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1、第三章第三章细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法进行初步观察进行初步观察形成可验证的假说形成可验证的假说设计对照试验设计对照试验收集资料收集资料解释结果解释结果作出合理结论作出合理结论查阅已查阅已有知识有知识细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法细胞培养、细胞工程与显微操作技术细胞培养、细胞工程与显微操作技术一、细胞形态结构的观察方法一、细胞形态结构的观察方法光学显微镜技术光学显微镜技术（Light microscopy）电子显微镜技术电子显微镜技术（Electron microscopy）扫描隧道显微镜技术扫描隧道
2、显微镜技术（scanning tunneling microscopy） （一）光学显微镜技术（一）光学显微镜技术普通复式光学显微镜技术普通复式光学显微镜技术（Light microscopy）相差显微镜技术相差显微镜技术（Phase-contrast microscopy）微分干涉显微镜技术微分干涉显微镜技术（Differential-interference microscopy）荧光显微镜技术荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy）激光扫描共焦显微镜激光扫描共焦显微镜（ Laser scanning confocal Microscope ）1 1、普通光学显微镜
3、技术、普通光学显微镜技术结构结构光学放大系统：物镜和目镜光学放大系统：物镜和目镜照明系统：光源和聚光镜照明系统：光源和聚光镜镜架及样品调节系统镜架及样品调节系统分辨率分辨率：指区分开两个质点间的：指区分开两个质点间的最小最小距离距离。d=0.61/ NA d=0.61/ NA （NA= sinNA= sin） d d：分辨率分辨率 ：波长波长 NANA：数值孔径数值孔径 ：物镜与物体间介质折射率物镜与物体间介质折射率 ：光束进入物镜的半角光束进入物镜的半角2 2、相差显微镜技术、相差显微镜技术相差显微镜相差显微镜与普通显微镜的与普通显微镜的区别区别：添加添加“环状光阑环状光阑”和在物镜后焦面上
4、的和在物镜后焦面上的“相差相差板板”，偏转的光线分别通过相差板的不同区域，偏转的光线分别通过相差板的不同区域，由于相差板上部分区域有吸光物质，使两组光由于相差板上部分区域有吸光物质，使两组光线之间增添了新的线之间增添了新的光程差光程差，从而对样品不同密，从而对样品不同密度造成的相位差起度造成的相位差起“夸大夸大”作用。最后这两组作用。最后这两组光线经过透镜又会聚成一束，发生互相叠加或光线经过透镜又会聚成一束，发生互相叠加或抵消的干涉现象，表现出肉眼可见的抵消的干涉现象，表现出肉眼可见的明暗区别明暗区别。相差显微镜将相差显微镜将光程差或相位差转换为振幅差光程差或相位差转换为振幅差，即，即明暗差别
5、明暗差别。相差显微镜的样品不需染色，可以。相差显微镜的样品不需染色，可以观观察察活细胞活细胞。光线通过不同密度的物质时，其滞留程度也不光线通过不同密度的物质时，其滞留程度也不同，密度大则光的滞留时间长，密度小则滞留同，密度大则光的滞留时间长，密度小则滞留时间短。时间短。3 3、微分干涉显微镜技术、微分干涉显微镜技术以平面偏振光为光源。光线经棱镜折射后分为以平面偏振光为光源。光线经棱镜折射后分为两束，在不同时间经过样品的相邻部位，然后两束，在不同时间经过样品的相邻部位，然后再经过另一棱镜将这两束光汇合，使样品中再经过另一棱镜将这两束光汇合，使样品中厚厚度上的微小区别度上的微小区别转化成转化成明暗
6、区别明暗区别，增加了样品，增加了样品反差且具有立体感。反差且具有立体感。适于研究适于研究活细胞活细胞。4 4、荧光显微镜技术、荧光显微镜技术原理原理：荧光物质，激发光，发射光：荧光物质，激发光，发射光仪器：点光源（高压汞灯），滤色系统仪器：点光源（高压汞灯），滤色系统荧光：荧光：自发荧光：如叶绿素、维生素自发荧光：如叶绿素、维生素A诱发荧光：甲醛蒸汽处理诱发细胞和组织中诱发荧光：甲醛蒸汽处理诱发细胞和组织中的生物单胺类产生荧光的生物单胺类产生荧光荧光染料染色荧光荧光染料染色荧光应用应用5 5、激光扫描共焦显微镜、激光扫描共焦显微镜（二）电子显微镜技术（二）电子显微镜技术电子显微镜的基本知识电子
7、显微镜的基本知识电镜与光镜的比较电镜与光镜的比较电子显微镜的基本构造电子显微镜的基本构造电镜与光镜光路图的比较电镜与光镜光路图的比较主要电镜制片技术主要电镜制片技术超薄切片技术超薄切片技术负染色技术负染色技术冷冻蚀刻技术冷冻蚀刻技术电镜三维重构技术电镜三维重构技术扫描电镜扫描电镜（SEM，Scanning electron microscope）显微镜显微镜分辨本领分辨本领光源光源透镜透镜真空真空成像原理成像原理LMTEM200nm0.2nm可见光400-700nm 电子束0.01-0.9nm玻璃透镜电磁透镜不要求真空要求真空1.3310-51.3310-3Pa利用样品对光的吸收形成明暗反差和
8、颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差电镜与光镜的比较电镜与光镜的比较1 1、超薄切片技术、超薄切片技术2 2、负染色技术、负染色技术负染色：利用电子密度比标本高的重金负染色：利用电子密度比标本高的重金属盐（如磷钨酸、乙酸双氧铀等）将生属盐（如磷钨酸、乙酸双氧铀等）将生物标本包围起来，增强背景散射电子的物标本包围起来，增强背景散射电子的能力以提高反差，在能力以提高反差，在暗的背景暗的背景下显示标下显示标本的形态结构。本的形态结构。3 3、冷冻蚀刻技术、冷冻蚀刻技术方法方法冰冻冰冻 快速低温冷冻法快速低温冷冻法将样品在液氮或液氦中迅速冷冻将样品在液氮或液氦中迅速冷冻断裂断裂低温下断裂低温
9、下断裂蚀刻蚀刻复型复型冷冻蚀刻技术主要用来观察断裂面的蛋白冷冻蚀刻技术主要用来观察断裂面的蛋白质颗粒和膜表面形貌特征，样品质颗粒和膜表面形貌特征，样品不需包埋、不需包埋、固定固定，能更好地保持样品的真实结构。，能更好地保持样品的真实结构。4 4、电镜三维重构技术、电镜三维重构技术电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。成的具有重要应用前景的一门新技术。电镜三维重构技术与电镜三维重构技术与X-X-射线晶体衍射技术及核磁共振射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前分析技术相结合，是当前结构生物学结构生物学
10、（Structural Structural BiologyBiology）主要研究生物大分子空间结构及其相互主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。关系的主要实验手段。5 5、扫描电子显微镜技术、扫描电子显微镜技术特点：景深大，提供表面结构的立特点：景深大，提供表面结构的立体图象，体图象， 分辨率大约为分辨率大约为6 6nm (60nm (60埃埃) )样品制备：暴露样品制备：暴露 - - 固定固定 - - 干燥干燥 - - 镀膜镀膜光镜、透射电镜、扫描电镜的比较光镜、透射电镜、扫描电镜的比较（三）扫描隧道显微镜技术（三）扫描隧道显微镜技术原理原理：量子力学中的隧道效应：量子力
11、学中的隧道效应装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。特点：特点：分辨本领高，（侧分辨率为分辨本领高，（侧分辨率为0.10.10.20.2nmnm，纵分辨率纵分辨率可达可达0.0010.001nmnm）；）；可在真空、大气、液体等多种条件下工作；可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测量。非破坏性测量。用途：纳米生物学研究领域中的重要工具用途：纳米生物学研究领域中的重要工具 二、细胞组分的分析方法二、细胞组分的分析方法细胞组分的分离技术细胞组分的分离技术特异蛋白抗原的定位
12、与定性特异蛋白抗原的定位与定性细胞内特异核酸的定位与定性细胞内特异核酸的定位与定性定量细胞化学分析与细胞分选技术定量细胞化学分析与细胞分选技术（一）细胞组分的分离技术（一）细胞组分的分离技术离心分离离心分离层析分离层析分离电泳分离电泳分离1 1、离心分离技术、离心分离技术原理原理类型类型差速离心差速离心密度梯度离心密度梯度离心密度梯度离心密度梯度离心将待分离细胞组分小心地铺放在含有密将待分离细胞组分小心地铺放在含有密度逐渐增加的、高溶解性的惰性物质度逐渐增加的、高溶解性的惰性物质（如蔗糖）形成的密度梯度溶液表面，（如蔗糖）形成的密度梯度溶液表面，通过重力或离心力的作用使样品中不同通过重力或离心
13、力的作用使样品中不同组分以不同的沉降率沉降，形成不同的组分以不同的沉降率沉降，形成不同的沉降带。沉降带。类型类型速度沉降速度沉降：主要用于分离密度相近而大小不一：主要用于分离密度相近而大小不一的细胞组分。（介质：蔗糖）的细胞组分。（介质：蔗糖）等密度沉降等密度沉降：分离不同密度的细胞组分。（介：分离不同密度的细胞组分。（介质：氯化铯）质：氯化铯）2 2、大分子分离、大分子分离-层析技术层析技术离子交换离子交换凝胶过滤凝胶过滤亲和层析亲和层析3 3、电泳技术、电泳技术聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳双向电泳双向电泳琼脂糖凝胶电泳（核酸）琼脂糖凝胶电泳（核酸）（二）特异蛋白抗原的定位与定性（二
14、）特异蛋白抗原的定位与定性原理原理：利用免疫反应定位组织或细胞中：利用免疫反应定位组织或细胞中抗原成分分布的一类技术。抗原成分分布的一类技术。类型：类型：免疫荧光技术免疫荧光技术免疫印迹反应免疫印迹反应免疫电镜技术免疫电镜技术免疫铁蛋白技术免疫铁蛋白技术免疫酶标技术免疫酶标技术免疫胶体金技术免疫胶体金技术（三）细胞内特异核酸的定位与定性（三）细胞内特异核酸的定位与定性原位杂交技术原位杂交技术放射性同位素标记放射性同位素标记：利用放射性核素所放射：利用放射性核素所放射出来的射线作用于感光材料的出来的射线作用于感光材料的AgClAgCl晶体，从晶体，从而产生潜影，并通过显影过程把而产生潜影，并通过
15、显影过程把“像像”显示显示出来，以研究用放射性核素标记的物质在生出来，以研究用放射性核素标记的物质在生物体内的定位和定量的一种技术。物体内的定位和定量的一种技术。生物素标记生物素标记（四）定量细胞化学分析与细胞分选技术（四）定量细胞化学分析与细胞分选技术细胞成分的细胞化学显示方法细胞成分的细胞化学显示方法福尔根反应：测定福尔根反应：测定DNADNA含量含量PASPAS反应：检测多糖反应：检测多糖苏丹苏丹染色：检测脂滴染色：检测脂滴米伦反应：检测蛋白质米伦反应：检测蛋白质流式细胞术流式细胞术可定量测定细胞中可定量测定细胞中DNADNA、RNARNA或某一特异的标记或某一特异的标记蛋白的含量，以及
16、细胞群体中上述成分含量不蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量；它还可以将某一特异染色的同的细胞的数量；它还可以将某一特异染色的细胞从数以万计的细胞群体中分离出来，以及细胞从数以万计的细胞群体中分离出来，以及将将DNADNA含量不同的中期染色体分离出来，甚至可含量不同的中期染色体分离出来，甚至可用于细胞的分选。用于细胞的分选。三、细胞培养与细胞工程三、细胞培养与细胞工程细胞培养细胞培养细胞工程细胞工程（一）细胞培养技术（一）细胞培养技术动物细胞培养动物细胞培养1)1)原代细胞培养原代细胞培养2)2)传代细胞培养传代细胞培养3)3)培养方法：贴壁培养、悬浮培养培养方法：贴壁培养、
17、悬浮培养植物细胞培养植物细胞培养1)1)愈伤组织诱导愈伤组织诱导 4) 4) 细胞悬浮培养细胞悬浮培养2)2)继代培养继代培养 5) 5) 细胞团或愈伤组织再形成细胞团或愈伤组织再形成3)3)单细胞分离单细胞分离 6) 6) 植株的再生植株的再生（二）细胞工程（二）细胞工程细胞融合细胞融合（cell fusion）与细胞杂交与细胞杂交（cell hybridization）技术技术重组重组DNA技术技术单克隆抗体单克隆抗体（monoclone antibody）技术技术细胞拆合与显微操作技术细胞拆合与显微操作技术1、细胞融合技术、细胞融合技术两种或两种以上细胞融合在一起的两种或两种以上细胞融合
18、在一起的技术技术病毒诱导，病毒诱导，PEGPEG，电击融合电击融合植物和微生物用原生质体植物和微生物用原生质体应用：很广，如杂交瘤应用：很广，如杂交瘤2 2、重组、重组DNADNA技术技术传统的传统的DNADNA扩增：扩增：分子克隆法分子克隆法聚合酶链反应聚合酶链反应PCRPCR (polymerase chain reaction) DNADNA顺序分析顺序分析PCRPCR1983年由美国年由美国PE-Cetus公司的公司的Mullis等发等发明，明，1985年公开报道的一种体外核酸扩年公开报道的一种体外核酸扩增系统。增系统。原理：由引物（模板片段两端的已知序原理：由引物（模板片段两端的已知
19、序列）介导，聚合酶（如列）介导，聚合酶（如Taq DNA聚合酶，聚合酶，依赖于模板）催化底物（依赖于模板）催化底物（4种脱氧核苷酸）种脱氧核苷酸），在体外进行特异，在体外进行特异DNA（目的基因等）目的基因等）扩增（或合成）的一种方法。扩增（或合成）的一种方法。步骤：步骤：变性：加热使模板变性：加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条双链间的氢键断裂而形成两条单链；单链；退火：突然降温后模板与引物按碱基配对原则互补结退火：突然降温后模板与引物按碱基配对原则互补结合；合；延伸：在延伸：在DNA聚合酶及镁离子等存在的条件下，以单聚合酶及镁离子等存在的条件下，以单核苷酸为底物，从引物的核苷酸为底物
20、，从引物的3端开始合成，形成了与模板端开始合成，形成了与模板链互补的新链互补的新DNA链。链。循环一次，循环一次，DNA量增加一倍；经过量增加一倍；经过25-30个循环，个循环，DNA可扩增可扩增106-109倍。倍。优点：快速（数小时）、灵敏（优点：快速（数小时）、灵敏（ng）、）、操作简便操作简便（自动化）等。（自动化）等。3、单克隆抗体技术、单克隆抗体技术19751975年英国科学家年英国科学家MilsteinMilstein和和KohlerKohler将产生抗体的淋将产生抗体的淋巴细胞同肿瘤细胞融合，成功建立了单克隆抗体技术，巴细胞同肿瘤细胞融合，成功建立了单克隆抗体技术，获得获得19
21、841984年诺贝尔医学和生理学奖。年诺贝尔医学和生理学奖。 每个每个B B淋巴细胞仅淋巴细胞仅专一地产生、分泌一种专一地产生、分泌一种针对某种抗原针对某种抗原决定簇的特异性抗体，而肿瘤细胞可以决定簇的特异性抗体，而肿瘤细胞可以无限增殖无限增殖，因，因此杂交瘤细胞可在体外培养或移植到体内条件下分泌此杂交瘤细胞可在体外培养或移植到体内条件下分泌大量单克隆抗体。大量单克隆抗体。单克隆抗体技术的最主要优点是可以用不纯的抗原分单克隆抗体技术的最主要优点是可以用不纯的抗原分子大量制备纯一的单克隆抗体。子大量制备纯一的单克隆抗体。4、显微操作技术、显微操作技术仪器：仪器：显微操作仪显微操作仪显微操作的应用
22、显微操作的应用v显微注射：标记蛋白、外源显微注射：标记蛋白、外源DNADNA的导入的导入v核移植核移植v转基因动植物转基因动植物v动物克隆动物克隆动物克隆动物克隆生物繁殖后代通常是以精、卵细胞结合的生物繁殖后代通常是以精、卵细胞结合的有性生殖方式进行。有性生殖方式进行。通过营养体细胞繁殖个体的方法称为无性通过营养体细胞繁殖个体的方法称为无性繁殖。繁殖。克隆是指离体条件下的无性繁殖克隆是指离体条件下的无性繁殖。19811981年年Illmenses Illmenses 率先报告用小鼠幼胚细率先报告用小鼠幼胚细胞核克隆出正常小鼠。随后，胞核克隆出正常小鼠。随后，19841984年年Willadse
23、nWilladsen用未成熟羊胚细胞核克隆出一头用未成熟羊胚细胞核克隆出一头羊。羊。英国英国PPIPPI生物技术的罗斯林（生物技术的罗斯林（RoslinRoslin）研究所的维尔穆特研究所的维尔穆特( (Wilmut)Wilmut)博士博士19971997年年2 2月月2727日在世界著名权威杂志日在世界著名权威杂志NatureNature宣布的用乳腺细胞的细胞核宣布的用乳腺细胞的细胞核克隆出一只绵羊克隆出一只绵羊“多莉多莉 ( (Dolly) ”Dolly) ”的的消息。消息。“多莉多莉”的诞生，既的诞生，既说明了体细说明了体细胞核的遗传全能性胞核的遗传全能性，也翻开了人类以体，也翻开了人类
24、以体细胞核竞相克隆哺乳动物的新篇章。此细胞核竞相克隆哺乳动物的新篇章。此项技术因而荣登美国项技术因而荣登美国ScienceScience周刊周刊评出的评出的1997 1997 年十大科学发现的榜首。年十大科学发现的榜首。绵羊绵羊B B乳腺细胞核乳腺细胞核易核卵易核卵融合卵融合卵绵羊绵羊C C子宫子宫多莉多莉植入植入植入植入生产生产克克隆隆多多莉莉羊羊示示意意图图取出取出未受精卵未受精卵去核去核电激电激体外胚胎发育体外胚胎发育绵羊绵羊A A“多莉多莉”的产生与三只母羊有关；一只是芬兰的产生与三只母羊有关；一只是芬兰多塞特母绵羊，两只是苏格兰黑面母绵羊。芬多塞特母绵羊，两只是苏格兰黑面母绵羊。芬兰
25、多塞特母绵羊提供了全套遗传信息，即提供兰多塞特母绵羊提供了全套遗传信息，即提供了细胞核（称之为供体）；一只苏格兰黑面母了细胞核（称之为供体）；一只苏格兰黑面母绵羊提供无细胞核的卵细胞；另一只苏格兰黑绵羊提供无细胞核的卵细胞；另一只苏格兰黑面母绵羊提供羊胚胎的发育环境面母绵羊提供羊胚胎的发育环境子宫，是子宫，是“多莉多莉”羊的羊的“生生”母。母。 克隆技术将对克隆技术将对2121世纪产生的重大影响世纪产生的重大影响遗传素质完全一致的克隆动物将更有利于开展对遗传素质完全一致的克隆动物将更有利于开展对动物动物( (人人) )生长、发育、衰老和健康等机理的研究；生长、发育、衰老和健康等机理的研究；有利
26、于大量培养品质优良的家畜有利于大量培养品质优良的家畜; ; 经转基因的克隆哺乳动物，将能为人类提供源源经转基因的克隆哺乳动物，将能为人类提供源源不断的廉价的药品、保健品以及较易被人体接受不断的廉价的药品、保健品以及较易被人体接受的移植器官；的移植器官； 科学家将很快地从目前的同种克隆技术推进到异科学家将很快地从目前的同种克隆技术推进到异种克隆种克隆, ,即借腹怀胎的新领域即借腹怀胎的新领域, ,这无疑将大大促进这无疑将大大促进对濒临灭种的哺乳动物的保护工作。对濒临灭种的哺乳动物的保护工作。 伦理与社会问题伦理与社会问题光镜样品制备光镜样品制备Phase-contrast microscope
27、andDifferential-interference microscopeA comparison of yeast cells that were growing on the vaginal epithelium seen with different types of LM.a)under bright-field;b)phase-contrast;c)DIC电子显微镜的基本构造电子显微镜的基本构造S=(dx/dt)/2x =110-13sec.差速离心差速离心等电聚焦电泳等电聚焦电泳直接免疫荧光标记与间接免疫荧光标记技术直接免疫荧光标记与间接免疫荧光标记技术免疫印迹（免疫印迹（westernwesternblottingblotting）SDS-PAGESDS-PAGE（或双向电泳）或双向电泳）转移转移到膜上到膜上免疫显色免疫显色多莉克隆猴
