细胞培养技术实用篇.ppt

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1、细胞生物学技胞生物学技术第三章第三章 细胞培养基本技术细胞培养基本技术 王王 云云 动脉粥样硬化研究所动脉粥样硬化研究所细胞培养的优点细胞培养的优点活活细胞：胞：长时间、直接、直接观察、研究活察、研究活细胞的胞的形形态、结构和生命活构和生命活动可可控制：控制：选择特定的特定的细胞种胞种类、性、性质、阶段段可可控制控制调节条件：物理、化学、生物等条件：物理、化学、生物等可可采用各种研究技采用各种研究技术、记录方法方法样品均一品均一性：来源于同一性：来源于同一组织同一种同一种细胞胞经济、规模模局限性局限性人工模人工模拟的条件和体内的条件和体内实际情况仍不完全相情况仍不完全相同同缺乏体内缺乏体内的系

2、的系统作用、失去神作用、失去神经体液的体液的调节和和细胞相互胞相互间的影响的影响体外体外培养的培养的细胞生活在缺乏胞生活在缺乏动态平衡的平衡的环境境环境中，必然境中，必然发生生变化。化。本章主要内容本章主要内容细胞培养的基本操作技术细胞培养的基本操作技术原代培养原代培养(primary culture)(primary culture)传代培养传代培养(subculture)(subculture)体外培养细胞的体外培养细胞的影响因素影响因素细胞培养细胞培养污染及对策污染及对策培养细胞的培养细胞的生长测定生长测定方法方法细胞细胞冻存和复苏冻存和复苏细胞培养中的常用术语细胞培养中的常用术语组组织

3、织培培养养(Tissue (Tissue Culture)Culture)： 指指的的是是从从体体内内取取出出组组织织，模模拟拟体体内内生生理理环环境境，使使之之生生存存和和生生长长并并维持其结构和功能的方法。维持其结构和功能的方法。器器官官培培养养（Organ Organ CultureCulture）： 培培养养的的是是器器官官的的原原基基、器器官官的的一一部部分分或或整整个个器器官官，使使之之在在体体外外生生存、生长和保持一定功能的方法。存、生长和保持一定功能的方法。细细胞胞培培养养(Cell (Cell Culture)Culture)： 培培养养物物是是单单个个细细胞胞和细胞群。和细

4、胞群。细胞培养中的常用术语细胞培养中的常用术语原原代代培培养养（primary primary cultureculture）：从从体体内内取取出出细细胞或组织的第一次培养。胞或组织的第一次培养。传传代代（passagepassage）也也称称再再培培养养。无无论论是是否否稀稀释释，将将细细胞胞从从一一个个培培养养瓶瓶转转移移或或移移植植到到另另一一个个培培养养瓶瓶即称为传代或传代培养。也称再培养。即称为传代或传代培养。也称再培养。细细胞胞系系（cell cell lineline）：原原代代培培养养物物经经首首次次传传代代成功后即为细胞系成功后即为细胞系细胞培养中的常用术语细胞培养中的常用术

5、语细胞株（细胞株（cell straincell strain）：通过选择法或克隆形成法：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养物称细胞株。志的培养物称细胞株。汇汇合合（confluentconfluent）：细细胞胞相相互互连连接接成成片片占占据据所所有有底底物面积。物面积。接触抑制（接触抑制（contact inhibitioncontact inhibition）：细胞汇合相互）：细胞汇合相互接触后失去运动的现象接触后失去运动的现象一、细胞培养基本操作技术一、细胞培养基本操作技术 由于由于体外培养体外培养的的

6、细胞没有细胞没有抗感染抗感染能力，能力，因此因此防污染防污染是决定是决定培培养成功养成功的首要条件的首要条件。一切一切操作需要操作需要保证保证无菌无菌和和有条不紊。有条不紊。培养前准备培养前准备制定制定好好实验计划和操作实验计划和操作程序程序有关有关数据的计算要事先做好。数据的计算要事先做好。准备准备各种所需器材和各种所需器材和物品，清点物品，清点无误后将其无误后将其放置放置在操作在操作场所场所( (培养室、超净台培养室、超净台) )内，然后开始消毒内，然后开始消毒。避免避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。染机会。消毒消毒地面地面每天每天都要

7、用都要用0.2%0.2%的新洁尔灭拖洗地面的新洁尔灭拖洗地面次次( (拖布拖布要专用要专用) )，紫外线照射消毒，紫外线照射消毒30-50min30-50min超超净工作台台面净工作台台面每次实验前要用每次实验前要用7575酒精擦洗。然后酒精擦洗。然后紫外线消毒紫外线消毒30min30min。消毒消毒时工作台面上时工作台面上用品用品布局合理布局合理，不要，不要过多过多或重叠放或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果置，否则会遮挡射线降低消毒效果。一些一些操作用具操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用用75%75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。酒精擦洗后

8、置于台内同时紫外线消毒。 洗手和着装洗手和着装原则上和外科手术相同原则上和外科手术相同。仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外线照射线照射30min30min的清洁的清洁工作服工作服在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用7575酒精消酒精消毒手毒手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。 专用鞋或专用鞋或带鞋套带鞋套火焰消毒火焰消毒在无菌环境进行培养或做其它无

9、菌工作时，首先在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要要点燃酒精灯点燃酒精灯。按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。处并经过烧灼进行。如实验用品需火焰灭菌，如实验用品需火焰灭菌，冷却冷却后接触培养细胞，后接触培养细胞，以防烧死细胞。以防烧死细胞。操作操作进行培养时，动作要进行培养时，动作要准确敏捷准确敏捷不能不能太快，太快，否则否则空气流动增加污染机会。空气流动增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。用火焰烧灼消毒或取备品更换。 组织细胞取材及培养的基本

10、要求组织细胞取材及培养的基本要求l取材的组织用培养液浸泡，取材的组织用培养液浸泡，44运送，运送，24h24h内尽快培养。内尽快培养。l取材取材时应严格时应严格无菌无菌操作，避免对组织的机械损伤，尽量操作，避免对组织的机械损伤，尽量去除脂肪、神经、结缔、坏死组织，污染组织可用青链去除脂肪、神经、结缔、坏死组织，污染组织可用青链霉素和制霉菌素漂洗。霉素和制霉菌素漂洗。l原代培养原代培养，特别是正常细胞的培养，应采用，特别是正常细胞的培养，应采用营养丰富营养丰富的的培养液。培养液。l一般来讲一般来讲, ,胚胎组织较成熟个体的组织容易培养胚胎组织较成熟个体的组织容易培养; ;分化低分化低的较分化高的

11、组织容易生长的较分化高的组织容易生长; ;肿瘤组织较正常组织容易肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用培养。取材时应尽量选用易培养易培养的组织进行培养。的组织进行培养。l为了为了便于以后鉴别原代组织的来源和观察细胞体外培养便于以后鉴别原代组织的来源和观察细胞体外培养与原组织的差异性，原代取材同时保留组织学和电镜标与原组织的差异性，原代取材同时保留组织学和电镜标本，对供体来源、部位及一般情况做记录。本，对供体来源、部位及一般情况做记录。组织材料的分离组织材料的分离机械机械法法：适于较：适于较柔软柔软的组织，如脑、脾、淋巴结、的组织，如脑、脾、淋巴结、胸腺等。剪切组织为胸腺等。剪切组织为1m

12、m1mm3 3碎块后，置于组织匀浆碎块后，置于组织匀浆器研磨或用注射器针芯挤压后过不锈钢筛网器研磨或用注射器针芯挤压后过不锈钢筛网。化学化学法法：胰蛋白酶、胶原酶、：胰蛋白酶、胶原酶、EDTAEDTA法法细胞悬液细胞悬液的分离方法：低速离心法、密度梯度离的分离方法：低速离心法、密度梯度离心法心法细胞悬液的分离方法细胞悬液的分离方法低速离心低速离心法法： 血液和体液等细胞悬液血液和体液等细胞悬液500-500-1000rpm1000rpm离心离心5-10min5-10min。离心速度过大、时间过。离心速度过大、时间过长，会造成细胞损伤和死亡。长，会造成细胞损伤和死亡。密度梯度离心密度梯度离心法法

13、： 用离心法将细胞分到不同用离心法将细胞分到不同密度的梯度介质中，再分别吸出各层细胞。适密度的梯度介质中，再分别吸出各层细胞。适于分离密度不等的细胞。常用介质有于分离密度不等的细胞。常用介质有Ficoll Ficoll 400400，PercollPercoll，泛影葡胺等。，泛影葡胺等。胰蛋白酶胰蛋白酶（TRYPSINTRYPSIN） 对细胞间的蛋白质水解，使细胞离散。对细胞间的蛋白质水解，使细胞离散。消化效果与消化效果与PHPH值、温度、酶浓度和组织块大小与值、温度、酶浓度和组织块大小与硬度有关。硬度有关。适于消化细胞间质较少的适于消化细胞间质较少的软组织，软组织，能有效地分离能有效地分离

14、肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织，如乳腺、滑膜、而对含结缔组织较丰富的组织，如乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等无效但若与胶原子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等无效但若与胶原酶合用能增加其对组织的分离作用酶合用能增加其对组织的分离作用 。钙镁离子和血清抑制其活性钙镁离子和血清抑制其活性。常用剂量为常用剂量为0.25%0.25%，PH8PH8，温度，温度3737胶原酶法（胶原酶法（COLLAGENASECOLLAGENASE） 水解水解结缔组织中胶原蛋白成分，中胶原蛋白成分，对上皮上皮细胞胞影响不大。影响不大。产品有品

15、有 等型，分等型，分别适用于分离肝适用于分离肝细胞、胰胞、胰岛、脂肪、脂肪细胞及胞及纤维组织。钙镁离子和血清不影响活性离子和血清不影响活性，PH6.5-7PH6.5-7常用常用剂量量为200U/ml200U/mlEDTAEDTA法法EDTAEDTA能与能与细胞上的胞上的钙、镁离子离子结合形成整合物，合形成整合物，利用利用结合后的机械力使合后的机械力使细胞胞变圆而分散而分散细胞或胞或使使贴壁壁细胞从瓶壁上脱离。胞从瓶壁上脱离。缺点是缺点是细胞易裂解或胞易裂解或贴壁壁细胞从瓶壁上脱离胞从瓶壁上脱离时呈片状，有呈片状，有团块，常不，常不单独使用，可与独使用，可与胰蛋白胰蛋白酶混合使用混合使用(1(1

16、：1 1或或2 2：1)1)，既利于，既利于细胞脱壁又胞脱壁又利于利于细胞分散。可降低胰胞分散。可降低胰酶的用量和毒性作用。的用量和毒性作用。EDTAEDTA工作液的工作液的浓度度为0.020.02，用用不含不含钙、镁PBSPBS配制。配制。二、二、原代培养原代培养(PRIMARY CULTURE)(PRIMARY CULTURE)从直接取自生物体从直接取自生物体细胞、胞、组织或器官开始的或器官开始的培养，即将培养，即将动物机体的各种物机体的各种组织从机体中取出，从机体中取出，经各种各种酶（常用胰蛋白（常用胰蛋白酶）、螯合）、螯合剂（常用（常用EDTAEDTA）或机械方法）或机械方法处理，分散

17、成理，分散成单细胞，置合胞，置合适的培养基中培养，使适的培养基中培养，使细胞得以生存、生胞得以生存、生长和和繁殖的繁殖的过程。程。原代培养细胞原代培养细胞组织和和细胞胞刚刚离体，生物学特性未离体，生物学特性未发生很大生很大变化，仍具有二倍体化，仍具有二倍体遗传性，最接近和反映体性，最接近和反映体内生内生长特性，是特性，是药物物测试、细胞分化等胞分化等实验的的很好很好对象象；原代原代细胞培养胞培养也是建立各种也是建立各种细胞系（胞系（cell cell line)line)或或细胞株（胞株（cell straincell strain）必）必须经过的的阶段。段。原代原代细胞培养多由各种胞培养多由

18、各种细胞成分胞成分组成，比成，比较复复杂，即使是，即使是经过处理后的理后的细胞，也仍具有胞，也仍具有异异质性（性（heterogeneous),heterogeneous),主要表主要表现在在细胞形胞形态和大和大小不一小不一原代培养的方法原代培养的方法悬浮浮细胞培养胞培养法法器官培养法器官培养法组织块培养培养法法细胞培养胞培养法法悬浮细胞培养法悬浮细胞培养法对于于悬浮生浮生长的的细胞如白血病胞如白血病细胞、淋巴胞、淋巴细胞、骨髓胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌胞、胸水和腹水中的癌细胞和免胞和免疫疫细胞无胞无须消化，可采用低速离心分离消化，可采用低速离心分离, ,直接直接培养。培养。器官培养器官培

19、养( (ORGAN CULTUREORGAN CULTURE) )指指组织、器官原基，以至整个器官或其、器官原基，以至整个器官或其一部分在体外的一部分在体外的维持或生持或生长，它，它们可以可以分化与保持原来的分化与保持原来的结构与功能。构与功能。细胞培养细胞培养法法方法与步骤方法与步骤1) 1) 动物物处死死：将出生：将出生2 23d3d乳鼠乳鼠， 用用脱脱颈方法方法处死。用酒精死。用酒精棉球棉球 擦拭擦拭解剖部位解剖部位。2) 2) 取材取材及剪切及剪切：在无菌条件下：在无菌条件下将将 组织取出，置于无菌培养皿中取出，置于无菌培养皿中， 剪剪去多余的去多余的组织（脂肪等（脂肪等），）， 用用

20、PBSPBS液洗液洗涤1-21-2次；放入另一次；放入另一 培养皿培养皿中，将中，将组织剪成剪成1mm1mm3 3大大 小小的的块。细胞培养法细胞培养法方法与步骤方法与步骤3) 3) 消化消化及分散及分散组织块：将上述清洗将上述清洗过的的组织放放入无菌入无菌试管内，加入管内，加入5 56 6倍量的倍量的0.250.25胰蛋白胰蛋白酶液（液（pH7.4 pH7.4 7.67.6），置），置3737水浴中消化水浴中消化20 20 40min40min，每隔，每隔10min10min摇动一次，直到一次，直到组织块变得疏松，粘稠，且得疏松，粘稠，且颜色略色略变为白色白色为止。取出止。取出试管，加入管，

21、加入5ml5ml培养液，用吸管反复吹打培养液，用吸管反复吹打组织块，使其分散成使其分散成细胞胞悬液，将液，将细胞胞悬液用两液用两层灭菌菌纱布布过滤至另一至另一烧杯中。杯中。 细胞培养法细胞培养法方法与步骤方法与步骤4)计数与稀数与稀释: :从从过滤的的细胞胞悬液中取出适量滴于液中取出适量滴于血血细胞胞计数板上，按白数板上，按白细胞胞计数法数法进行行计数；数；计数数后用培养液稀后用培养液稀释，稀，稀释后的后的浓度一般以每毫升含度一般以每毫升含3 3 5 5105105个个细胞胞为宜。宜。5)5)分装与培养分装与培养：将稀：将稀释好的好的细胞胞悬液分装于液分装于细胞培胞培养瓶养瓶 or or 培养

22、皿中，盖好，做好培养皿中，盖好，做好标记，置于，置于37 37 CO2CO2培养箱中培养。培养箱中培养。6)6)观察察：逐日：逐日检查培养物是否培养物是否污染，染，观察察细胞生胞生长情况。待情况。待细胞已基本胞已基本长成致密成致密单层时，即可，即可进行行传代培养。代培养。细胞培养细胞培养法法注意事项注意事项取材取材的的组织最好尽快培养最好尽快培养，若不能及，若不能及时培养，可将培养，可将组织浸泡于浸泡于培养液内放置于冰浴或培养液内放置于冰浴或4 40 0C C冰箱。若冰箱。若组织块很大，很大，应先将其切成先将其切成1cm21cm2以下的小以下的小块再低温保存，但再低温保存，但时间不能超不能超过

23、2424小小时，因放置，因放置时间长或或组织块太大都易造成太大都易造成细胞的死亡；胞的死亡；取材取材时严格无菌操作格无菌操作。用用预先消毒好的器皿和先消毒好的器皿和带有少量培养液的有少量培养液的培养瓶培养瓶进行取材。所取行取材。所取组织要尽量避免紫外要尽量避免紫外线照射或接触任何化学照射或接触任何化学试剂及有害及有害药物如碘、汞等物如碘、汞等。3 3. . 取材取材时要要细心去除心去除组织中的血液、中的血液、结缔组织、脂肪及坏、脂肪及坏死死组织等。等。修剪和切碎修剪和切碎过程中，程中，为避免避免组织干燥，可将其浸泡于干燥，可将其浸泡于少量培养液中少量培养液中；组织块培养法组织块培养法组织块培养

24、培养是常用、是常用、简便易行和成功率便易行和成功率较高高的原代培养方法，也是早期采用培养的原代培养方法，也是早期采用培养细胞的方胞的方法，故也被称法，故也被称为组织培养培养(tissue culture)(tissue culture)。 组织块培养法组织块培养法(1(1) ) 取材取材、修剪、修剪、组织剪或切成剪或切成1mm1mm3 3左右的小左右的小 块。(2)(2)将将 剪切剪切好的好的组织小小块用眼科用眼科镊送入培送入培 养养 瓶内。瓶内。25ml25ml培养瓶培养瓶( (底面底面积约为17.5cm17.5cm2 2）以）以2020一一3030小小块为宜。宜。(3(3) ) 放置放置2

25、 24h4h待待组织小小块贴附后将培养瓶慢附后将培养瓶慢慢翻慢翻转平放、静止培养平放、静止培养注意事项注意事项组织块接种后接种后l-3l-3天天，游出，游出细胞数很少胞数很少, ,组织块的粘的粘贴不牢固。不牢固。观察、移察、移动过程中要注意程中要注意动作作轻巧巧。尽量不要引起液体的振尽量不要引起液体的振荡而而产生生对组织块的冲的冲击力使其漂起。力使其漂起。在原代培养的在原代培养的1-2d1-2d内要持内要持别注意注意观察察，是否，是否有有细菌、霉菌的菌、霉菌的污染。一旦染。一旦发现，要及，要及时清除，清除，以防以防给培养箱内的其它培养箱内的其它细胞胞带来来污染。染。原代培养原代培养3-5d3-

26、5d需需换液液一次，去除漂浮的一次，去除漂浮的组织块和残留的血和残留的血细胞胞，以免影响，以免影响原代原代细胞的胞的生生长。几种细胞的原代培养图示几种细胞的原代培养图示1.细胞种胞种类：人肺：人肺 部部 成成 纤 维 细 胞胞 ；2.培养的天数：培养的天数：2D - 4D - 7D;3.放大倍数：放大倍数： 200倍倍 ；4.培养基种培养基种类：1640+10%胎牛血清；胎牛血清；5.细胞状胞状态与特征与特征简述述:细胞呈梭形，胞呈梭形，贴壁生壁生长; 几种细胞的原代培养图示几种细胞的原代培养图示 1. 细胞种胞种类：小鼠胚：小鼠胚胎胎成成纤维细胞胞 2. 培养的天数：培养的天数：4d； 3.

27、 放大倍数：放大倍数：倒置倒置显微微镜 ； 4. 培养基种培养基种类：1640+10%X小牛血清小牛血清； 5. 5. 细胞胞状状态与特征与特征简述述:细胞呈胞呈长梭形，梭形，贴壁壁生生长 几种细胞的原代培养图示几种细胞的原代培养图示神神经元原代培养元原代培养:神神经元是高度分元是高度分化的化的细胞胞,在体外培养条件下在体外培养条件下难以以增殖增殖.因此因此,目前神目前神经元的培养主元的培养主要用于原代培养要用于原代培养.神神经元胞体呈元胞体呈圆形或形或长杆状杆状,核大核大而而圆,核仁明核仁明显.可可见有有细小突起小突起从胞体从胞体长出出.培养液中需加入高培养液中需加入高浓度的葡萄糖度的葡萄糖

28、,以利于神以利于神经元的生元的生长.三、传代培养三、传代培养(PASSAGE OR SUBCULTURE)(PASSAGE OR SUBCULTURE)细胞在培养瓶胞在培养瓶长成致密成致密单层后，已基本上后，已基本上饱和，和，为使使细胞能胞能继续生生长，同，同时也将也将细胞数量胞数量扩大，就必大，就必须进行行传代（再培养）。代（再培养）。不不论是否是否稀稀释，将，将细胞以一个培养瓶胞以一个培养瓶转移或移植到另一移或移植到另一个培养瓶即称个培养瓶即称为传代或代或传代培养代培养(passage)(passage)。细胞的传代培养细胞的传代培养根据根据细胞生胞生长的特点，的特点，传代方法有代方法有2

29、 2种。种。悬浮生浮生长细胞胞传代代离心法离心法传代：离心（代：离心（1000rpm1000rpm）去上清，沉淀物加去上清，沉淀物加新培养液后再混匀新培养液后再混匀传代。代。直接直接传代法：代法：悬浮浮细胞沉淀在瓶壁胞沉淀在瓶壁时，将上清培，将上清培养液去除养液去除l l2 22 23 3，然后用吸管直接吹打形成，然后用吸管直接吹打形成细胞胞悬液再液再传代代。细胞的传代培养细胞的传代培养贴壁生壁生长细胞胞传代代 采用采用酶消化法消化法传代。在代。在传代代时，需要用，需要用胰蛋白胰蛋白酶将将细胞消化，使其从支持物上脱落，胞消化，使其从支持物上脱落，或用或用EDTAEDTA溶液与胰蛋白溶液与胰蛋白

30、酶按按1 1：1 1或或2 2：1 1比例混比例混合后合后联合使用。常用的消化液有合使用。常用的消化液有0.250.25的胰蛋的胰蛋白白酶液。液。 Optimal confluency for moving cells to a new dish is 70-80%too low, cells will be in lag phase and wont proliferateToo high and cells may undergo unfavorable changes and will be difficult to remove from plate贴壁生长细胞传代方法贴壁生长细胞传代

31、方法酶酶消化过程消化过程酶消化过程酶消化过程注意问题注意问题操作全操作全过程注意无菌操作程注意无菌操作胰胰酶消化消化时间要适度要适度吹打吹打细胞胞时用力要适度，尽量减少气泡用力要适度，尽量减少气泡贴壁生长细胞的贴壁生长细胞的生长过程生长过程游离期游离期贴壁壁期期潜伏期潜伏期对数生数生长期期停止停止期（平台期）期（平台期）游离期游离期细胞接种后在培养液中呈胞接种后在培养液中呈悬浮状浮状态，也称，也称悬浮期浮期细胞胞质回回缩，胞，胞质呈呈圆球形球形1010分分钟-4-4小小时贴壁期贴壁期细胞附着于底物上，游离期胞附着于底物上，游离期结束。束。底物：胶原、玻璃、塑料等底物：胶原、玻璃、塑料等细胞株平

32、均在胞株平均在1010分分钟-4-4小小时贴壁壁血清血清中有促使中有促使细胞胞贴壁的冷析球蛋白和壁的冷析球蛋白和纤粘素、粘素、胶原等糖蛋白。胶原等糖蛋白。进口塑料培养瓶涂有生口塑料培养瓶涂有生长基基质（化学合成的功能（化学合成的功能基基团）潜伏期、对数生长期、停止期潜伏期、对数生长期、停止期潜伏期潜伏期：细胞有生胞有生长活活动，而无，而无细胞分裂，胞分裂，细胞株潜伏期一般胞株潜伏期一般为6-246-24小小时。对数生数生长期期：细胞数随胞数随时间变化成倍增化成倍增长，活力最佳，最适合活力最佳，最适合进行行实验研究。研究。停止停止期期：细胞胞长满瓶壁，瓶壁，虽有活力但不再分有活力但不再分裂，机制

33、裂，机制为接触抑制、密度依接触抑制、密度依赖性。性。四、影响体外培养细胞的因素四、影响体外培养细胞的因素组织和和细胞供体年胞供体年龄培养条件培养条件细胞的粘附胞的粘附培养技培养技术方法方法促生促生长因子因子组织和细胞供体年龄组织和细胞供体年龄幼年个体比老年者易于培养，所有幼年个体比老年者易于培养，所有动物的胚物的胚胎胎组织都是最好的培养都是最好的培养对象。象。来自来自同一个体的同一个体的组织，分化低的比分化高的，分化低的比分化高的容易培养。容易培养。培养条件培养条件不同的不同的细胞胞对培养基培养基需求不同，当前尚无一种培需求不同，当前尚无一种培养基是万能的，养基是万能的，应选择相相应的培养基。

34、的培养基。应了解所了解所培养培养细胞的生物学性状和特殊需求成分。胞的生物学性状和特殊需求成分。细胞在体外胞在体外进行培养，失去了机体的行培养，失去了机体的调节和控制。和控制。因此，除因此，除满足足营养的要求外，养的要求外，还必必须使使细胞生存胞生存环境尽量接近活体的境尽量接近活体的环境。外境。外环境的培养条件如境的培养条件如温度、渗透温度、渗透压、气体、气体环境、境、PHPH值等均能影响等均能影响细胞胞的生的生长。细胞贴附的过程细胞贴附的过程影响细胞贴附的因素影响细胞贴附的因素细胞胞类型型 ( (附着最附着最强) )巨噬巨噬细胞一成胞一成纤维细胞胞上皮上皮细胞胞血血细胞胞( (最弱最弱) )

35、生物因素生物因素 血清、培养液中的促附着因子血清、培养液中的促附着因子 机械，物理等其他因素机械，物理等其他因素离心：促离心：促进附着附着流流动：培养液流：培养液流动可阻止可阻止细胞附着胞附着低温：可抑制附着低温：可抑制附着促生长因子促生长因子现已已证明，很多激素如胰明，很多激素如胰岛素、素、氢化可的松等具有促化可的松等具有促进细胞生胞生长作用。胰作用。胰岛素能促素能促进细胞利用葡萄糖和氨胞利用葡萄糖和氨基酸，用量基酸，用量为1 110U/ml10U/ml。氢化可的松可促化可的松可促进表皮表皮细胞胞和乳腺上皮和乳腺上皮细胞生胞生长，并能提高胶，并能提高胶质细胞和成胞和成纤维细胞的克隆形成率，用

36、量胞的克隆形成率，用量为1010-8-8 1010-7-7mol/Lmol/L。人表皮生人表皮生长因子（因子（hEGF)hEGF)对大鼠大鼠宫颈鳞状上皮状上皮细胞胞(RCEC)(RCEC)有促有促进增殖的作用。增殖的作用。表皮生表皮生长因子因子(EGF(EGF) )、成、成纤维细胞生胞生长因子因子(FGF(FGF) )等生等生长调节因子都能促因子都能促进细胞的生胞的生长和增殖。和增殖。五、细胞培养污染及对策五、细胞培养污染及对策培养培养细胞生胞生长状况常状况常规检查培养液：培养液：颜色与透明度的色与透明度的变化化细胞胞生生长状况。状况。细胞胞形形态变化。化。微生物微生物污染染培养液培养液PHP

37、H值值（颜色（颜色变化）变化）变黄，表示黄，表示PHPH值下降，下降，细胞生胞生长旺盛，代旺盛，代谢产生的酸性物不断生的酸性物不断积累累导致。致。变红或紫或紫红色，表示色，表示PHPH值上升，上升，细胞生胞生长停停滞、死亡。滞、死亡。一般生一般生长稳定的定的细胞需要胞需要2-32-3天天换液液1 1次，生次，生长慢的慢的细胞需要胞需要3-43-4天天换液一次。液一次。细胞换液细胞换液原代原代细胞胞经2424小小时培养，培养液培养，培养液颜色色变浅，表示浅，表示细胞代胞代谢好。少量好。少量换液可刺激液可刺激细胞生胞生长。通常每周两次，每次通常每周两次，每次换半量或半量或1/5-1/31/5-1/

38、3量。原代量。原代细胞第胞第1 1次次换液液时，切，切记不要把培养液全部倒掉不要把培养液全部倒掉。细胞株（系）胞株（系）：条件合适条件合适时生生长迅速，迅速，过夜就夜就变黄，可黄，可进行全量行全量换液。液。这种情况下，最好减少种情况下，最好减少细胞接种数，延胞接种数，延长换液的液的时间。细胞生长状况细胞生长状况常常规应特特别注意注意细胞的生胞的生长增殖情况。增殖情况。原代原代细胞：胞：经历一个适一个适应或潜伏期。或潜伏期。细胞系：多胞系：多为2424小小时以内。以内。细胞胞长满瓶底瓶底80%80%时应及及时传代。代。细胞形态变化细胞形态变化生生长良好良好细胞：透明度大，折光性胞：透明度大，折光

39、性强，轮廓廓不清。不清。生生长状状态不良不良时，细胞折光性胞折光性变弱，弱，轮廓增廓增强，胞，胞质中常出中常出现空泡，脂滴，空泡，脂滴，颗粒粒样物物质，细胞之胞之间空隙加大。空隙加大。微生物污染微生物污染培养液培养液颜色与透明度：色与透明度：培养液混培养液混浊，液体内漂菌，液体内漂菌丝或或细胞菌。胞菌。支原体支原体污染，没有明染，没有明显症状，但症状，但细胞生胞生长却却明明显变缓。细胞培养污染的概念细胞培养污染的概念不不仅仅指微生物，包括所有混入培养指微生物，包括所有混入培养环境中境中对细胞生存有害的成份和造成胞生存有害的成份和造成细胞不胞不纯的异物，因此的异物，因此一般包括一般包括微生物微生

40、物( (真菌、真菌、细菌、病毒和支原体菌、病毒和支原体) )、化学物化学物质( (影响影响细胞生存、非胞生存、非细胞所需的化学成胞所需的化学成份份) )及及细胞胞( (非同一种的其它非同一种的其它细胞胞) )。其中以微生。其中以微生物物污染最多染最多见。另外随着。另外随着细胞种胞种类增多不同种增多不同种细胞交叉胞交叉污染也染也时有有发生、从而造成生、从而造成细胞不胞不纯。污染的途径污染的途径空气空气：空气是微生物：空气是微生物传播的最主要途径。播的最主要途径。 净化化工作台使用工作台使用过久，久，滤器受器受尘埃阻塞，可使埃阻塞，可使净化工作不能正常化工作不能正常进行行工作工作时不戴口罩或面不戴

41、口罩或面对操作野大声操作野大声讲话、咳嗽等、咳嗽等使外界气流使外界气流过强减少减少空气流空气流动是防止是防止污染的重要染的重要环节。污染的途径污染的途径器材器材：各种培养器皿及器械清洗消毒不：各种培养器皿及器械清洗消毒不彻底底 洗刷洗刷不干不干净，污物残留及培养用液等物残留及培养用液等灭菌不菌不彻底底CO2CO2温箱由于温箱内湿度大，温度适宜，取存温箱由于温箱内湿度大，温度适宜，取存细胞胞时不慎将培养液漏出，易使不慎将培养液漏出，易使细菌、霉菌孽生，菌、霉菌孽生，而而CO2CO2温箱内是开放式培养如不定期消毒温箱内是开放式培养如不定期消毒, ,可形可形成成污染染. .污染的途径污染的途径操作操

42、作无菌无菌观念不念不强、动作不准确、使用作不准确、使用污染的器具或染的器具或封瓶封瓶时不不严培养培养两种以上两种以上细胞胞时，操作不，操作不规范、交叉使用吸范、交叉使用吸管或管或营养液瓶等有可能养液瓶等有可能导致致细胞交叉胞交叉污染。染。污染的途径污染的途径血清血清：有些血清在生：有些血清在生产时就已被支原体或病就已被支原体或病毒等毒等污染，即可成染，即可成为污染的来源。染的来源。组织样本本：原代培养的：原代培养的污染多数来源于染多数来源于组织样本；另一方面手本；另一方面手术时使用碘酒消毒，使用碘酒消毒，这些混些混入入组织中的碘可以影响中的碘可以影响细胞生胞生长。污染对细胞的影响污染对细胞的影

43、响支支原体和病毒原体和病毒对细胞的形胞的形态和机能的影响是和机能的影响是长期期的、的、缓慢的和潜在慢的和潜在的的霉菌霉菌和和细菌菌繁殖迅速，能在很短繁殖迅速，能在很短时间内内压制制细胞胞生生长或或产生有毒物生有毒物质杀灭细胞。胞。化学物化学物质污染染如重金属或其它化学如重金属或其它化学试剂混入培养混入培养液中后，有的毒性液中后，有的毒性较小、如能及小、如能及时排出，排出，细胞仍胞仍可存活但有些可存活但有些烃化物如多化物如多环芳芳烃等有致突等有致突变性，性，能能导致致细胞胞发生生转化化细菌的污染和检测细菌的污染和检测细菌菌污染是染是实验室室细胞培养中常胞培养中常见的的污染，即使染，即使在在细胞培

44、养液中加入了抗菌素，也可能因胞培养液中加入了抗菌素，也可能因为操作操作不慎而引起不慎而引起污染。最常染。最常见的有的有革革兰氏阳性菌，如氏阳性菌，如枯草杆菌、白色葡萄球菌，枯草杆菌、白色葡萄球菌， 以及以及大大肠杆菌、假杆菌、假单胞菌等革胞菌等革兰氏阴性菌。氏阴性菌。 培养培养细胞受胞受细菌菌污染染后，会出后，会出现培养液培养液变混混浊，pHpH改改变。污染后染后细胞胞发生病理改生病理改 变，胞内，胞内颗粒增多、增粗，最后粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。脱落死亡。细菌污染细菌污染细菌污染的检测细菌污染的检测肉眼直接肉眼直接观察法察法培养培养检查法法显微微镜观察法察法PCRPCR检测真菌污染真菌

45、污染真菌真菌污染是染是细胞培养胞培养过程中最常程中最常见的一种，最常的一种，最常见的的真菌有真菌有烟曲霉、烟曲霉、 黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。菌和酵母菌。培养培养细胞受胞受真菌真菌污染后，可染后，可见培养液中漂浮着白色或培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，肉眼可浅黄色的小点，肉眼可见；有的散在生；有的散在生长，倒置，倒置显微微镜下可下可见丝状、管状或状、管状或树枝状的菌枝状的菌丝纵横交横交错在在细胞胞之之间或培养基中，有的呈或培养基中，有的呈链状排列，培养液一般不状排列，培养液一般不发生生浑浊。真菌。真菌污染后，染后，细胞生胞生长变慢，但最后由于

46、慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡胞脱落死亡真菌污染真菌污染支原体污染和检测支原体污染和检测支原体是介于支原体是介于细菌与病毒之菌与病毒之间能独立生活的最小能独立生活的最小微生物，最小直径微生物，最小直径0.2um0.2um，一般，一般过滤除菌除菌无法去无法去除它，光除它，光镜下下难以看清它的形以看清它的形态结构。开始不易构。开始不易发现，能在偏碱条件下生存，能在偏碱条件下生存，对青霉素有抗青霉素有抗药性。性。多吸附于多吸附于细胞表面或散在于胞表面或散在于细胞之胞之间。培养培养细胞受支原体胞受支原体污染后，部分敏感染后，部分敏感细胞可胞可见细胞生胞生长增殖增殖

47、变慢，部分慢，部分细胞胞变圆，从瓶壁脱落。，从瓶壁脱落。但多数但多数细胞胞污染后无明染后无明显变化，或略有化，或略有变化，若化，若不及不及时处理，理，还会会产生交叉生交叉污染。染。扫描描电镜法法显示支原体，附于示支原体，附于细胞表面众多的胞表面众多的圆形形颗粒粒为支原体支原体支原体污染的检测支原体污染的检测相差相差显微微镜观察法察法Hayflick Hayflick 培养基直接培养法培养基直接培养法DNADNA荧光染色法（光染色法（Hoechst 33258Hoechst 33258）PCRPCR方法（即用型方法（即用型细胞培养中支原体胞培养中支原体检测PCRPCR试剂盒）盒）病毒的污染和检测

48、病毒的污染和检测细胞的直接胞的直接观察察动物接种物接种检查电子子显微微镜观察察PCRPCR技技术污染的预防污染的预防防止防止污染，染，预防防是关是关键，预防措施防措施应贯穿于整个穿于整个细胞培养的胞培养的始始终。器皿器皿准准备开始操作开始操作前前操作操作过程程中中其他其他细节方面的方面的预防防在在培养液中加入适量的培养液中加入适量的抗菌素抗菌素。常。常规加入青霉素和加入青霉素和链霉素各霉素各100U/ml100U/ml。必要。必要时加入加入庆大霉素、卡那霉素或两性霉素大霉素、卡那霉素或两性霉素B B等。等。培养箱内培养箱内应经常清常清洁消毒，放置含硫酸消毒，放置含硫酸铜的消毒水。的消毒水。购入

49、的未入的未灭活血清活血清应采取采取5656水浴水浴灭活活30min30min的措施以使血清的措施以使血清中的中的补体和支原体体和支原体灭活活。支原体污染的预防支原体污染的预防小牛小牛血清血清是造成支原体初是造成支原体初级污染的主要染的主要来源来源次次级污染源，即已染源，即已污染支原体的染支原体的细胞在胞在污染的染的传播中更播中更为重要重要保保证培养培养细胞的胞的来源来源绝对干干净，同，同时应做好做好检测，一旦，一旦发现支支原体原体污染就染就应废弃弃严禁已知禁已知污染了支原体的染了支原体的细胞胞进入未入未污染的工作区域。染的工作区域。严格格无菌操作无菌操作，杜，杜绝人人为污染。染。对每批小牛血清

50、每批小牛血清严格格检查，灭活、活、过滤有利于抑制支原体的有利于抑制支原体的污染。染。污染的清除污染的清除培养的培养的细胞一旦胞一旦污染染应及及时处理，防止理，防止污染染其他其他细胞胞。高高压灭菌菌被被污染的染的细胞，然后弃掉胞，然后弃掉。有价有价值的的细胞被胞被污染，并且染，并且污染程度染程度较轻，可以通可以通过及及时排除排除污染物，挽救染物，挽救细胞恢复胞恢复正常正常常用常用的排除微生物的排除微生物污染的方法有以下染的方法有以下4 4种种抗生素排除法抗生素排除法抗生素是抗生素是细胞培养中胞培养中杀灭细菌菌的主要手段的主要手段。联合合应用用比比单用效果好，用效果好，预防性防性应用比用比污染后染

51、后应用用好好有有的抗生素的抗生素对细菌菌仅有抑制作用，无有抑制作用，无杀灭效效应。反复使用抗生素反复使用抗生素还能使微生物能使微生物产生耐生耐药性，而且性，而且对细胞本身也有一定胞本身也有一定影响影响尽量尽量不用抗生素不用抗生素处理理一些一些有价有价值的的细胞被胞被污染后，仍需要用抗生素挽染后，仍需要用抗生素挽救，在救，在这种情况下，可采用种情况下，可采用5 51010倍于常用量的倍于常用量的冲冲击法，加入高法，加入高浓度抗生素后作用度抗生素后作用24244848小小时，再再换入常入常规的培养液，有的培养液，有时可以奏效可以奏效加温除菌加温除菌根据支原体耐根据支原体耐热性能差的特点。有人将受支

52、性能差的特点。有人将受支原体原体污染的染的细胞置于胞置于4141度作用度作用5 51010小小时（最（最长可以达可以达1818小小时）杀灭支支原体原体但是但是4141度度对细胞本身胞本身应有有较大影响，故在大影响，故在处理前，理前，应先先进行行预试验，确定最大限度，确定最大限度杀伤支支原体而原体而对细胞影响胞影响较小的小的处理理时间。 动物体内接种动物体内接种受微生物受微生物污染的染的肿瘤瘤细胞可以接种到同种胞可以接种到同种动物皮下或腹腔，借物皮下或腹腔，借动物体内免疫系物体内免疫系统消消灭掉微掉微生物，生物，肿瘤瘤细胞却能在体内生胞却能在体内生长，待一定，待一定时间，从体内取出再从体内取出再

53、进行培养繁殖。行培养繁殖。与巨噬细胞共培养与巨噬细胞共培养在良好的体外培养条件下巨噬在良好的体外培养条件下巨噬细胞可以存活胞可以存活7 71010天，并可以分泌一些天，并可以分泌一些细胞因子支持其他胞因子支持其他细胞的克隆生胞的克隆生长。巨噬巨噬细胞胞在体外条件下仍然可以吞噬微生物在体外条件下仍然可以吞噬微生物并将其消化并将其消化。利用利用9696孔板将极少培养孔板将极少培养细胞与巨噬胞与巨噬细胞共培胞共培养，可以在高度稀养，可以在高度稀释培养培养细胞、极大地降低微胞、极大地降低微生物生物污染程度地同染程度地同时，更有效地，更有效地发挥巨噬巨噬细胞胞清除清除污染的效能染的效能。与与抗生素抗生素

54、联合合应用效果更佳。用效果更佳。 六、培养细胞生长的测定方法六、培养细胞生长的测定方法细胞胞计数法数法胎胎盘兰染色法染色法MTTMTT比色法比色法细胞生胞生长曲曲线法法 3 3H-TdR(H-TdR(3 3H-H-胸腺胸腺嘧啶核苷）核苷）掺入法入法BrdU (5-bromo-2BrdU (5-bromo-2deoxyuridinedeoxyuridine，5-5-溴溴脱氧尿脱氧尿嘧啶核苷核苷 ）掺入法入法细胞计数法细胞计数法细胞胞计数法是用血数法是用血细胞胞计数板数板计数数细胞胞悬液液中的中的细胞数目，以胞数目，以测定定细胞增殖和胞增殖和调整整细胞胞浓度。度。细胞胞计数数结果以果以细胞数胞数/

55、 /毫升表示毫升表示细胞细胞计数板计数板细胞计数板细胞计数板细胞计数操作步骤细胞计数操作步骤将血球将血球计数板及盖片用数板及盖片用软纱布擦布擦试干干净，并，并将盖片盖将盖片盖在在计数板上。数板上。将将细胞胞悬液吸出少液吸出少许，滴加在盖片，滴加在盖片边缘，使，使悬液充液充满盖片和盖片和计数板之数板之间。静静置置3 3分分钟。镜下下观察，察，计算算计数板四大格数板四大格细胞胞总数数，压线细胞只胞只计左左侧和上方的和上方的细胞计数操作步骤细胞计数操作步骤按下按下式式计算：算：（细胞胞悬液的液的细胞数）胞数）/ml/ml （四（四个大格子个大格子细胞数胞数/4)/4)稀稀释倍数倍数10104 4 /

56、ml /ml公式中除以公式中除以4 4因因为计数了数了4 4个大格的个大格的细胞数胞数。公式公式中乘以中乘以10104 4因因为计数板中每一个大格的体数板中每一个大格的体积为： 1.0mm1.0mm（长）1.0mm1.0mm（宽）0.1mm0.1mm（高）（高）0.10.1mmmm3 3 而而 1ml1ml10001000mmmm3 3 。细胞计数注意细胞计数注意事项事项要求要求悬液中液中细胞数目不低于胞数目不低于10104 4个个/ml/ml，如果，如果细胞数目很少要胞数目很少要进行离心再行离心再悬浮于少量培养液中。浮于少量培养液中。要求要求细胞胞悬液中的液中的细胞分散良好，否胞分散良好，否

57、则影响影响计数准确性。数准确性。取取样计数前，数前，应充分混匀充分混匀细胞胞悬液，尤其是液，尤其是多次取多次取样计数数时更更应该每次取每次取样都要混匀，以都要混匀，以求求计数准确。数准确。细胞计数注意事项细胞计数注意事项数数细胞的原胞的原则是只数完整的是只数完整的细胞，若胞，若细胞聚胞聚集成集成团时只按照一个只按照一个细胞胞计算算。如果如果细胞胞压在格在格线上上时，则只只计上上线，不，不计下下线，只，只计左左线，不，不计右右线。 操作操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁液流入旁边槽中，否槽中，否则要重新要重新计数。数。 台盼蓝染色法台盼蓝染色法在在细胞

58、群体中胞群体中总有一些因各种原因而死亡的有一些因各种原因而死亡的细胞，胞，活活细胞所占胞所占总细胞中的百分比叫做胞中的百分比叫做细胞活力胞活力。由由组织中分离中分离细胞一般也要胞一般也要检查活力，以了解分活力，以了解分离的离的过程程对细胞是否有胞是否有损伤作用作用。复复苏后的后的细胞也要胞也要检查活力，了解活力，了解冻存和复存和复苏的的效果。效果。细胞死亡胞死亡后，后，细胞膜通透性改胞膜通透性改变，台盼，台盼蓝大量大量进入入细胞内而不被排出呈胞内而不被排出呈蓝色。活色。活细胞胞选择性性强，不易着色不易着色台盼蓝染色法台盼蓝染色法0.5ml0.5ml台盼台盼蓝0.3ml0.3ml培养液培养液0.

59、2ml0.2ml细胞胞悬液液 染色染色5 515min15min 至少至少计数数500500个个细胞中着色胞中着色细胞数胞数 细胞活力胞活力= =（总细胞数着色胞数着色细胞胞)/)/总细胞数胞数100100 噻唑噻唑蓝蓝 （MTTMTT）比色法）比色法原理原理：活：活细胞胞线粒体中粒体中琥珀酸脱琥珀酸脱氢酶能将能将MTTMTT黄色溶液黄色溶液还原成不溶于水的原成不溶于水的蓝紫色紫色产物物颗粒（粒（formazan)formazan)，并沉，并沉积在在细胞中。二甲基胞中。二甲基亚砜（DMSODMSO）或酸性异丙醇能溶）或酸性异丙醇能溶解沉解沉积在在细胞中胞中蓝紫色紫色结晶物，溶液晶物，溶液颜色深

60、浅（以色深浅（以ODOD值表示）与所含的表示）与所含的formazanformazan量成正比。可反映活量成正比。可反映活细胞胞的代的代谢水平。而死水平。而死细胞没有胞没有这种种功能功能MTTMTT法法简单快速、准确，广泛快速、准确，广泛应用于新用于新药筛选、细胞毒胞毒性性试验、肿瘤放射敏感性瘤放射敏感性实验等等噻唑噻唑蓝蓝 （MTTMTT）比色法）比色法加入培养液量加入培养液量10的的MTT(5g/L)，继续34h培养培养吸去培养液，加入等量异丙醇或吸去培养液，加入等量异丙醇或DMSO，振，振荡10min 490/630nm 测定定OD值细胞存活率胞存活率实验组OD值/对照照组OD值100细

61、胞生长曲线法细胞生长曲线法观察同一代察同一代细胞的增殖胞的增殖过程，根据程，根据细胞生胞生长曲曲线分析分析细胞的增殖速度，确定具体胞的增殖速度，确定具体实验、细胞胞传代、代、细胞胞冻存的最佳存的最佳时间细胞生长曲线法细胞生长曲线法计数数细胞胞浓度，等量加入培养板各孔，培养度，等量加入培养板各孔，培养7 7天天 以以接种接种时间始，始， 每隔每隔24h24h计数数3 3孔孔细胞数目，胞数目，取均取均值 以横坐以横坐标为培养培养时间，纵坐坐标为细胞胞浓度度（10104 4 /ml) /ml)注：注：1 1、各孔消化、各孔消化时间应一致。一致。 2 2、计数数细胞前胞前应混匀。混匀。 3 3H-TD

62、RH-TDR掺入法和掺入法和BRDUBRDU掺入法掺入法 3 3H-TdRH-TdR掺入法入法是将用是将用 3 3HH标记的胸腺的胸腺嘧啶脱氧脱氧核苷核苷掺入到新合成的入到新合成的DNADNA中，通中，通过测定定 3 3HH放射性放射性脉冲数比脉冲数比较不同不同细胞的增殖活性。胞的增殖活性。溴脱氧尿溴脱氧尿嘧啶核苷核苷(bromodeoxyuridine ,BrdU(bromodeoxyuridine ,BrdU）是是DNADNA前体胸腺前体胸腺嘧啶核苷核苷类似物似物, ,通通过竞争争掺入入S S期期细胞胞单链 DNADNA核苷酸序列替代胸腺核苷酸序列替代胸腺嘧啶。 BrdUBrdU被被掺入到

63、入到DNADNA复制位点，复制位点，这些复制位点可用些复制位点可用荧光光剂或或酶偶偶联的的抗体抗体检测。 七、细胞冻存和复苏七、细胞冻存和复苏细胞低温冷胞低温冷冻贮存是存是细胞室的常胞室的常规工作。工作。细胞胞 冻存与存与细胞胞传代保存相比可以减少入力、代保存相比可以减少入力、经 费，减少，减少污染，减少染，减少细胞生物学胞生物学特性特性变化。化。冻存和复苏的原则：慢冻快融冻存和复苏的原则：慢冻快融当当细胞冷到零度以下，可以胞冷到零度以下，可以产生以下生以下变化：化：细胞胞器器脱水脱水，细胞中可溶性物胞中可溶性物质浓度升高，并在度升高，并在细胞胞内形成冰晶。内形成冰晶。如果如果缓慢冷慢冷冻，可

64、使，可使细胞逐步脱水，胞逐步脱水，细胞内不致胞内不致产生生 大的冰晶；相反，大的冰晶；相反，结晶很大，大晶很大，大结晶会造成晶会造成细胞膜、胞膜、细胞胞 器的器的损伤和破裂。复和破裂。复苏过程程应快融，快融，目的是防止小冰晶形目的是防止小冰晶形 成大冰晶，即冰晶的重成大冰晶，即冰晶的重结晶。晶。低温低温保护剂保护剂在在细胞胞冻存存时加入低温保加入低温保护剂，能大大提高，能大大提高冻存存效果。效果。常用的低温保常用的低温保护剂是是DMSODMSO，它是一种渗透性，它是一种渗透性保保护剂，可迅速，可迅速透入透入细胞，提高胞膜胞，提高胞膜对水的通透性，水的通透性，降低冰点，延降低冰点，延缓 冻结过程

65、，能使程，能使细胞内水分在胞内水分在冻结前透出前透出细胞外，在胞外胞外，在胞外 形成冰晶，减少胞形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶内冰晶，从而减少冰晶对细胞的胞的损伤。细胞冻存方法细胞冻存方法预先先配制配制冻存液：含存液：含 10% DMSO10% DMSO、 20%20%血清培血清培养基养基 取取对数生数生长期期细胞，胞，经胰胰酶消化后，加入适消化后，加入适量量冻存液存液, , 用吸管吹打制成用吸管吹打制成细胞胞悬液（液（1 110106 6 5 5 10106 6细胞胞/ml)/ml)；加入加入1ml1ml细胞于胞于冻存管中，密封后存管中，密封后标记冷冷冻细胞名称和冷胞名称和冷冻日期。日

66、期。一般程序一般程序冷冷冻过程要程要缓慢慢。4 304 3060 60 分分钟-20 30 -20 30 分分钟 -80 16-80 1618 18 小小时（或（或过夜）夜）液氮液氮长期保存期保存冻存存细胞必胞必须处在在对数生数生长期，活力大于期，活力大于9090，无微生物无微生物污染。染。细胞胞浓度控制在：度控制在：1 110107 75 510107 7/ml/ml。冻存存管置于程序降温盒中，超低温冰箱管置于程序降温盒中，超低温冰箱过夜，液夜，液氮罐中氮罐中长期保存。期保存。注意事项注意事项细胞在冷胞在冷冻过程中在程中在-20-20冰箱内放置冰箱内放置时间不可不可超超过1 1 小小时，以防

67、止冰晶，以防止冰晶过大而破坏大而破坏细胞。也可胞。也可跳跳过-20-20这一步一步骤直接放入直接放入-80-80冰箱中，但冰箱中，但这样做做细胞存活率要低一些胞存活率要低一些。DMSO DMSO 稀稀释时会会释放大量放大量热量。因此，量。因此，DMSO DMSO 不能不能直接加到直接加到细胞液中，必胞液中，必须事先配制。事先配制。DMSO DMSO 必必须是是细胞培养胞培养级别的。如要的。如要过滤DMSODMSO，必必须选用耐用耐DMSO DMSO 的尼的尼龙滤膜。膜。细胞的复苏细胞的复苏在在实际操作中，操作中，冻存存细胞要胞要进行复行复苏，再培，再培养养传代。复代。复苏细胞一般采用胞一般采用

68、快速融化法快速融化法。以保。以保证细胞外胞外结晶快速融化，避免慢速融化水分渗晶快速融化，避免慢速融化水分渗入入细胞内，再次形成胞内胞内，再次形成胞内结晶晶损伤细胞。胞。 操作要点操作要点快速解快速解冻 ： 冻存存细胞从液氮中取出后，胞从液氮中取出后，应立即放入立即放入3737水浴中，水浴中，轻轻摇动冷冷冻管，使其在管，使其在1 1 分分钟内全部融化（不要超内全部融化（不要超过3 3 分分钟）。）。操作操作过程程动作要作要轻： 由于冷由于冷冻保存保存过的的细胞胞变得非常脆弱，不得非常脆弱，不仅解解冻速度要快，而且速度要快，而且动作要作要轻。一般情况下，解。一般情况下，解冻后的后的细胞可直接胞可直

69、接接种到含完全生接种到含完全生长培养液的培养液的细胞培养瓶中直接胞培养瓶中直接进行培养（行培养（1ml 1ml 冻存存细胞液加入到胞液加入到252530ml 30ml 新新鲜完全培养液中），完全培养液中），24 24 小小时后再用新后再用新鲜完全培养液替完全培养液替换旧培养液，以去除旧培养液，以去除DMSODMSO如果如果细胞胞对冷冷冻保保护剂特特别敏感，那么，解敏感，那么，解冻后的后的细胞胞应先通先通过离离心去除冷心去除冷冻保保护剂，然后再接种到含完全生，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中。培养液的培养瓶中。 注意事项注意事项解解冻时务必必注意安全注意安全，预防冷防冷冻管爆裂。要管爆裂。要带手套，用手套，用镊子将子将细胞冷胞冷冻管从液氮中取出，管从液氮中取出，放入放入3737水浴中。切不可直接用手，以免水浴中。切不可直接用手，以免冻伤。冷冷冻管在水浴中解管在水浴中解冻时，液面不可超，液面不可超过冻存存管盖面，否管盖面，否则，易，易发生生污染。染。细胞库细胞库American Type Culture Collection(ATCC) http:/www.ACTT.org中国科学院典型培养物保藏委中国科学院典型培养物保藏委员会会细胞胞库 http:/ http:/ http:/