/Developing history history3.3.应用应用应用应用/Application/Application1.概念概念n n体外培养体外培养体外培养体外培养/In vitro culture/In vitro cultu
3、re将动植物活体内取出的组织、细胞或器官等，放置将动植物活体内取出的组织、细胞或器官等，放置将动植物活体内取出的组织、细胞或器官等，放置将动植物活体内取出的组织、细胞或器官等，放置在类似体内生存环境中，使其维持、生长或繁殖的方在类似体内生存环境中，使其维持、生长或繁殖的方在类似体内生存环境中，使其维持、生长或繁殖的方在类似体内生存环境中，使其维持、生长或繁殖的方法。法。法。法。 whole culture microorganismwhole culture microorganism parasite parasite organ cultureorgan culture parts cul
4、ture tissue cultureparts culture tissue culture cell culture cell culture器官培养器官培养/Organ culturen n体体外外器器官官原原基基或或整整个个器器官官或或部部分分器器官官的的维维持持或或生长，包括结构和功能上的维持和分化。生长，包括结构和功能上的维持和分化。（The maintenance or growth of organ primordia or the whole or parts of an organ in vitro,in a way that may allow differentiati
5、on and preservation of the architecture and/or function.）Organ cultureOrgan culture 组织培养组织培养/Tissue culturen n体体体体外外外外组组组组织织织织的的的的维维维维持持持持或或或或生生生生长长长长，包包包包括括括括结结结结构构构构和和和和功功功功能能能能上上上上的维持和分化。的维持和分化。的维持和分化。的维持和分化。 （The The maintenance maintenance or or growth growth of of tissue tissue in in vitro,in
6、vitro,in a a way way that that may may allow allow differentiation differentiation and and preservation preservation of of the the architecture architecture and/or and/or function.function.）n n组织块（组织块（组织块（组织块（O.5O.51 1立方毫米）或薄片（厚立方毫米）或薄片（厚立方毫米）或薄片（厚立方毫米）或薄片（厚0.2 0.2 毫米）毫米）毫米）毫米）细胞培养细胞培养/Cell culturen
7、是指单细胞在体外培养。是指单细胞在体外培养。（This term is used to denote the growing of cell in vitro, including the culture of single cell. ）n通常体外培养中的单细胞不再形成组织。通常体外培养中的单细胞不再形成组织。n n细细细细胞胞胞胞培培培培养养养养也也也也称称称称为为为为组组组组织织织织培培培培养养养养（tissue tissue cultureculture），二者可作为同义语使用。二者可作为同义语使用。二者可作为同义语使用。二者可作为同义语使用。细胞培养的类型细胞培养的类型/Types
8、of cell culture（1 1）原代培养）原代培养）原代培养）原代培养/Primary culture/Primary culture（2 2）传代培养）传代培养）传代培养）传代培养/ / SubcultureSubculture （cell linecell line）（1） Primary culture直接来自活体的细胞（组织或器官）的初次培养。直接来自活体的细胞（组织或器官）的初次培养。直接来自活体的细胞（组织或器官）的初次培养。直接来自活体的细胞（组织或器官）的初次培养。（A culture start from cells,tissues or organs taken d
9、irectly from organisms.）n n严格地说，是指成功传代之前的培养，此时的细胞严格地说，是指成功传代之前的培养，此时的细胞严格地说，是指成功传代之前的培养，此时的细胞严格地说，是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。保留二倍体数。保留二倍体数。保留二倍体数。n n实际应用上，常把第一代至第十代以内的培养细胞实际应用上，常把第一代至第十代以内的培养细胞实际应用上，常把第一代至第十代以内的培养细胞
10、实际应用上，常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。统称为原代细胞培养。统称为原代细胞培养。统称为原代细胞培养。新生大鼠肺成纤维细胞（原代）新生大鼠肺成纤维细胞（原代）新生大鼠肺成纤维细胞（原代）新生大鼠肺成纤维细胞（原代）培养的天数：培养的天数：培养的天数：培养的天数：48h 48h 48h 48h 放大倍速：倒置显微镜放大倍速：倒置显微镜放大倍速：倒置显微镜放大倍速：倒置显微镜 X40X40X40X40培养基种类：培养基种类：培养基种类：培养基种类：1640+10%1640+10%1640+10%1640+10%小牛血清小牛血清小牛血清小牛血清 细胞状态与特征简述细胞状态与特征
11、简述细胞状态与特征简述细胞状态与特征简述: : : :细胞呈梭形，有细胞呈梭形，有细胞呈梭形，有细胞呈梭形，有伪足，边缘清晰整齐，贴壁生长伪足，边缘清晰整齐，贴壁生长伪足，边缘清晰整齐，贴壁生长伪足，边缘清晰整齐，贴壁生长幼兔骨髓基质干细胞（原代）：幼兔骨髓基质干细胞（原代）：幼兔骨髓基质干细胞（原代）：幼兔骨髓基质干细胞（原代）：细胞种类：幼兔骨髓基质干细胞细胞种类：幼兔骨髓基质干细胞细胞种类：幼兔骨髓基质干细胞细胞种类：幼兔骨髓基质干细胞 培养的天数：五天后培养的天数：五天后培养的天数：五天后培养的天数：五天后放大倍数：倒置显微镜放大倍数：倒置显微镜放大倍数：倒置显微镜放大倍数：倒置显微镜
12、 X40X40X40X40培养基种类：培养基种类：培养基种类：培养基种类：DMEM+20%DMEM+20%DMEM+20%DMEM+20%胎牛血清细胞胎牛血清细胞胎牛血清细胞胎牛血清细胞状态与特征简述状态与特征简述状态与特征简述状态与特征简述: : : :细胞呈梭形，有伪足，边缘清晰整齐，贴壁生长细胞呈梭形，有伪足，边缘清晰整齐，贴壁生长细胞呈梭形，有伪足，边缘清晰整齐，贴壁生长细胞呈梭形，有伪足，边缘清晰整齐，贴壁生长传代传代传代传代/passage or subculture/passage or subculturen n将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶的将细胞从一个培养瓶转移到另
13、外一个培养瓶的将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶的将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶的过程。过程。过程。过程。当当当当细胞增殖细胞增殖细胞增殖细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分达到一定密度后，则需要分离出一部分达到一定密度后，则需要分离出一部分达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞细胞细胞细胞和更新和更新和更新和更新营养液营养液营养液营养液，否则将影响细胞的继续生存，否则将影响细胞的继续生存，否则将影响细胞的继续生存，否则将影响细胞的继续生存 培养细胞的培养细胞的培养细胞的培养细胞的“一代一代一代一代”，不表示细胞分裂一次，而是，不表示细胞分裂一次，而是，不表示细胞分裂一次，而
14、是，不表示细胞分裂一次，而是指培养细胞从接种到再次转移培养的过程。指培养细胞从接种到再次转移培养的过程。指培养细胞从接种到再次转移培养的过程。指培养细胞从接种到再次转移培养的过程。原代培养细胞的生命归宿原代培养细胞的生命归宿原代培养细胞的生命归宿原代培养细胞的生命归宿n n原代培养期原代培养期原代培养期原代培养期n n传代期传代期传代期传代期n n衰退期衰退期衰退期衰退期（2）Subculture细胞系细胞系/Cell line原代培养成功后的细胞，传代再培养，称原代培养成功后的细胞，传代再培养，称原代培养成功后的细胞，传代再培养，称原代培养成功后的细胞，传代再培养，称细胞系。细胞系。细胞系。
15、细胞系。n n有限细胞系有限细胞系有限细胞系有限细胞系/ /FinitedFinited cell line cell linen n无限细胞系无限细胞系无限细胞系无限细胞系/ / infinitedinfinited cell line cell linen n有限细胞系有限细胞系有限细胞系有限细胞系/ /FinitedFinited cell line cell line 细细细细胞胞胞胞群群群群体体体体在在在在体体体体外外外外生生生生长长长长有有有有一一一一定定定定限限限限度度度度，即即即即体体体体外外外外传传传传代代代代（passage passage or or subculture
16、subculture）到到到到一一一一定定定定次次次次数数数数时时时时，细细细细胞停止繁殖、衰退、死亡。胞停止繁殖、衰退、死亡。胞停止繁殖、衰退、死亡。胞停止繁殖、衰退、死亡。 一般情况下可传代一般情况下可传代一般情况下可传代一般情况下可传代10-5010-50次。次。次。次。n n无限细胞系无限细胞系无限细胞系无限细胞系/ / infinitedinfinited cell line cell line 细胞群体能无限制生长下去，不进入衰退期。细胞群体能无限制生长下去，不进入衰退期。细胞群体能无限制生长下去，不进入衰退期。细胞群体能无限制生长下去，不进入衰退期。 肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤细细细细胞胞
17、胞胞系系系系可可可可无无无无限限限限增增增增殖殖殖殖；正正正正常常常常细细细细胞胞胞胞系系系系可可可可发发发发生生生生自自自自发发发发转化，使细胞获得永久增殖的能力。转化，使细胞获得永久增殖的能力。转化，使细胞获得永久增殖的能力。转化，使细胞获得永久增殖的能力。Infinited cell line: HelaHelan n细胞株细胞株细胞株细胞株（cell straincell strain）用单细胞分离培养或通过筛选的方法，从用单细胞分离培养或通过筛选的方法，从用单细胞分离培养或通过筛选的方法，从用单细胞分离培养或通过筛选的方法，从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或原代培养物或细胞系中
18、获得具有特殊性质或原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物称为细胞株标志物的培养物称为细胞株标志物的培养物称为细胞株标志物的培养物称为细胞株n n体内培养体内培养体内培养体内培养/In vivo culture/In vivo culture是将活体的组织细胞、器官等取出，放置在是将活体的组织细胞、器官等取出，放置在是将活体的组织细胞、器官等取出，放置在是将活体的组织细胞、器官等取出，放置在其它生物体内让其生长和发育的方法。其它生物体内让其生长和发育的方法。其它生物体内让其生长和发育的方法。其它生物体内让其生长和发育的方法。 器官移植器官移植/
19、transplantation干细胞干细胞/stem cell2.发展史发展史n1919世纪末，世纪末，20202020世纪初世纪初世纪初世纪初温生理盐水培养鸡胚髓板组织温生理盐水培养鸡胚髓板组织存活数天存活数天提出组提出组织培养织培养(tissue culture)(tissue culture)概念概念（ 1885 Roux1885 Roux1885 Roux1885 Roux ）血浆凝块试管中培养成年兔肝、肾、甲状腺、卵巢血浆凝块试管中培养成年兔肝、肾、甲状腺、卵巢植块植块3 3天天早期器官培养早期器官培养（ 1897 Loeb 1897 Loeb ）应用悬滴培养法，用动物血清培养狗的肉
20、瘤细胞，应用悬滴培养法，用动物血清培养狗的肉瘤细胞，存活约存活约7272小时。小时。（1906 Beebe1906 Beebe等）等）短期存活，没有细胞的生长和增殖。短期存活，没有细胞的生长和增殖。悬滴法培养蛙胚神经组织悬滴法培养蛙胚神经组织存活了几个星期存活了几个星期, ,且从培养的细胞中长出了轴突且从培养的细胞中长出了轴突完善了体外培养体系，体外培养技术的开始完善了体外培养体系，体外培养技术的开始 （ 1907 Harrison 1907 Harrison 1907 Harrison 1907 Harrison ）改良悬滴培养法培养鸡胚心肌细胞数年改良悬滴培养法培养鸡胚心肌细胞数年将无菌操
21、作技术（将无菌操作技术（aseptic techniqueaseptic technique）引入）引入体外培养体外培养发现动物体液中存在着对动物细胞生长有强烈发现动物体液中存在着对动物细胞生长有强烈促进作用的生长因子促进作用的生长因子 （ 1912 Carrel1912 Carrel1912 Carrel1912 Carrel ） n n1950s 1950s 1950s 1950s 培养技术培养技术培养技术培养技术快速发展快速发展无菌操作技术无菌操作技术无菌操作技术无菌操作技术/aseptic technique /aseptic technique 培养容器培养容器培养容器培养容器/ /
22、 culture flasksculture flasks抗生素抗生素抗生素抗生素/antibiotics /antibiotics 培养基培养基培养基培养基/medium/medium培养方法培养方法培养方法培养方法/culture methods/culture methodsmicrocarriermicrocarrier， hollow fiber culture 微栽体法微栽体法微栽体法微栽体法n nWezelWezelWezelWezel在在在在1967196719671967年首创年首创年首创年首创n n固体微珠直径约在固体微珠直径约在固体微珠直径约在固体微珠直径约在505050
23、50微米到数百微米之间微米到数百微米之间微米到数百微米之间微米到数百微米之间n n将细胞悬液和微载体混合孵育将细胞悬液和微载体混合孵育将细胞悬液和微载体混合孵育将细胞悬液和微载体混合孵育, , , ,待细胞贴附于微载体待细胞贴附于微载体待细胞贴附于微载体待细胞贴附于微载体上上上上, , , ,再转移至培养液中培养再转移至培养液中培养再转移至培养液中培养再转移至培养液中培养n n借助温和搅拌系统使细胞随载体均匀悬浮于培养液中，借助温和搅拌系统使细胞随载体均匀悬浮于培养液中，借助温和搅拌系统使细胞随载体均匀悬浮于培养液中，借助温和搅拌系统使细胞随载体均匀悬浮于培养液中，n n细胞就能够在微载体表面
24、迅速生长、增殖细胞就能够在微载体表面迅速生长、增殖细胞就能够在微载体表面迅速生长、增殖细胞就能够在微载体表面迅速生长、增殖, , , ,细胞浓度细胞浓度细胞浓度细胞浓度可高达可高达可高达可高达101010107 7 7 7个个个个/ml/ml/ml/ml。n n适于各种细胞的大规模培养适于各种细胞的大规模培养适于各种细胞的大规模培养适于各种细胞的大规模培养空心纤维法空心纤维法空心纤维法空心纤维法: : : :n n是是是是RichardRichardRichardRichardknazekknazekknazekknazek等在等在等在等在1972197219721972年创建的年创建的年创建
25、的年创建的n n空心纤维是一种由硅胶、聚砜、聚丙烯等材料构建的空心纤维是一种由硅胶、聚砜、聚丙烯等材料构建的空心纤维是一种由硅胶、聚砜、聚丙烯等材料构建的空心纤维是一种由硅胶、聚砜、聚丙烯等材料构建的可透性滤膜可透性滤膜可透性滤膜可透性滤膜, , , ,外径约为外径约为外径约为外径约为1/31/31/31/33/4mm,3/4mm,3/4mm,3/4mm,表面具有海表面具有海表面具有海表面具有海绵状多孔结构绵状多孔结构绵状多孔结构绵状多孔结构, , , ,既能使水分子、营养物质和气体透过既能使水分子、营养物质和气体透过既能使水分子、营养物质和气体透过既能使水分子、营养物质和气体透过, , ,
26、,也能使细胞在上面贴附生长。也能使细胞在上面贴附生长。也能使细胞在上面贴附生长。也能使细胞在上面贴附生长。n n当细胞密度达到当细胞密度达到当细胞密度达到当细胞密度达到101010107 7 7 7101010108 8 8 8个个个个/ml/ml/ml/ml时时时时, , , ,逐渐用无血逐渐用无血逐渐用无血逐渐用无血清培养液代替含血清培养液。此时细胞不再增殖清培养液代替含血清培养液。此时细胞不再增殖清培养液代替含血清培养液。此时细胞不再增殖清培养液代替含血清培养液。此时细胞不再增殖, , , ,但但但但能正常生活并继续分泌所需的蛋白质或其他生物制品。能正常生活并继续分泌所需的蛋白质或其他生
27、物制品。能正常生活并继续分泌所需的蛋白质或其他生物制品。能正常生活并继续分泌所需的蛋白质或其他生物制品。n n在生产激素和单抗时被广泛应用。在生产激素和单抗时被广泛应用。在生产激素和单抗时被广泛应用。在生产激素和单抗时被广泛应用。3. 应用应用n n细胞生物学细胞生物学细胞生物学细胞生物学/cell/cell/cell/cell biology biology biology biology形态、发育、营养、代谢、病变等形态、发育、营养、代谢、病变等n n遗传学遗传学遗传学遗传学/genetics/genetics/genetics/genetics染色体分析、细胞融合、杂交、转基因等染色体分
28、析、细胞融合、杂交、转基因等n n病毒学病毒学病毒学病毒学/virology/virology/virology/virology病毒培养病毒培养n n免疫学免疫学免疫学免疫学/immunology/immunology/immunology/immunology细胞因子细胞因子n n细胞毒试验细胞毒试验细胞毒试验细胞毒试验/cytotoxic/cytotoxic/cytotoxic/cytotoxic test test test test检测有毒物质并判断其强弱（对检测有毒物质并判断其强弱（对药品、化妆品、食品添药品、化妆品、食品添加剂、杀虫剂等进行筛选和安全评估）加剂、杀虫剂等进行筛选和
29、安全评估） n n生物制品生物制品生物制品生物制品/biologic/biologic/biologic/biologic product (biologics) product (biologics) product (biologics) product (biologics)疫苗、干扰素、激素、酶、生长因子、单克隆抗体等疫苗、干扰素、激素、酶、生长因子、单克隆抗体等n n干细胞培养干细胞培养干细胞培养干细胞培养/stem/stem/stem/stem cell culture cell culture cell culture cell culture细胞定向诱导分化、移植细胞定向诱导分
30、化、移植n n肿瘤细胞培养肿瘤细胞培养肿瘤细胞培养肿瘤细胞培养/ / / /tumourtumourtumourtumour cell cell cell cell cultureculturecultureculture肿瘤细胞生物学特性、肿瘤细胞发生发展、筛选抗癌药肿瘤细胞生物学特性、肿瘤细胞发生发展、筛选抗癌药物物应用体外培养技术的优点应用体外培养技术的优点1.1.细胞种类广泛（从低等动物到高等动物，从细胞种类广泛（从低等动物到高等动物，从胚胎到成体，从正常组织到肿瘤细胞）。胚胎到成体，从正常组织到肿瘤细胞）。2.2.能长时间直接观察活细胞的形态结构、生命能长时间直接观察活细胞的形态结构
31、、生命活动及细胞变化，便于监控和检测，甚至定活动及细胞变化，便于监控和检测，甚至定量。量。3.3.研究样本的均一性强。研究样本的均一性强。 4.4.易于采用物理、化学和生物因素等进行实验易于采用物理、化学和生物因素等进行实验研究。研究。5.5.研究所需费用相对体内实验较为经济。研究所需费用相对体内实验较为经济。应用体外培养技术的不足之处应用体外培养技术的不足之处1.1.任何组织或细胞置于体外培养后，其细胞形任何组织或细胞置于体外培养后，其细胞形态和功能都会发生一定程度的改变，不能将态和功能都会发生一定程度的改变，不能将其与体内的细胞完全等同。其与体内的细胞完全等同。2.2.在应用传代细胞时，反复长期传代可能导致在应用传代细胞时，反复长期传代可能导致染色体的改变。染色体的改变。3.3.不能体现生物整体效应不能体现生物整体效应
