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1、实验六、吲哚乙酸氧化酶活性的测定南京师范大学 生命科学学院一，实验目的与要求一，实验目的与要求了解吲哚乙酸氧化酶的生理功能和分了解吲哚乙酸氧化酶的生理功能和分布；布；掌握测定植物体吲哚乙酸氧化酶活性掌握测定植物体吲哚乙酸氧化酶活性的方法。的方法。二，实验材料与试剂二，实验材料与试剂1，材料 绿豆幼苗的下胚轴。2，试剂20mmol/L的磷酸缓冲液（pH6.0)；1mmol/L的2、4-二氯酚；1mmol/L的氯化锰；200ug/mL 的吲哚乙酸（少量乙醇溶解后定容）；试剂B：0.5mol/LFeCl3-35%过氯酸(V:V=1:50)， (使用前混合，避光保存）。三、实验原理三、实验原理1、知识
2、背景 知识背景：知识背景：植物的生长物质植物的生长物质定义：调节植物生长发育的物质。分类：1、植物激素（plant hormone） 在植物体内合成植物体内合成、并从产生处运送到别处，对发育产生显著作用显著作用的微量有机物；2、一些具有植物激素活性的人工合成人工合成物质。五大类激素的生理功能五大类激素的生理功能种种 类类主要生理作用主要生理作用生长素促进促进促进促进生长、生长、 促进生根、发芽促进生根、发芽赤霉素促进促进促进促进细胞伸长、促进种子萌发、细胞伸长、促进种子萌发、果实成熟果实成熟细胞分裂素促进促进促进促进细胞分裂细胞分裂脱落酸抑制抑制抑制抑制细胞分裂、促进叶、果实衰细胞分裂、促进叶
3、、果实衰老脱落老脱落乙 烯促进促进促进促进果实的成熟果实的成熟五大类激素的产生部位五大类激素的产生部位种种 类类主要合成部位主要合成部位生长素主要在主要在幼嫩的芽、叶、发育的种子幼嫩的芽、叶、发育的种子幼嫩的芽、叶、发育的种子幼嫩的芽、叶、发育的种子赤霉素未成熟的种子、幼根、幼芽未成熟的种子、幼根、幼芽细胞分裂素主要是根尖主要是根尖脱落酸根冠、萎蔫的叶片等根冠、萎蔫的叶片等乙 烯植物体各个部位。植物体各个部位。生长素是什么19341934年提取：年提取：吲哚乙酸吲哚乙酸（IAAIAA）苯乙酸（苯乙酸（PAAPAA）吲哚丁酸（吲哚丁酸（IBAIBA）具有生长素效应的还有：具有生长素效应的还有：生
4、长素的发现生长素的发现燕麦胚芽鞘燕麦胚芽鞘燕麦胚芽鞘燕麦胚芽鞘Darwin的向光性实验燕麦胚芽鞘去除顶端燕麦胚芽鞘去除顶端燕麦胚芽鞘去除顶端燕麦胚芽鞘去除顶端Darwin的向光性实验燕麦胚芽鞘燕麦胚芽鞘燕麦胚芽鞘燕麦胚芽鞘加加加加不透明不透明不透明不透明帽子帽子帽子帽子燕麦胚芽鞘燕麦胚芽鞘燕麦胚芽鞘燕麦胚芽鞘加加加加透明透明透明透明帽子帽子帽子帽子达尔文的推测达尔文的推测： 单侧光照射使胚芽鞘的单侧光照射使胚芽鞘的尖端尖端产生某种产生某种刺激，当这种刺激传递到下部的伸长区时，刺激，当这种刺激传递到下部的伸长区时，会造成背光面比向光面生长快，因而出现会造成背光面比向光面生长快，因而出现向光性弯曲
5、。向光性弯曲。詹森的实验（1910）和拜尔的实验（1914）詹森实验证明：詹森实验证明： 胚芽鞘尖端产生的刺激胚芽鞘尖端产生的刺激物可以透过琼脂片。物可以透过琼脂片。拜尔实验证明：拜尔实验证明： 弯曲生长是因为顶尖产弯曲生长是因为顶尖产生的刺激物分布不均匀生的刺激物分布不均匀造成的。造成的。燕麦胚芽鞘燕麦胚芽鞘燕麦胚芽鞘燕麦胚芽鞘去除顶端，加琼脂块去除顶端，加琼脂块去除顶端，加琼脂块去除顶端，加琼脂块燕麦胚芽鞘燕麦胚芽鞘燕麦胚芽鞘燕麦胚芽鞘去除顶端，加处理过的琼脂块去除顶端，加处理过的琼脂块去除顶端，加处理过的琼脂块去除顶端，加处理过的琼脂块F.W.Went 的实验实验结论总结实验结论总结生长
6、素的产生部位：生长素的产生部位：生长素的作用部位生长素的作用部位（胚芽鞘的生长部位）（胚芽鞘的生长部位）胚芽鞘的感光部位：胚芽鞘的感光部位：胚芽鞘的胚芽鞘的尖端尖端胚芽鞘的尖端胚芽鞘的尖端下段下段胚芽鞘的胚芽鞘的尖端尖端结论：结论：胚芽鞘顶端顶端能产生化学物质，向下向下传输到去顶胚芽鞘，并影响后者的生长；Went称这种化学物质为生长素 ；1934年首次提取纯化出刺激生长的物质，经鉴定为吲哚乙酸（IAA）。单侧光单侧光单侧光单侧光使使背光一侧比向背光一侧比向光一侧生长素分布得多；光一侧生长素分布得多；背光一侧的细胞背光一侧的细胞纵向生纵向生纵向生纵向生长的快长的快长的快长的快，结果使得茎朝，结果
7、使得茎朝向生长慢的一侧弯曲。向生长慢的一侧弯曲。生长素为什么能引起向光弯曲？生长素为什么能引起向光弯曲？生长素的产生部位生长素的产生部位生长素的分布生长素的分布生长素的运输方向生长素的运输方向主要在主要在幼嫩的芽、叶、幼嫩的芽、叶、发育的种子。发育的种子。大多集中在大多集中在生长旺生长旺盛的部位盛的部位。从植物体从植物体形态学上端形态学上端向形态学下端运输向形态学下端运输 。根：背向根尖运输根：背向根尖运输茎：背向茎尖运输茎：背向茎尖运输生长素的分布与运输生长素的分布与运输010-1010-810-610-410-2c/molL-1促促进进生生长长抑抑制制生生长长根根芽芽茎茎对生长素的敏感度对
8、生长素的敏感度：A生长素的生理作用和最适浓度生长素的生理作用和最适浓度低促低促低促低促高抑高抑高抑高抑生长素浓度的调节方式：生长素浓度的调节方式：生长素的结合： 束缚生长素 自由生长素无活性无活性无活性无活性 有活性有活性有活性有活性与糖、氨基酸等结合合成、降解、运输、结合、区域化生长素的降解：1）光氧化；2）酶促降解脱羧降解（吲哚乙酸氧化酶IAA IAA oxidaseoxidase）不脱羧降解2、综上所述、综上所述吲哚乙酸氧化酶能调节植物体内IAA的水平，从而影响植物的生长。生长素分布在生长旺盛的部位，IAA氧化酶分布在生长不旺盛不旺盛的部位。酶活力的大小可以用破坏IAA的速率表示，即：
9、IAA氧化酶活力 = IAA减少的速率3、实验设计、实验设计 在无机酸存在下，IAA能与FeCl3作用，生成红色的螯合物。该物质在530nm处有最大光吸收峰。比色法比色法比色法比色法（分光光度法）（分光光度法）（分光光度法）（分光光度法）注意：如果待测物与另一底物反应后 1，生成稳定的产物； 2，产物有特定的光吸收峰。三，实验步骤三，实验步骤1，提取IAA氧化酶 称取0.5g绿豆下胚轴，分次分次加入预冷的磷酸缓冲液（pH6.0）5mL，冰浴冰浴研磨，4000rpm离心20分钟，取上清液，即为粗酶液。试管号试管号MnCl22、4-二氯酚二氯酚IAA(200ug/mL)酶液酶液磷酸缓冲液磷酸缓冲液
10、(pH6.0)实验1mL1mL2 mL1 mL5mL对照1mL1mL2 mL6mL两两管分别混匀，管分别混匀，2525 水浴保温水浴保温30min30min。2，IAA氧化酶与氧化酶与IAA的反应的反应3，测定，测定IAA氧化酶活性氧化酶活性混合试剂B： 0.5mol/LFeCl3+35%过氯酸(V:V=1:50) 30min后另取2支试管，每支加入试剂B 4mL，再按表加入反应液orIAA的梯度浓度溶液各2mL 。试管试管实验实验对照对照反应液反应液 （各）（各）实验实验溶液溶液 2mL对照溶液对照溶液 2mL2支试管于40404040 下保温30min，使反应液呈红色。530nm处测OD值
11、，分别记为OD实验、OD对照。4.制作标准曲线制作标准曲线试管试管0123456IAA梯度液梯度液0ug/ml2ug/mL5ug/mL10ug/mL15ug/mL20ug/mL25ug/mL另取另取7支试管，每支加入试剂支试管，每支加入试剂B 2mL，再按表加，再按表加入入IAA的梯度浓度溶液各的梯度浓度溶液各1mL 。以以0管溶液调零，分别测定管溶液调零，分别测定530nm处吸光值。处吸光值。同时，配制IAA梯度浓度溶液各10mL5、结果计算、结果计算以06管的IAA浓度为横坐标，以相应的OD值为纵坐标，绘制标准曲线。根据实验、对照管的OD值，在标准曲线上查出相应的IAA浓度。IAA氧化酶活性（ugIAA/g FW.h) (C对照-C实验)*VT*V=W.t.V1VT：酶液总体积；V：步骤2所得反应液体积；V1：反应所用酶液体积四、思考题四、思考题步骤（一）中为何取材时去除子叶与胚根，留取胚轴？反应混和液为何中加入氯化锰和2、4-二氯酚？IAA氧化酶在植物的生长发育过程中一般起着什么作用？为何在生产实践中一般不用IAA，而用NAA或2、4-D等生长调节剂？
