荧光定量PCR技术讲座理论基础引物及探针设计体系优化实验方案数据分析污染防控ppt课件

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1、荧光定量PCR技术讲座-分子生物学实验技术系列讲座分子生物学实验技术系列讲座 大纲一、荧光定量PCR技术的基础理论二、引物及Taqman探针的设计三、内参基因的选择四、反应体系的优化五、实验方案的选择六、误差分析及操作规范七、实验中污染的防控八、实验结果的分析PCR技术技术（聚合酶链式反应）（聚合酶链式反应）PolymerasePolymerasePolymerasePolymerase chainchainchainchain ReactiReactiReactiReactionononon以目的基因或以目的基因或以目的基因或以目的基因或DNADNADNADNA片段为模板，片段为模板，片段为

2、模板，片段为模板，在引物介导及在引物介导及在引物介导及在引物介导及 DNADNADNADNA聚合酶催聚合酶催聚合酶催聚合酶催化下，在体外用核苷酸化下，在体外用核苷酸化下，在体外用核苷酸化下，在体外用核苷酸（dNTPdNTP）大量合成目的基因）大量合成目的基因）大量合成目的基因）大量合成目的基因或或或或DNADNADNADNA片段。片段。片段。片段。它能快速、专一地扩增所希它能快速、专一地扩增所希它能快速、专一地扩增所希它能快速、专一地扩增所希望得到的目的基因或望得到的目的基因或望得到的目的基因或望得到的目的基因或DNADNADNADNA片段。片段。片段。片段。一、荧光定量PCR技术的基础理论1

3、、荧光定量PCR技术概论 荧光定量荧光定量PCRPCR技术产生并成熟于上世纪技术产生并成熟于上世纪9090年代，由于该技年代，由于该技术实现了术实现了PCRPCR从定性到定量的飞跃，能够对从定性到定量的飞跃，能够对PCRPCR反应的全过程反应的全过程进进行实时监控，并且自动化程度高，所以该技术从产生到现在短行实时监控，并且自动化程度高，所以该技术从产生到现在短短的十几年时间，在科研及检验领域获得了广泛的应用短的十几年时间，在科研及检验领域获得了广泛的应用，成为成为分子生物学领域不可或缺的一项重要技术。分子生物学领域不可或缺的一项重要技术。 一、荧光定量PCR技术的基础理论1、荧光定量PCR技术

4、概论 荧光定量荧光定量PCRPCR技术是在技术是在PCRPCR反应体系中加入荧光基团，利用反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号随着荧光信号随着PCRPCR反应的积累来实时监控反应的积累来实时监控PCRPCR反应的进程，并反应的进程，并通通过分析软件对过分析软件对PCRPCR的反应进行检测分析的技术。的反应进行检测分析的技术。 系统组成：定量系统组成：定量PCRPCR仪、电脑、分析软件、试剂及耗材。仪、电脑、分析软件、试剂及耗材。 一、荧光定量PCR技术的基础理论2、荧光定量PCR常用的三个概念 扩增曲线、阈值、扩增曲线、阈值、CTCT值值（1 1）、扩增曲线及扩增曲线的两种形式）、扩增曲线及扩

5、增曲线的两种形式 左图反映的是随着左图反映的是随着PCRPCR反应的进行相应的荧光信号的变化，比较直观，但是指反应的进行相应的荧光信号的变化，比较直观，但是指数期很短；右图反映的是荧光信号数期很短；右图反映的是荧光信号的的变化量的对数与变化量的对数与PCRPCR反应循环数的关系，从反应循环数的关系，从右图可知，指数期很明显，在确定阈值线时具有简单明了的特点，所以很多软件右图可知，指数期很明显，在确定阈值线时具有简单明了的特点，所以很多软件都采用右图的形式，当然了，这两种实时扩增曲线可以根据实验的需要相互转换。都采用右图的形式，当然了，这两种实时扩增曲线可以根据实验的需要相互转换。一、荧光定量P

6、CR技术的基础理论2、荧光定量PCR常用的三个概念（2 2）、阈值线）、阈值线 在荧光定量在荧光定量PCRPCR扩增的指数期，画一条线，在此直线上，扩增的指数期，画一条线，在此直线上，所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的差值全部相同。所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的差值全部相同。一、荧光定量PCR技术的基础理论2 2、荧光定量、荧光定量PCRPCR常用的三个概念常用的三个概念（3 3）、）、CTCT值值 PCRPCR过程中，各样品扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，所经过的过程中，各样品扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，所经过的扩增循环数。扩增循环数。一、荧光定量PCR技术的基础理论3、

7、荧光定量PCR的化学基础 荧光定量荧光定量PCRPCR是随着是随着PCRPCR循环的进行，以荧光信号强度的积循环的进行，以荧光信号强度的积累来实时反映累来实时反映PCRPCR反应进程的。理想的荧光物质需具备以下特反应进程的。理想的荧光物质需具备以下特点：点： （1 1）、本底低）、本底低（2 2）、荧光强度高）、荧光强度高（3 3）、每轮）、每轮PCRPCR反应完成后都有荧光强度的增高，而且这种荧反应完成后都有荧光强度的增高，而且这种荧 光强度的增高和每轮循环后光强度的增高和每轮循环后PCRPCR产物的量成线性关系产物的量成线性关系（4 4）、没有）、没有PCRPCR产物时，没有荧光产物时，没

8、有荧光（5 5）、该荧光物质的受激发后其发射光的波长范围窄，各种）、该荧光物质的受激发后其发射光的波长范围窄，各种 荧光不会产生荧光的交叉干扰荧光不会产生荧光的交叉干扰一、荧光定量PCR技术的基础理论3、荧光定量PCR的化学基础目前常用的几种荧光物质目前常用的几种荧光物质（1 1）、）、TaqmanTaqman探针类探针类5 5 端标记荧光基团，端标记荧光基团，3 3 端标记淬灭基团，探针完整时，没有端标记淬灭基团，探针完整时，没有荧光，探针断裂后，在激发光的作用下，荧光基团产生荧光；荧光，探针断裂后，在激发光的作用下，荧光基团产生荧光；探针本身序列与目的基因序列互补，特异性高，退火后探针探针

9、本身序列与目的基因序列互补，特异性高，退火后探针与目的基因互补序列结合，随着与目的基因互补序列结合，随着PCRPCR反应的进行，在反应的进行，在TaqTaq酶酶5 5 -3-3 外切酶的作用下，探针水解断裂，荧光产生。外切酶的作用下，探针水解断裂，荧光产生。一、荧光定量PCR技术的基础理论3、荧光定量PCR的化学基础TaqmanTaqman常用的荧光基团和淬灭基团常用的荧光基团和淬灭基团 荧光基团：荧光基团：5 5 端常用荧光基团端常用荧光基团FAMFAM标记，最佳激发光波长：标记，最佳激发光波长：494-495nm494-495nm，最，最大大 发射光波长：发射光波长：518-520nm51

10、8-520nm。淬灭基团：淬灭基团：TAMRATAMRA、BHQBHQ、ECLIPSEECLIPSE等。等。 TAMRATAMRA本身也是一种荧光基团，激发光波长范围较宽，本身也是一种荧光基团，激发光波长范围较宽，500500 560nm 560nm，最佳激发光波长在，最佳激发光波长在560nm560nm附近，对附近，对FAMFAM基团产生的发射光基团产生的发射光 具有较好的吸收作用；其发射光波长较宽，具有较好的吸收作用；其发射光波长较宽，560560650nm650nm，当做，当做 多重荧光时，容易产生荧光交叉干扰，并且本底较高，故现已多重荧光时，容易产生荧光交叉干扰，并且本底较高，故现已

11、不常用。不常用。 BHQBHQ和和ECLIPSEECLIPSE为非荧光物质，只是一种荧光淬灭剂，本身不会为非荧光物质，只是一种荧光淬灭剂，本身不会 产生荧光，光吸收范围较宽，因此本底较低，作为淬灭基团较产生荧光，光吸收范围较宽，因此本底较低，作为淬灭基团较 为常用，尤其在多重荧光定量为常用，尤其在多重荧光定量PCRPCR时常常被采用。时常常被采用。一、荧光定量PCR技术的基础理论3、荧光定量PCR的化学基础TaqmanTaqman探针的特点及应用探针的特点及应用（1 1）、特异性强、准确性高）、特异性强、准确性高 本身具有序列特异性，保证了所检测目的基因的特异本身具有序列特异性，保证了所检测目

12、的基因的特异 性；其结构特点保证了其所产生的荧光强度与性；其结构特点保证了其所产生的荧光强度与PCRPCR产物产物 的量成正比关系，因此准确性极高。的量成正比关系，因此准确性极高。（2 2）、对引物及试剂要求不高，配套的普通引物就可以使）、对引物及试剂要求不高，配套的普通引物就可以使 用，普通的用，普通的TaqTaq酶就能满足实验的要求。酶就能满足实验的要求。（3 3）、常被用作基因含量的精确检测）、常被用作基因含量的精确检测( (精确度可达几十个拷贝精确度可达几十个拷贝) ) 及基因表达变化的精确分析（精确度可达及基因表达变化的精确分析（精确度可达0.10.1倍的变倍的变 化）。化）。（4

13、4）、目前价格也不是太贵，）、目前价格也不是太贵，2OD 1000.002OD 1000.00左右左右一、荧光定量PCR技术的基础理论3、荧光定量PCR的化学基础（2 2）、荧光染料类）、荧光染料类 目前常用的荧光染料为目前常用的荧光染料为SYBR GreenSYBR Green、SYBR GreenSYBR Green、 SYTO9SYTO9、HRMHRM等。其共同性质为：等。其共同性质为： （a a）、结合于双链核酸的小沟处）、结合于双链核酸的小沟处 （b b）、与双链）、与双链DNADNA结合后受激产生荧光结合后受激产生荧光 （c c）、在变性条件下双链分开，荧光消失）、在变性条件下双链

14、分开，荧光消失一、荧光定量PCR技术的基础理论3、荧光定量PCR的化学基础荧光染料的特点及应用荧光染料的特点及应用（1 1）、能够与所有的核酸双链结合，受激后产生荧光，其荧光的强度与）、能够与所有的核酸双链结合，受激后产生荧光，其荧光的强度与 双链核酸的含量及长度成正比，因此本底较高；双链核酸的含量及长度成正比，因此本底较高；（2 2）、可做双链核酸的熔解曲线分析；）、可做双链核酸的熔解曲线分析；（3 3）、）、SYBR GreenSYBR Green染料本身价格便宜，但是做荧光定量染料本身价格便宜，但是做荧光定量PCRPCR时对引物设时对引物设 计的要求很高；对计的要求很高；对TaqTaq酶

15、要求较高，最好是酶要求较高，最好是HotStarHotStar TaqTaq酶，或者操酶，或者操 作时需要严格的冷启动，冰上操作，否则引物二聚体及非特异性扩作时需要严格的冷启动，冰上操作，否则引物二聚体及非特异性扩 增会严重干扰结果的准确性，尤其是模板含量较低时；增会严重干扰结果的准确性，尤其是模板含量较低时；（4 4）、适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛；）、适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛；（5 5）、在分析的基因种类很多，但是样品量很少时，尤其适用。）、在分析的基因种类很多，但是样品量很少时，尤其适用。（6 6）、对）、对PCRPCR反应的毒性，能抑制反应的毒性，能

16、抑制PCRPCR反应，降低反应，降低PCRPCR反应的效率。反应的效率。一、荧光定量PCR技术的基础理论4、荧光定量PCR的数学原理 对于普通的对于普通的PCRPCR反应来说反应来说 n n Xn n=X0 0（1E）上式中，上式中， X Xn n为为n n轮轮PCRPCR循环后，目的基因循环后，目的基因PCRPCR产物的量；产物的量；n n为为PCRPCR循环数；循环数；X X0 0 为目的基因的初始模板量，为目的基因的初始模板量，E E为为PCRPCR的反应效的反应效率，率，0E10E1。一、荧光定量PCR技术的基础理论4、荧光定量PCR的数学原理 由于由于PCRPCR反应体系中荧光物质的

17、荧光强度与反应体系中荧光物质的荧光强度与PCRPCR产物的量成正比，所以产物的量成正比，所以用荧光强度来代替用荧光强度来代替PCRPCR产物的量，我们可以得到：产物的量，我们可以得到： Rn n= RB B+ X0 0(1+ E) R Rs sn n总荧光信号强度总荧光信号强度= =本底信号本底信号+ +分子数量分子数量 单位信号强度单位信号强度R Rn n：第第n n个循环时的总信号个循环时的总信号R RB B：本底本底R RS S：单位信号强度单位信号强度X X0 0：起始起始DNADNA数目数目E E： PCRPCR效率效率一、荧光定量PCR技术的基础理论4、荧光定量PCR的数学原理 当

18、循环数当循环数n n等于等于CTCT值时，所有样品荧光信号强度变化量的值时，所有样品荧光信号强度变化量的对数全部一致，都达到了阈值。对数全部一致，都达到了阈值。 R RT T= R= RB B+ X+ X0 0(1+ E) (1+ E) RsRs lg(Rlg(RT T -R -RB B) = lgX) = lgX0 0 + CT lg(1+ E) + + CT lg(1+ E) + lglg RsRs CT lg(1+ E) = -lgX CT lg(1+ E) = -lgX0 0 + + lg(Rlg(RT T -R -RB B) ) lglg RsRs 此时，此时，PCRPCR反应处于指

19、数期阶段，所有样品的反应效率反应处于指数期阶段，所有样品的反应效率E E稳定且近似相稳定且近似相等；等； lg(Rlg(RT T -R -RB B) )、RsRs也都相同，只有也都相同，只有CTCT值和值和-lgX-lgX0 0为变量，且这两个变为变量，且这两个变量之间成一次性方程。量之间成一次性方程。 也就是说，也就是说， 所有样品的所有样品的lgXlgX0 0与到达阈值时的循环数与到达阈值时的循环数n n（CtCt值）呈线性值）呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即关系，根据样品扩增达到域值的循环数即CtCt值就可计算出样品中所含的模值就可计算出样品中所含的模板量板量CT一、荧光定量P

20、CR技术的基础理论5、荧光定量PCR线性关系成立的条件分析CT lg(1+ E) = -lgXCT lg(1+ E) = -lgX0 0 + + lg(Rlg(RT T -R -RB B) ) lglg RsRs（1 1）、）、PCRPCR效率相等，在效率相等，在PCRPCR扩增的指数期，扩增的指数期，E E稳定且为常数；稳定且为常数；（2 2）、）、R RT T R RB B 要要相等；也就是说到达阈值时样品的荧光强度与样品的荧相等；也就是说到达阈值时样品的荧光强度与样品的荧 光本底之差要相等；光本底之差要相等；（3 3）、样品的单位信号强度）、样品的单位信号强度RsRs要相等，用荧光染料做

21、荧光基团时，要相等，用荧光染料做荧光基团时，RsRs 就就 是每条是每条PCRPCR产物结合荧光染料后所发出的荧光强度，此荧光强度和产物结合荧光染料后所发出的荧光强度，此荧光强度和 PCRPCR产物的长短有关，产物的长短有关，PCRPCR产物越长，结合的荧光染料越多，产物越长，结合的荧光染料越多， RsRs 值值 越大；用探针做荧光基团时，越大；用探针做荧光基团时，RsRs 就等于就等于PCRPCR反应时，反应时，TaqTaq酶水解掉酶水解掉 探针，探针的发光基团所发出的荧光强度，和探针，探针的发光基团所发出的荧光强度，和PCRPCR产物的长度没有产物的长度没有 直接关系。直接关系。一、荧光定

22、量PCR技术的基础理论5、荧光定量PCR线性关系成立的条件分析左图横坐标是左图横坐标是PCRPCR循环次数，纵坐标是总的荧光强度循环次数，纵坐标是总的荧光强度RnRn，改图反映的是各个样品随，改图反映的是各个样品随着每轮着每轮PCRPCR反应，其总的荧光量的实时变化；右图横坐标也是反应，其总的荧光量的实时变化；右图横坐标也是PCRPCR循环次数，纵坐标循环次数，纵坐标是总的荧光强度与荧光本底的差值是总的荧光强度与荧光本底的差值RT RT RBRB即即RnRn的对数，在右图中确定阈值线，该的对数，在右图中确定阈值线，该直线上所有样品的直线上所有样品的RT RT RBRB的对数都相同，荧光定量的对

23、数都相同，荧光定量PCRPCR的线性关系才会成立。的线性关系才会成立。一、荧光定量PCR技术的基础理论5、荧光定量PCR线性关系成立的条件分析 LogX0与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据未知样品Ct值，就可以在标准曲线上计算出未知样品初始模板量。一、荧光定量PCR技术的基础理论6、双链核酸的熔解曲线分析 使用荧光染料作为荧光基团时，由于荧光染料的特性随着使用荧光染料作为荧光基团时，由于荧光染料的特性随着PCRPCR反应的进反应的进行，双链行，双链PCRPCR产物呈指数增长，产物呈指数增长，SYBR GreenSYBR Green与双链与双链PCRPCR产物结合

24、后荧光越产物结合后荧光越来越强，当来越强，当PCRPCR反应结束时，荧光强度达到最大，此时对反应结束时，荧光强度达到最大，此时对PCRPCR产物进行缓慢产物进行缓慢加热，从加热，从5050一直加热到一直加热到9999，在此过程中，在此过程中PCRPCR产物按照产物按照TMTM值的大小双链值的大小双链被被依次打开，荧光强度也随着双链的打开依次减弱，如下图：依次打开，荧光强度也随着双链的打开依次减弱，如下图：一、荧光定量PCR技术的基础理论6、双链核酸的熔解曲线分析 对于核酸序列相同的对于核酸序列相同的PCRPCR产物，其产物，其TMTM值也相同，而且其值也相同，而且其TMTM值在一个很小值在一个

25、很小的温度范围内，在此温度区间，其序列相同的核酸双链全部打开，荧光强的温度范围内，在此温度区间，其序列相同的核酸双链全部打开，荧光强度急剧降低，以荧光强度的变化率和温度来作图，则可得到如下图：度急剧降低，以荧光强度的变化率和温度来作图，则可得到如下图： 一、荧光定量PCR技术的基础理论6、双链核酸的熔解曲线分析 上图就是熔解曲线，熔解曲线反映的是一定序列长度的核上图就是熔解曲线，熔解曲线反映的是一定序列长度的核酸双链，在一定的离子强度下的酸双链，在一定的离子强度下的TMTM值。核酸双链的值。核酸双链的TMTM值由双值由双链链核苷酸之间相连接的氢键决定，不同的核酸双链，其核苷酸之间相连接的氢键决

26、定，不同的核酸双链，其TMTM值也不值也不同，所以通过熔解曲线，我们能获知双链核酸的均一性、野生同，所以通过熔解曲线，我们能获知双链核酸的均一性、野生型和突变型双链之间的碱基差异等，如果采用高分辨率荧光染型和突变型双链之间的碱基差异等，如果采用高分辨率荧光染料，链条核酸双链哪怕只有一个碱基的差异，通过熔解曲线也料，链条核酸双链哪怕只有一个碱基的差异，通过熔解曲线也能分析出来。能分析出来。 电泳是通过核酸分子量的大小和构象来分析的，熔解曲线电泳是通过核酸分子量的大小和构象来分析的，熔解曲线是根据双链核酸的是根据双链核酸的TMTM值来分析的，这与琼脂糖电泳及值来分析的，这与琼脂糖电泳及SSCPSS

27、CP有有异异曲同工之处。曲同工之处。一、荧光定量PCR技术的基础理论7、绝对定量和相对定量一、荧光定量PCR技术的基础理论7、mRNA差异表达的相对定量分析 研究基因表达的情况，我们只需搞清楚该基因在不同生理阶段的变化研究基因表达的情况，我们只需搞清楚该基因在不同生理阶段的变化趋势如何就行了，而无需知道该基因的绝对量有多少。趋势如何就行了，而无需知道该基因的绝对量有多少。 实验操作中，由于样品选取时样品的细胞个数不可能完全相同，实验操作中，由于样品选取时样品的细胞个数不可能完全相同，RNARNA提取提取时得率不同、时得率不同、RNARNA反转录为反转录为cDNAcDNA的效率不同等客观因素，用

28、于定量分析的的效率不同等客观因素，用于定量分析的初初始样品浓度不同，这就造成了比较上的混乱，因此在进行基因表达调控研始样品浓度不同，这就造成了比较上的混乱，因此在进行基因表达调控研究中都会用一些看内参基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成究中都会用一些看内参基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。常用的内参基因是在各种生理条件下表达量恒定的基因，这些基的差异。常用的内参基因是在各种生理条件下表达量恒定的基因，这些基因也常被称为看家基因，该基因表达一般不随外界的变化而变化，所以常因也常被称为看家基因，该基因表达一般不随外界的变化而变化，所以常被用作内参照，常用的内参基因有被用作

29、内参照，常用的内参基因有GAPDHGAPDH基因、基因、-Actin-Actin基因，基因，18srRNA18srRNA基基因等。因等。一、荧光定量PCR技术的基础理论7、mRNA差异表达的相对定量分析以上公式就是引入内参基因后相对定量分析的基本公式，并由此派生出两以上公式就是引入内参基因后相对定量分析的基本公式，并由此派生出两种相对定量的分析方法种相对定量的分析方法：双标准曲线法和双标准曲线法和Delta-delta CtDelta-delta Ct法。法。一、荧光定量PCR技术的基础理论7、mRNA差异表达的相对定量分析（1 1）、双标准曲线法）、双标准曲线法 所谓的双标准曲线法就是对每个

30、样品的内参基因和目的基因都做绝对定所谓的双标准曲线法就是对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定量，求出每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量，然后根据相对量，求出每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量，然后根据相对定量的基本公式来求出目的基因的差异表达。定量的基本公式来求出目的基因的差异表达。 双标准曲线法的特点双标准曲线法的特点： （a a）、考虑到了不同基因扩增效率的差异，用标准曲线来校正扩增效）、考虑到了不同基因扩增效率的差异，用标准曲线来校正扩增效 率，最大限度的避免了误差；率，最大限度的避免了误差； （b b）、思路直观、条理清晰、应用简便，操作灵活，无需像）、思路直观、条理清晰、

31、应用简便，操作灵活，无需像Delta-Delta- delta CT delta CT法那样对实验进行反复的优化；法那样对实验进行反复的优化； （c c）、其不足之处是每次实验都必需对目的基因和看家基因做标准曲）、其不足之处是每次实验都必需对目的基因和看家基因做标准曲 线；线； （d d）、该方法适合样品量大，但是所分析目的基因较少的实验。）、该方法适合样品量大，但是所分析目的基因较少的实验。一、荧光定量PCR技术的基础理论7、mRNA差异表达的相对定量分析（2 2）、）、2 -2 -CTCT法法 该方法的前提条件是目的基因和内参基因的扩增效率相同且都为1，在试验开始前必须分别对目的基因和内参

32、基因作标准曲线，看两者扩增效率的差别，假如两者扩增效率之间的差异小于0.1，就可以用该方法分析。而且在接下来的实验中，无需再做标准品。 该方法要求严格的重复，因为CT值的差异只要有很小的变化，测得的结果就会有很大的差别。 该方法特别适合于样品量不大，但是检测的基因种类很多的情况。 二、引物及Taqman探针的设计1、染料法引物的设计原则：（1 1）、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异；）、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异；（2 2）、避免引物自身或与引物之间形成）、避免引物自身或与引物之间形成4 4个或个或4 4个以上连续配对，避免引物个以上连续配对，避免引物 自身形成环状发

33、卡结构；自身形成环状发卡结构；（3 3）、检测）、检测mRNAmRNA时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显 子；子；（4 4）、引物之间的）、引物之间的TMTM相差避免超过相差避免超过2 2；（5 5）、典型的引物）、典型的引物1818到到2424个核苷长；个核苷长；（6 6）、目的基因和内参基因所扩增的）、目的基因和内参基因所扩增的PCRPCR产物长度尽量一致，不大于产物长度尽量一致，不大于 300bp300bp，这样有利于使两种基因，这样有利于使两种基因PCRPCR效率相同效率相同（7 7）、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级

34、结构并做）、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做BLASTBLAST分析其分析其 特异性特异性 二、引物及Taqman探针的设计2、Taqman探针及引物的设计原则： 在在TaqmanTaqman探针法中，探针法中，TaqTaq酶除了酶除了5 5 -3-3 聚合酶作用之外，还要聚合酶作用之外，还要5 5 -3-3 外切酶外切酶的活性来切断探针链产生荧光，普通的活性来切断探针链产生荧光，普通PCRPCR的延伸温度为的延伸温度为7272，此温度为，此温度为TaqTaq酶聚合作用的最佳温度；酶聚合作用的最佳温度；TaqmanTaqman探针法反应中，在要求探针法反应中，在要求TaqTaq酶

35、酶5 5 -3-3 聚合酶活聚合酶活性的同时，还需要性的同时，还需要TaqTaq酶酶5 5 -3-3 外切酶的活性来切断探针链产生荧光，外切酶的活性来切断探针链产生荧光，TaqTaq酶酶5 5 -3-3 外切酶活性的最佳温度为外切酶活性的最佳温度为6060，所以，所以TaqmanTaqman PCR PCR反应的一般采用两步反应的一般采用两步法，即法，即9595变性，变性，6060复性延伸。复性延伸。 在在TaqmanTaqman探针及引物的设计过程中，引物的探针及引物的设计过程中，引物的TMTM值已经确定为值已经确定为6060左左右，在每轮右，在每轮PCRPCR循环的复性过程中（循环的复性过

36、程中（95609560），为了确保探针先于引物），为了确保探针先于引物与与模板结合，这就要求探针的模板结合，这就要求探针的TMTM值高于引物值高于引物1010左右，所以左右，所以TaqmanTaqman探针及引探针及引物一般都是引物物一般都是引物TMTM值为值为6060左右，探针的左右，探针的TMTM值为值为7070左右。左右。二、引物及Taqman探针的设计2、Taqman探针及引物的设计原则：（1 1）、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异；）、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异；（2 2）、检测）、检测mRNAmRNA时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显时，为避

37、免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显 子；子；（3 3）、引物）、引物TMTM值为值为6060左右，探针的左右，探针的TMTM值为值为7070左右；左右；（4 4）、探针的）、探针的5 5 端应避免使用鸟嘌呤端应避免使用鸟嘌呤G G，因为，因为5 5 G G会有淬灭作用，而且即使会有淬灭作用，而且即使 是被切割下来还会存在淬灭作用；是被切割下来还会存在淬灭作用； （5 5）、整条探针中，碱基）、整条探针中，碱基C C的含量要明显高于的含量要明显高于G G的含量的含量 G G含量高会降低反应含量高会降低反应 效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；

38、 （6 6）、引物之间的）、引物之间的TMTM相差避免超过相差避免超过2 2；（7 7）、典型的引物长度为）、典型的引物长度为18-24bp18-24bp，探针长度为，探针长度为15-45bp15-45bp；（8 8）、）、PCRPCR产物长度在产物长度在50-150bp50-150bp之间，这样有利于使之间，这样有利于使PCRPCR效率相同；效率相同；（9 9）、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做）、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做BLASTBLAST分析其分析其 特异性特异性 二、引物及Taqman探针的设计2、Taqman探针及引物的设计原则：探针中GC含量的差

39、异对定量PCR反应效率的影响二、引物及Taqman探针的设计3、Taqman探针及引物的设计举例 1 ATGAACTACG TTGGACAGTT AGCAGGGCAA GTGTTTGTAA CTGTGAAGGA GCTCTATAAG61 GGACTAAACC CAGCCACGCT GTCGGGATGT ATCGATATAA TTGTTGTACG TCAGCCAGAT121 GGGAATCTTC AGTGTTCTCC ATTCCATGTA CGCTTTGGGA AAATGGGAGT TCTGCGTTCC181 AGGGAGAAAG TGGTTGACAT AGAAATTAAT GGAGAGGCTG

40、 TAGATTTGCA CATGAAGCTA241 GGAGACAATG GAGAAGCCTT TTTCGTCCAG GAGATGGATA ACAATCAGGA GGTAATTCCT301 TATCATCTGT CTACGTCCCC CATCCTGTCT GAGGGAACTG CGTTAATGGA AGCTCAGCTG361 AAGAGAAACT CAATTGACAG GATAAGAAAC CTGGACAGCA GTGTATCTTC ACAAGTACCA421 CCCCAAGCTC ATGGATCCCA GCCTGGTACT GAAACATCTC CAGCCTGTAG CTCTGTGAAA48

41、1 AAGAGGAGGA AAAAGAGGAG GAAGTCTACC CACAAAATAG ACAGCTTAAA AAGAGAAGAC541 ATTGGAGATA CATCAGAAGA TGAAGACATG TTTCCTATAG AGATTAGCTC AGAGGAAGAA601 AAGGAACAAT TGGACAATTC AAGGATTCTT GTTCCAGATG TGTTTGTTGA TGAAGTATCT661 GATATAAAGG CTCCTGCTGT TTCTGCTTAT TCTCAGTCTT CATCTTACCC TCGTTCGGAT721 GGAGAATGGT CACCCATTCA

42、AAGTAAGCCC ATAGATTACA CAGGGCAATC CTCTCTTCTC经经OligoOligo软件验证，探针软件验证，探针TMTM值值7070左右，左右，上下游引物的上下游引物的TMTM值都为值都为60 60 左右，二级结构左右，二级结构分析，引物和探针比较理想，再经分析，引物和探针比较理想，再经BLASTBLAST分析，引物和探针特异性较好。分析，引物和探针特异性较好。二、引物及Taqman探针的设计4、Taqman探针及引物合成时注意事项（1 1）、引物及探针设计好之后，委托一家放心的合成公司合成；）、引物及探针设计好之后，委托一家放心的合成公司合成；（2 2）、先不要急于

43、合成探针，先引物合成，引物合成好以后，做普通）、先不要急于合成探针，先引物合成，引物合成好以后，做普通 PCRPCR，电泳检测，电泳检测PCRPCR产物，看是否和设计的长度吻合，再看看非特异产物，看是否和设计的长度吻合，再看看非特异 性扩增情况，必要时进行性扩增情况，必要时进行PCRPCR产物的测序验证；产物的测序验证；（3 3）、确定引物没有问题后，再将探针送交合成，这样安排能避免很多以）、确定引物没有问题后，再将探针送交合成，这样安排能避免很多以 外的损失；外的损失；（4 4）、探针合成好后，先检测一下探针的质量，）、探针合成好后，先检测一下探针的质量，250nm250nm的探针终浓度，的

44、探针终浓度， 25ul25ul水，反应体系中只有水和探针，在荧光定量水，反应体系中只有水和探针，在荧光定量PCRPCR仪上检测，仪上检测， 9595，2min; 952min; 95，20s20s，6060，20s20s，4040个个cyclescycles；看荧光本底和；看荧光本底和 荧光强度的变化情况，好的探针荧光本底较低，随着荧光强度的变化情况，好的探针荧光本底较低，随着PCRPCR反应，荧反应，荧 光强度不会变化，假如荧光强度变化的比较大，说明探针合成质量光强度不会变化，假如荧光强度变化的比较大，说明探针合成质量 较差，建议重新合成。较差，建议重新合成。三、内参基因的选择1、理想的内参

45、基因具有的特点（1 1）、不存在假基因；）、不存在假基因；（2 2）、高度或中度表达，排除太高或低表达）、高度或中度表达，排除太高或低表达（3 3）、稳定表达于不同类型的细胞和组织）、稳定表达于不同类型的细胞和组织( (如正常细胞和癌细胞如正常细胞和癌细胞) )，而且其，而且其 表达量是近似的，无显著性差别；表达量是近似的，无显著性差别；（4 4）、表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；）、表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；（5 5）、其稳定的表达水平与目标基因相似；）、其稳定的表达水平与目标基因相似；（6 6）、不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的）、不受任何内

46、源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的 影响。影响。 理想的内参基因很少或者说不存在，因为所有基因在不同的细胞或组理想的内参基因很少或者说不存在，因为所有基因在不同的细胞或组织中、在细胞的不同生理时期、在不同的理化等外界刺激下，其表达量都织中、在细胞的不同生理时期、在不同的理化等外界刺激下，其表达量都会有所差异，会有所差异，有时可以是几倍、几十倍甚至是上百倍的差异。盲目地使用有时可以是几倍、几十倍甚至是上百倍的差异。盲目地使用一种看家基因作为内参，一方面可能使基因表达的微小差异难以发现，另一种看家基因作为内参，一方面可能使基因表达的微小差异难以发现，另一方面可能引致错误甚至相反的结论

47、。一方面可能引致错误甚至相反的结论。三、内参基因的选择2、常用内参基因的表达情况（1 1）、）、GAPDHGAPDH GAPDH mRNA GAPDH mRNA在不同癌组织在不同癌组织( (包括肺癌、乳腺癌、肾细胞癌等包括肺癌、乳腺癌、肾细胞癌等) )中的表达中的表达升高，在不同个体间、怀孕期间以及细胞周期的不同阶段等变化很大，在升高，在不同个体间、怀孕期间以及细胞周期的不同阶段等变化很大，在正常的结肠上皮、人类前列腺癌的细胞周期不同阶段也呈现出显著性变正常的结肠上皮、人类前列腺癌的细胞周期不同阶段也呈现出显著性变化。在各种因素化。在各种因素( (例如低氧、胰岛素、地塞米松、丝裂原、表皮生长因

48、子等例如低氧、胰岛素、地塞米松、丝裂原、表皮生长因子等) )刺激下，培养细胞刺激下，培养细胞GAPDH mRNAGAPDH mRNA的表达水平也不同。的表达水平也不同。（2 2）、）、-actin-actin 当细胞向恶性转化时，当细胞向恶性转化时，-actin-actin mRNA mRNA的表达水平增加。的表达水平增加。（3 3）、）、18srRNA18srRNA 当细胞有丝分裂时，当细胞有丝分裂时， 18srRNA18srRNA表达量显著上调。表达量显著上调。三、内参基因的选择3、内参基因的选择策略 根据实验的实际情况，不同组织、不同细胞、细胞的不同生理时期、根据实验的实际情况，不同组织

49、、不同细胞、细胞的不同生理时期、不同的理化条件刺激等，查阅相关资料，选取三、四合适的内参基因，做不同的理化条件刺激等，查阅相关资料，选取三、四合适的内参基因，做荧光定量荧光定量PCRPCR，先以，先以CTCT值最小的那条基因作为内参，其他几条内参基因与值最小的那条基因作为内参，其他几条内参基因与其其相比，分析所得的比值，找出比值稳定的几条基因，比值稳定说明该基因相比，分析所得的比值，找出比值稳定的几条基因，比值稳定说明该基因表达稳定，适合作为理想的内参。表达稳定，适合作为理想的内参。 也可用也可用geNormgeNorm内参分析软件来选择合适的内参基因。内参分析软件来选择合适的内参基因。 对于

50、比较精确的实验，最好采用两种或两种以上表达稳定的基因作为对于比较精确的实验，最好采用两种或两种以上表达稳定的基因作为内参，对每种内参基因测得的基因表达变化求方差和平均值。内参，对每种内参基因测得的基因表达变化求方差和平均值。 http:/http:/medgen.ugent.be/jvdesomp/genorm/index.phpmedgen.ugent.be/jvdesomp/genorm/index.php 四、反应体系的优化1、为什么要优化反应体系 与普通与普通PCRPCR反应相比，荧光定量反应相比，荧光定量PCRPCR在反应中加入了荧光物质，用以实在反应中加入了荧光物质，用以实时显示反

51、应的进程，时显示反应的进程，TaqmanTaqman探针法在普通探针法在普通PCRPCR反应体系中加入了与扩增片反应体系中加入了与扩增片段段互补的一段带荧光标记的核酸序列，互补的一段带荧光标记的核酸序列，TaqTaq酶除了酶除了5 5 -3-3 聚合酶作用之外，还要聚合酶作用之外，还要发挥发挥5-35-3外切酶的活性来水解探针链来产生荧光；外切酶的活性来水解探针链来产生荧光；SybrGreenSybrGreen法加入了法加入了能与双链核酸结合的荧光染料，这些荧光物质都能影响能与双链核酸结合的荧光染料，这些荧光物质都能影响TaqTaq酶的活性进而影酶的活性进而影响响PCRPCR的反应效率。的反应

52、效率。普通普通PCRPCR反应体系反应体系 模板模板 引物引物 TaqTaq酶酶 BufferBuffer Mg2 Mg2 水水定量PCR反应体系 模板模板 引物引物 荧光基团荧光基团 TaqTaq酶酶 BufferBuffer Mg2 Mg2 水水四、反应体系的优化1、为什么要优化反应体系普通PCR结果电泳图添加荧光基团后PCR结果电泳图四、反应体系的优化2、如何优化 由上图可知，添加荧光基团后，由上图可知，添加荧光基团后，PCRPCR的反应效率几乎为的反应效率几乎为0 0，所以必须对，所以必须对荧光定量荧光定量PCRPCR反应体系进行优化，对体系中各个反应成分的浓度进行调整。反应体系进行优

53、化，对体系中各个反应成分的浓度进行调整。 其中最关键的因素其中最关键的因素：Mg2Mg2浓度浓度、荧光基团浓度、引物浓度荧光基团浓度、引物浓度 对于对于SYBR GreenSYBR Green荧光染料定量荧光染料定量PCRPCR反应体系来说，反应体系来说， Mg2Mg2的最佳浓的最佳浓度度为为3.0-4.0mM3.0-4.0mM； 对于对于TaqmanTaqman探针反应体系来说，探针反应体系来说， Mg2Mg2的最佳浓度为的最佳浓度为5.0mM5.0mM左右，引左右，引物物最佳浓度为最佳浓度为500nM500nM，探针的最佳浓度为，探针的最佳浓度为250nM250nM。四、反应体系的优化2、

54、如何优化SYBR GreenSYBR Green反应体系中反应体系中Mg2Mg2浓度梯度优化浓度梯度优化PCRPCR电泳结果电泳结果四、反应体系的优化2、如何优化优化后的Taqman探针体系实验结果，Mg2Mg2浓度为浓度为5.0mM5.0mM左右，引物浓度为左右，引物浓度为500nM500nM，探针浓度为，探针浓度为250nM250nM。四、反应体系的优化3、自行配制荧光定量PCR试剂（1 1）、常用的）、常用的SYBR GreenSYBR Green预混酶预混酶（2X2X） HotStar TaqE HotStar TaqE Buffer Buffer Mg2Mg2 其中其中Mg2Mg2浓

55、度为浓度为6 67mM7mM（2 2）、常用的）、常用的TaqmanTaqman预混酶（预混酶（2X2X） TaqE TaqE Buffer Buffer Mg2Mg2 其中其中Mg2Mg2浓度为浓度为10mM10mM五、实验方案的选择定量PCR实验方案定量PCR实验方案荧光染料法Taqman探针法双标准曲线法2 -2 -CTCT法法双标准曲线法2 -2 -CTCT法法五、实验方案的选择定量PCR实验方案（1 1）、染料法适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛；在分析）、染料法适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛；在分析 的基因种类很多，但是样品量很少时，尤其适用。的基因种类很多

56、，但是样品量很少时，尤其适用。（2 2）、探针法适合常被用作基因含量的精确检测）、探针法适合常被用作基因含量的精确检测( (精确度可达几十个拷贝精确度可达几十个拷贝) ) 及基因表达变化的精确分析（精确度可达及基因表达变化的精确分析（精确度可达0.10.1倍的变化）。倍的变化）。（3 3）、双标准曲线法适合样品量大、检测的基因种类相对较少、精度要求）、双标准曲线法适合样品量大、检测的基因种类相对较少、精度要求 较高的实验。较高的实验。（4 4）、）、 2 -2 -CTCT法适合检测精度要求一般，样品量相对较少，检测的基法适合检测精度要求一般，样品量相对较少，检测的基 因种类相对较多的实验。因种

57、类相对较多的实验。 根据实验的实际情况，如检测的精度要求、样品数量、基因数量、根据实验的实际情况，如检测的精度要求、样品数量、基因数量、经费情况等来选择合适的实验方案。经费情况等来选择合适的实验方案。六、误差分析及操作规范1、误差分析（1 1）、实验方案本身的误差）、实验方案本身的误差 荧光染料法由于染料本身的特性，不可避免的会引起误差；荧光染料法由于染料本身的特性，不可避免的会引起误差； 2 -2 -CTCT法由于也是一种近似的算法，所以不可避免的也会引起法由于也是一种近似的算法，所以不可避免的也会引起 误差；误差； TaqmanTaqman探针法误差相对较小；探针法误差相对较小； 双标准曲

58、线法误差相对较小。双标准曲线法误差相对较小。（2 2）、仪器设备引起的误差）、仪器设备引起的误差 测量标准品核酸浓度时，分光光度计的误差，从光密度值到质量再测量标准品核酸浓度时，分光光度计的误差，从光密度值到质量再 到摩尔量，误差本身就很大（双标准曲线法不一定非要测标准品的到摩尔量，误差本身就很大（双标准曲线法不一定非要测标准品的 浓度）；浓度）； 定量定量PCRPCR仪的误差仪的误差 耗材引起的误差，耗材引起的误差，9696空板封口膜透光性的差异等空板封口膜透光性的差异等六、误差分析及操作规范1、误差分析（3 3）、相对定量时内参基因表达不稳定引起的误差）、相对定量时内参基因表达不稳定引起的

59、误差（4 4）、操作引起的误差）、操作引起的误差 样品处理、选取、核酸提取、反转录、加样，操作过程中引起的误样品处理、选取、核酸提取、反转录、加样，操作过程中引起的误 差。差。2、操作规范 荧光定量荧光定量PCRPCR是一项对操作要求很高的实验，同时又是花费很高的一项是一项对操作要求很高的实验，同时又是花费很高的一项实验，这就要求必须最大程度的减少误差或避免错误。要想达到这个目实验，这就要求必须最大程度的减少误差或避免错误。要想达到这个目标，我们必须从样品的选取开始到上样检测，每一步都要规范操作。标，我们必须从样品的选取开始到上样检测，每一步都要规范操作。（1 1）、样品的处理及选取）、样品的

60、处理及选取 处理样品时，必须确保样品都得到了充分的处理。如测定一种药物处理样品时，必须确保样品都得到了充分的处理。如测定一种药物 到小白鼠免疫系统的影响，必须做到每次饲喂时此药品完全被小白到小白鼠免疫系统的影响，必须做到每次饲喂时此药品完全被小白 鼠摄食；选取试验样品时，要保证选取的组织尽可能的纯，不要污鼠摄食；选取试验样品时，要保证选取的组织尽可能的纯，不要污 染其他组织，如选取脾脏组织时，尽可能的选取脾脏，不能混有结染其他组织，如选取脾脏组织时，尽可能的选取脾脏，不能混有结 缔组织等，样品选取好后，即可放入液氮或超低温冰箱保存。缔组织等，样品选取好后，即可放入液氮或超低温冰箱保存。六、误差

61、分析及操作规范2、操作规范（2 2）、核酸提取）、核酸提取 加入液氮研磨要彻底，蛋白、多糖、多酚类物质要去除干净，确保加入液氮研磨要彻底，蛋白、多糖、多酚类物质要去除干净，确保 得到高质量的核酸，分光光度计检测核算质量，得到高质量的核酸，分光光度计检测核算质量，RNA OD260/280RNA OD260/280 2.02.0左右，左右，DNA OD260/280DNA OD260/2801.81.8左右，最好再做电泳检测；同一样左右，最好再做电泳检测；同一样 品要提取品要提取2 2到到3 3个个RNARNA，所剩余的样品不要丢弃，继续低温保存。，所剩余的样品不要丢弃，继续低温保存。（3 3）

62、、得到的）、得到的RNARNA立即反转录为立即反转录为cDNAcDNA，RNARNA样品最好不要存放，反转录所样品最好不要存放，反转录所得得 cDNAcDNA要用看家基因检测。要用看家基因检测。（4 4）、对于精度要求较高的定量）、对于精度要求较高的定量PCRPCR，最好先在样品的所有组织类型内做，最好先在样品的所有组织类型内做 内参基因的稳定性分析，找出表达恒定基因作为内参。内参基因的稳定性分析，找出表达恒定基因作为内参。（5 5）、做定量）、做定量PCRPCR时，先把除模板外的所有试剂预混，然后分装到时，先把除模板外的所有试剂预混，然后分装到PCRPCR管管 中，分装时尽量采用排枪，加样时

63、尽量最好采用排枪。中，分装时尽量采用排枪，加样时尽量最好采用排枪。（6 6）、体系中最好掺入）、体系中最好掺入ROXROX参比荧光，消除光程差和加样的偏差。参比荧光，消除光程差和加样的偏差。六、误差分析及操作规范2、操作规范（7 7）、重复操作）、重复操作 让重复操作最大的修正偏差？最有意义的重复是在提取样品让重复操作最大的修正偏差？最有意义的重复是在提取样品RNARNA时时 就重复，同一个样品，分别提取就重复，同一个样品，分别提取3 3份份RNARNA，3 3份份RNARNA都做反转录，所都做反转录，所 得的得的3 3份份cDNAcDNA都做定量都做定量PCRPCR检测，这样的重复之所以最有

64、意义是因检测，这样的重复之所以最有意义是因 为我们是把为我们是把RNARNA提取、反转录、上机检测三步做了重复，这样得出提取、反转录、上机检测三步做了重复，这样得出 的平均值要比只在上机检测时对同一的平均值要比只在上机检测时对同一cDNAcDNA样品做三个重复要有意义样品做三个重复要有意义 的多。的多。 同一个同一个cDNAcDNA样品做三个重复定量检测求平均值主要是消除加样时的样品做三个重复定量检测求平均值主要是消除加样时的 误差，排枪加样时，误差很小，加样时的误差可以通过设几个重复误差，排枪加样时，误差很小，加样时的误差可以通过设几个重复 检测出来。检测出来。六、误差分析及操作规范2、操作

65、规范同一cDNA样品的三个重复六、误差分析及操作规范模板浓度越低，染料法的误差越大。如图一系列梯度稀释的模板，理论上它们模板浓度越低，染料法的误差越大。如图一系列梯度稀释的模板，理论上它们在扩增曲线上的在扩增曲线上的CTCT值之差，应该相等，但是后边几个浓度低的样品值之差，应该相等，但是后边几个浓度低的样品CTCT值明显提值明显提前了，由熔解曲线可知对于浓度低的样品，引物二聚体引起的误差非常严重。前了，由熔解曲线可知对于浓度低的样品，引物二聚体引起的误差非常严重。七、实验中污染的防控1、荧光定量PCR实验中污染源的分析（1 1）、）、PCRPCR产物引起的污染产物引起的污染 在检测过程中，荧光

66、定量在检测过程中，荧光定量PCRPCR产物都是封闭在产物都是封闭在PCRPCR管中的，不存在开管中的，不存在开 管检测，所以有污染的话，最有可能是因为电泳检测荧光定量管检测，所以有污染的话，最有可能是因为电泳检测荧光定量PCRPCR 产物时引起的污染，只要将电泳室与产物时引起的污染，只要将电泳室与PCRPCR加样室隔离开，就能有效加样室隔离开，就能有效 的避免的避免PCRPCR产物的污染。产物的污染。（2 2）、标准品引起的污染）、标准品引起的污染 常用的标准品有含有目的基因的质粒、纯化后的常用的标准品有含有目的基因的质粒、纯化后的PCRPCR产物等，由于产物等，由于 标准品的浓度是一系列从高

67、到低梯度稀释的，所以在稀释过程中，标准品的浓度是一系列从高到低梯度稀释的，所以在稀释过程中， 有可能引起污染。有可能引起污染。（3 3）、高浓度的样品引起的污染）、高浓度的样品引起的污染 高浓度的阳性样品在加样过程中可能会形成气溶胶，造成污染。高浓度的阳性样品在加样过程中可能会形成气溶胶，造成污染。七、实验中污染的防控2、荧光定量PCR实验中污染的防控（1 1）、对于）、对于PCRPCR产物引起的污染产物引起的污染 最简单有效地办法就是将电泳室与加样室彻底隔离开，做到每个房最简单有效地办法就是将电泳室与加样室彻底隔离开，做到每个房 间都有专属的移液器，做到移液器专用；或者采用间都有专属的移液器

68、，做到移液器专用；或者采用dUdU代替代替dTdT配合配合 UNGUNG酶酶，是解决是解决PCRPCR产物污染的有效办法，但是成本较高。产物污染的有效办法，但是成本较高。（2 2）、对于标准品引起的污染）、对于标准品引起的污染 目前只能是以预防，加标准品时最好采用专用移液器，不要和加样目前只能是以预防，加标准品时最好采用专用移液器，不要和加样 的移液器交叉使用，加标准品时最好在通风厨中进行，和加样的操的移液器交叉使用，加标准品时最好在通风厨中进行，和加样的操 作台隔离开。作台隔离开。（3 3）、对于样品间的检查污染）、对于样品间的检查污染 样品间的交叉污染往往是因为高浓度的样品在加样室形成了气

69、溶样品间的交叉污染往往是因为高浓度的样品在加样室形成了气溶 胶，因为样品的胶，因为样品的cDNAcDNA链较长，经常开紫外灯，把长链链较长，经常开紫外灯，把长链cDNAcDNA打断，能打断，能 有效避免此类污染的发生，另外保持加样室空气流通也有助于防止有效避免此类污染的发生，另外保持加样室空气流通也有助于防止 此类污染。此类污染。七、实验中污染的防控2、荧光定量PCR实验中污染的防控（4 4）、对于未知污染源的顽固的污染的防控）、对于未知污染源的顽固的污染的防控 这类污染也经常出现，找不到明确的污染源，而且此类污染又非常这类污染也经常出现，找不到明确的污染源，而且此类污染又非常 顽固，对于这种

70、情况，最好的办法就是不去管它，在采用绝对定量顽固，对于这种情况，最好的办法就是不去管它，在采用绝对定量 和双标准曲线法时，污染的初始模板量可由阴性对照检测出来，知和双标准曲线法时，污染的初始模板量可由阴性对照检测出来，知 道了污染的初始模板量后，我们可以把测得样品的初始模板量减去道了污染的初始模板量后，我们可以把测得样品的初始模板量减去 污染的初始模板量，在分析时就避免了污染造成的误差。污染的初始模板量，在分析时就避免了污染造成的误差。七、实验中污染的防控图中最后一个样品为阴性对照，本来应该图中最后一个样品为阴性对照，本来应该是一直线，但是仪器也检测到了荧光信号是一直线，但是仪器也检测到了荧光

71、信号七、实验中污染的防控电泳结果显示，该阴性对照确实有电泳结果显示，该阴性对照确实有PCRPCR产物出现产物出现七、实验中污染的防控通过定量PCR检测，测得该阴性样品中含有227个初始模板。假如这个污染属于是顽固的未知污染，可以用正常样品测得的初始模板量减去227，来避免污染引起的误差八、实验结果的分析 实验结束后将得到的结果进行分析，现在很多软件都带有结果的自动分实验结束后将得到的结果进行分析，现在很多软件都带有结果的自动分析功能，可以将结果直接转化为各种图表及柱状图。对于和实验预期偏离析功能，可以将结果直接转化为各种图表及柱状图。对于和实验预期偏离比较大的样品，需重复实验。比较大的样品，需重复实验。谢谢 谢！谢！电话：15238020968，QQ ：458261751，都市巡洋舰如有问题需要交流，请随时联系！