抗菌药物和药敏试验

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1、抗菌药物和药敏试验Stillwatersrundeep.流静水深流静水深,人静心深人静心深Wherethereislife,thereishope。有生命必有希望。有生命必有希望第一节 临床常用抗菌药物抗菌药物抗菌药物 是指具有杀菌或抑菌活性是指具有杀菌或抑菌活性的抗生素和化学合成药物。的抗生素和化学合成药物。 前者前者是真菌、放线菌、细菌等的是真菌、放线菌、细菌等的代谢产物，代谢产物，后者后者是经化学改造的半合是经化学改造的半合成抗生素和化学合成药物。成抗生素和化学合成药物。一、青霉素类抗生素：一、青霉素类抗生素：包括青霉素包括青霉素G G、耐青霉素酶青霉素、耐青霉素酶青霉素、 广谱青霉素广

2、谱青霉素( (氨苄青霉素、氨苄青霉素、美洛西林、哌拉西林 ) )等。等。二、头孢菌素类抗生素：二、头孢菌素类抗生素：第一代第一代( (头孢唑林、头孢氨苄、头头孢唑林、头孢氨苄、头 孢拉定孢拉定 ) )、第二代、第二代( (头孢孟多、头孢西汀，头孢呋新，头孢克头孢孟多、头孢西汀，头孢呋新，头孢克 罗等罗等 ) )、第三代、第三代 ( (头孢哌酮（先锋必）、头孢三嗪（菌必治）、头孢哌酮（先锋必）、头孢三嗪（菌必治）、 头孢噻肟钠、头孢他啶、头孢唑肟等头孢噻肟钠、头孢他啶、头孢唑肟等) ) 。第四代第四代如头孢地嗪、 头孢噻唑肟、头孢吡肟等。适用于多重耐 药G-杆菌严重 感染，对厌氧菌也有很好的抗菌

3、作用 三、其他三、其他内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素 （一）单环（一）单环内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素: : 主要有氨曲主要有氨曲 南和卡芦莫南。南和卡芦莫南。 抗菌药物的分类（二）头霉素类和氧头孢烯类抗生素（二）头霉素类和氧头孢烯类抗生素: : 主要主要 有头孢西丁、头孢替坦、头孢美唑。有头孢西丁、头孢替坦、头孢美唑。（三）碳青霉烯类抗生素（三）碳青霉烯类抗生素: : 主要有亚胺培南、主要有亚胺培南、 米洛培南、必安培南、帕尼培南。米洛培南、必安培南、帕尼培南。（四）（四）内酰胺类抑制剂内酰胺类抑制剂: : 主要有克拉维酸主要有克拉维酸 舒巴坦和他唑巴坦。舒巴坦和他唑巴坦。所有所有内酰胺类抗生

4、素内酰胺类抗生素都能抑制细胞壁粘肽合成都能抑制细胞壁粘肽合成酶，即青霉素结合蛋白酶，即青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins ，PBPs），），从而阻碍细胞壁粘肽合成，使细菌胞壁从而阻碍细胞壁粘肽合成，使细菌胞壁缺损缺损四、氨基糖苷类抗生素四、氨基糖苷类抗生素 可干扰细菌可干扰细菌蛋白质蛋白质合成合成,主用于对主用于对革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌、绿脓杆菌绿脓杆菌等感染等感染 的治疗的治疗 按其来源分为按其来源分为： 由由链霉菌属链霉菌属发酵滤液提取获得，有链霉素、卡那发酵滤液提取获得，有链霉素、卡那 霉素、妥布霉素、核糖霉素、巴龙霉素、新霉霉素、妥布霉素、核糖霉素

5、、巴龙霉素、新霉 素；素； 由由小单胞菌属小单胞菌属发酵滤液中提取，有庆大霉素、福发酵滤液中提取，有庆大霉素、福 提霉素；提霉素； 半合成半合成氨基糖苷类，有阿米卡星、奈替米星、地氨基糖苷类，有阿米卡星、奈替米星、地 贝卡星等。贝卡星等。 五、喹诺酮类抗生素五、喹诺酮类抗生素 是一种是一种DNA旋转酶抑制剂，它作用于细菌旋转酶抑制剂，它作用于细菌DNA旋转旋转酶，干扰酶，干扰DNA超螺旋结构的解旋，从而阻碍超螺旋结构的解旋，从而阻碍DNA的复的复制。制。 第一代第一代 为窄谱抗生素，有新恶酸、奈啶酸和恶为窄谱抗生素，有新恶酸、奈啶酸和恶 喹酸。喹酸。第二代第二代 为广谱类抗生素，抗菌强度依次为

6、环丙为广谱类抗生素，抗菌强度依次为环丙 沙星、氧氟沙星、洛美沙星、氟咯沙星、沙星、氧氟沙星、洛美沙星、氟咯沙星、 培氟沙星、诺氟沙星。培氟沙星、诺氟沙星。第三代第三代 为超广谱类抗生素，有司帕沙星、妥舒为超广谱类抗生素，有司帕沙星、妥舒 沙星、左氟沙星等。沙星、左氟沙星等。 六、大环内酯类抗生素六、大环内酯类抗生素: : 作用于核糖体作用于核糖体50S亚基，抑制肽酰基转移酶，亚基，抑制肽酰基转移酶，阻止转肽作用和阻止转肽作用和mRNA位移，抑制细菌蛋白质的位移，抑制细菌蛋白质的合成。合成。 常用的有：红霉素、柱晶白霉素、麦迪霉素、常用的有：红霉素、柱晶白霉素、麦迪霉素、乙酰螺旋霉素。乙酰螺旋霉

7、素。 七、四环素、氯霉素和林可酰胺类抗生素七、四环素、氯霉素和林可酰胺类抗生素 （一）四环素为广谱抗生素，（一）四环素为广谱抗生素，能特异性地与细菌能特异性地与细菌核糖体核糖体30S亚基的亚基的A位置结合。位置结合。抗菌活性的顺序抗菌活性的顺序 为米诺环素多西环素美他环素地美环素。为米诺环素多西环素美他环素地美环素。（二）氯霉素类抗生素，包括氯霉素、（二）氯霉素类抗生素，包括氯霉素、 甲砜霉素。甲砜霉素。（三）林可酰胺类抗生素，主要有盐酸（三）林可酰胺类抗生素，主要有盐酸 林可霉素、克林霉素。林可霉素、克林霉素。八、糖肽类抗生素八、糖肽类抗生素 常用的有万古霉素常用的有万古霉素 和替卡拉宁和替

8、卡拉宁 九、磺胺类药物及增效剂九、磺胺类药物及增效剂分三类：分三类： 用于全身感染的药物，分为短效、用于全身感染的药物，分为短效、 中效、长效三类，有磺胺甲恶唑，中效、长效三类，有磺胺甲恶唑， 磺胺嘧啶、磺胺甲氧吡嗪；磺胺嘧啶、磺胺甲氧吡嗪； 肠道起作用的药物有柳氮磺胺啶银、肠道起作用的药物有柳氮磺胺啶银、 磺胺二甲氧嘧啶；磺胺二甲氧嘧啶； 局部应用的药物有磺胺米隆、磺胺局部应用的药物有磺胺米隆、磺胺 醋酰钠。醋酰钠。十、其他合成抗菌药十、其他合成抗菌药 1.1.硝基呋喃类硝基呋喃类 用于肠道、尿路感染和用于肠道、尿路感染和 外用消毒外用消毒 ，有呋喃坦啶和呋喃唑酮。，有呋喃坦啶和呋喃唑酮。

9、2. 2.硝基咪唑类硝基咪唑类 对厌氧菌有抗菌作用，对对厌氧菌有抗菌作用，对 需氧菌无效，有甲硝唑和替硝唑。需氧菌无效，有甲硝唑和替硝唑。 第二节第二节 抗菌药物敏感性试验抗菌药物敏感性试验 （ASTAST）一、意义一、意义可预测抗菌治疗的效果，可预测抗菌治疗的效果， “ “敏感敏感”治疗可能有治疗可能有效；效； “ “耐药耐药” ” 肯定失败；肯定失败；指导医生选择使用抗生素，指导医生选择使用抗生素，ASTAST的结果为的结果为“耐药耐药”，即应更换药物；，即应更换药物；提供所选择药物的依据；提供所选择药物的依据；监测耐药性，分析耐药菌变迁，掌握耐药菌感染监测耐药性，分析耐药菌变迁，掌握耐药

10、菌感染 病流行病学，控制和预防耐药菌感染发生和流行。病流行病学，控制和预防耐药菌感染发生和流行。二、试验常规二、试验常规抗菌药物选择抗菌药物选择 在临床上将试验药物分成在临床上将试验药物分成A A、B B、C C、U U四组四组, , A A组组 所列的抗生素所列的抗生素为常规首选药敏试验药物为常规首选药敏试验药物, ,B B组组 为临床使用主要抗生素为临床使用主要抗生素, ,尤其在医院感染时尤其在医院感染时使用的抗生素，可在下列情况下使用：使用的抗生素，可在下列情况下使用：对对A A组组同类抗生素耐药；同类抗生素耐药；标本来源不同时，如三代头标本来源不同时，如三代头孢菌素使用于脑脊液中的肠杆

11、菌，磺胺甲恶唑使孢菌素使用于脑脊液中的肠杆菌，磺胺甲恶唑使用于尿道分离的细菌；用于尿道分离的细菌；多种微生物感染；多种微生物感染；多多部位感染；部位感染；感染流行的控制；感染流行的控制；对对A A组抗生素组抗生素过敏、耐受或无反应。过敏、耐受或无反应。C C组组 药物药物用于对用于对A A组药物耐药的流行菌株或组药物耐药的流行菌株或 对对A A组药物过敏的病人和某些不常见的组药物过敏的病人和某些不常见的 细菌细菌（如肠外分离的沙门菌属或耐万（如肠外分离的沙门菌属或耐万 古霉素肠球菌）。古霉素肠球菌）。U U组组 仅用于尿道中分离的细菌仅用于尿道中分离的细菌，不作为尿，不作为尿 道外分离菌的常规

12、药敏试验。道外分离菌的常规药敏试验。 建议非苛氧菌常规药敏试验和报告应考虑的抗菌药物分组细菌A组B组C组U组肠杆菌科氨苄西林头孢唑啉头孢噻吩庆大霉素阿莫西林/克拉维酸或氨苄西林头孢孟多或头孢呋辛头孢吡污头孢美唑头孢哌酮头孢西丁头孢噻污环丙沙星或左氟沙星亚胺培南甲氧苄定氨曲南头孢他啶(可指示产ESBLs)氯霉素卡那霉素奈替米星四环素妥布霉素羧苄西林洛美沙星或氧氟沙星加替沙星氯碳头孢磺胺异恶唑甲氧苄啶呋喃妥因 建议非苛氧菌常规药敏试验 和报告应考虑的抗菌药物分组细菌A组B组C组U组 葡 萄 球 菌 属 细 菌苯唑西林青霉素阿奇霉素或克拉霉素或红霉素克林霉素万古霉素泰利霉素利奈唑胺环丙沙星或左氟沙星

13、或氧氟沙星氯霉素庆大霉素利福平四环素罗美沙星或诺氟沙星磺胺异恶唑甲氧苄啶呋喃妥因( (一）非苛养菌药敏试验抗生素的选用一）非苛养菌药敏试验抗生素的选用 A A组组一级试验并常规报告的抗微生物药一级试验并常规报告的抗微生物药 , , 如葡萄球菌属用苯唑西林和青霉素。如葡萄球菌属用苯唑西林和青霉素。B B组组一级试验有选择报告的抗微生物药一级试验有选择报告的抗微生物药 , , 如肠球菌属用万古霉素如肠球菌属用万古霉素 。C C组组补充试验有选择报告的抗微生物药，补充试验有选择报告的抗微生物药， 如葡萄球菌属用氯霉素如葡萄球菌属用氯霉素 。U U组组仅用于泌尿道的补充实验的抗微生物仅用于泌尿道的补充

14、实验的抗微生物药，如葡萄球菌属用洛美沙星和诺氟沙星。药，如葡萄球菌属用洛美沙星和诺氟沙星。( (二）苛养菌药敏试验抗生素的选用二）苛养菌药敏试验抗生素的选用A A组一级试验并常规报告的抗微生物药组一级试验并常规报告的抗微生物药, , 如如肺炎链球菌肺炎链球菌用用红霉素红霉素和青霉素。和青霉素。B B组一级试验有选择报告的抗微生物药组一级试验有选择报告的抗微生物药, , 如如肺炎链球菌肺炎链球菌用用头头孢噻肟孢噻肟或头或头孢孢曲曲 松松。C C组补充试验有选择报告的抗微生物药，组补充试验有选择报告的抗微生物药， 如如肺炎链球菌肺炎链球菌用用头头孢呋孢呋辛辛。 稀释法和纸片扩散法 稀释法是在体外定

15、量检测抗菌药物抑制待测菌生长活性的方法,抗菌药物在液体或固体培养基中稀释. （一）液体稀释法 原理: 以MH（水解 蛋白）液体培养基将抗菌药物做不同浓度的稀释，然后接种待测菌，定量测定抗菌药物抑制或杀死该菌的最低（或最小）抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）。 三、三、药敏试验方法材料： 抗菌药物(配制见表) 培养基：一般采用MH液体培养基。 接种菌液的准备：挑取纯培养（平板）的4-5个菌落，种于3-5ml MH液体培养基中，35培养4-6小时；校正菌液浓度，使其相当于0.5个麦氏单位的浊度（1.28x108 cfu/ml ）标准，再用MH液体培

16、养基进行1：200的稀释后，在15 min内用完。 无菌小试管：10-15支 无菌吸管： 35培养箱操作步骤：1.取10支小试管，除第一支外，其余每管加于MH培养基1ml.2.吸取抗菌药物原液（ 1000 g/ml）5.12ml,加入液体培养基4.88ml，混合，吸出2ml加入第一和第二管中，每管加1ml，第二管混合后取出1ml加入第三管，依次类推直至9管，吸取1ml去掉，各管抗菌药物的实际含量依次分别为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1 g/ml ；另设培养液对照、待测菌生长对照、和质控菌生长对照。3.3. 将一定浓度的待测菌悬液依次加入上述各管中，每管0.05ml，混

17、匀。放入35培养箱12-18小时后观察结果。4.4. 结果判断：凡无肉眼可见细菌生长的药物最低浓度即为该待测菌的最低抑菌浓度（MIC）;5. 再以0.01ml容量接种环无菌管中取出一环种于血平板作次代培养，经35培养过夜后，观察最低药物浓度能杀死99.9%原始种于的细菌者，即为该菌的最低杀菌浓度（MBC）。影响因素 1.培养基 pH、渗透压、电解质对结果均有影响。在MH培养基上不生长的细菌除外，一般都用该培养基。 2.抗菌药物 必须采用标准粉剂。 3.结果观察时间，应在12-18小时之间观察。质量控制： 每次试验时应根据待测菌的不同而分别选用：金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠艾希菌ATC

18、C25922、粪肠球菌ATCC29212和铜绿假单胞菌ATCC27853等标准菌株在同一实验条件下作平行试验。其结果（MIC）超过或低于预期值范围一个稀释度以上，不应向临床发出报告。 （二）琼脂稀释法（二）琼脂稀释法 原原 理理 琼脂选择法是琼脂选择法是将药物混匀于琼脂培养将药物混匀于琼脂培养基中基中，配制含不同浓度药物平板，使用多头接，配制含不同浓度药物平板，使用多头接种器接种细菌，经孵育后观察细菌生长情况，种器接种细菌，经孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含药物浓度以抑制细菌生长的琼脂平板所含药物浓度测得测得 MICMIC。 结果判断结果判断 将平板置于暗色、无反光表面上判

19、将平板置于暗色、无反光表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的药物稀释度为断试验终点，以抑制细菌生长的药物稀释度为终点浓度（磺胺可见少许散在细菌生长）。终点浓度（磺胺可见少许散在细菌生长）。 结果报告结果报告 可用可用 MIC MIC（g/mlg/ml）或用敏感）或用敏感S S）、）、（中介（中介（I I）和耐药（）和耐药（R R）报告。）报告。纸片琼脂扩散法纸片琼脂扩散法 （一）试验原理（一）试验原理 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围物吸收琼脂中水分溶解后不

20、断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内细菌的生长被抑制，从而形菌浓度范围内细菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的的敏感程度，并与该药对测试菌的MICMIC呈呈负相关。负相关。 ( (二二) )材料材料1 1抗菌药物纸片抗菌药物纸片 选择直径为选择直径为6 635mm35mm， 吸水量为吸水量为20l20l的专用药敏纸片用逐的专用药敏纸片用逐 片加样或浸泡方法使每片含药量达规片加样或浸泡方法使每片含

21、药量达规 定所示。含药纸片密封贮存定所示。含药纸片密封贮存2288 且不超过且不超过1 1周。周。2 2培养基培养基 水解酪蛋白（水解酪蛋白（MHMH）培养基是）培养基是 兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培 养基，养基，44保存。保存。（三）方法：三）方法： 1. 1.用用0 05 5麦氏比浊标准的菌液浓度，麦氏比浊标准的菌液浓度，在琼在琼 脂表面均匀涂片脂表面均匀涂片, ,在在15min15min内接种完内接种完毕。毕。 2. 2.将含药纸片紧贴于琼脂表面将含药纸片紧贴于琼脂表面, 35, 35孵育孵育18h18h后阅读结果。后阅读结果。（四）结果判断和报告（四

22、）结果判断和报告 用精确度为用精确度为1mm1mm的游标卡尺量取抑菌圈的游标卡尺量取抑菌圈直径。根据直径。根据NCCLSNCCLS标准，标准， 作出作出“敏感敏感”,“”,“耐药耐药”和和“中介中介”的的判断。判断。纸片法药敏试验抑菌圈直径与结果解释的标准抗菌药物与细菌 纸片含量 抑菌圈直径：mm 相应MIC g/ml 耐药 中介度 敏感 耐药 敏感丁胺卡那霉素 30g 14 15-16 17 32 16 氨苄青霉素 测肠杆菌 10g 11 12-13 14 32 8 测葡萄球菌 10g 28 29 测嗜血杆菌 10g 19 20 4 0.25 测肠球菌 10g 16 16 2 E E 试试

23、验验 （一）原理（一）原理 E E试条是一条试条是一条 5mm50mm 5mm50mm的无孔试剂载的无孔试剂载体，一面固定有预先制备的，浓度呈连续体，一面固定有预先制备的，浓度呈连续指数增长稀释抗生素，另一面有读数和判指数增长稀释抗生素，另一面有读数和判别的刻度。将别的刻度。将E E试条放在细菌接种过的琼脂试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗生素抑制细菌的特定浓度度浓度即为抗生素抑制细菌的特定浓度, ,又又称抑制浓度（称抑制浓度（ICIC），它与），它

24、与MICMIC呈高度相关。呈高度相关。 （二）细菌接种和加样（二）细菌接种和加样 使用厚度为使用厚度为4mmMH4mmMH琼脂平板，用琼脂平板，用0.50.5麦氏麦氏浓度的对数期菌液涂布，待琼脂平板完全浓度的对数期菌液涂布，待琼脂平板完全干燥，用干燥，用E E试验加样器将试条放在已接种细试验加样器将试条放在已接种细菌的平板表面，试条全长应与琼脂平板紧菌的平板表面，试条全长应与琼脂平板紧 密接触，试条密接触，试条MICMIC刻度面朝上浓度最大处靠刻度面朝上浓度最大处靠平板边缘。平板边缘。 （三）结果判断和报告（三）结果判断和报告 读取椭圆环与读取椭圆环与E E试验试条的交界点试验试条的交界点IC

25、IC值。值。 与与NCCLSNCCLS的稀释法的稀释法MICMIC参考值高度相关。参考值高度相关。四、药物敏感试验结果解释四、药物敏感试验结果解释 “敏感敏感”即表示测试菌可被测定药物即表示测试菌可被测定药物常规剂常规剂量量 给药给药后后在体内达到的血药浓度在体内达到的血药浓度所抑制所抑制“耐药耐药”即表示测试菌即表示测试菌不能被在体内感染部不能被在体内感染部位位 可能达到的抗菌药物浓度所抑制可能达到的抗菌药物浓度所抑制，临，临 床治疗无效。床治疗无效。“中介中介”者提示该细菌者提示该细菌对常规用药体液或组对常规用药体液或组织织 中的药物浓度的反应率低于敏感株中的药物浓度的反应率低于敏感株，

26、使用高于正常给药量有疗效使用高于正常给药量有疗效。 五、自动化仪器检测五、自动化仪器检测 Viter ViterATBATB系统和系统和MicroscanMicroscan是半是半自动或全自动细菌鉴定和药敏系统，自动或全自动细菌鉴定和药敏系统，通过系统中药敏专家系统可报告分离通过系统中药敏专家系统可报告分离菌的药敏结果。菌的药敏结果。 第三节 细菌耐药性和产生机制一、细菌的耐药性一、细菌的耐药性 对某种抗菌药物敏感细菌变成对该药物对某种抗菌药物敏感细菌变成对该药物耐受称细菌耐药性。耐受称细菌耐药性。 它可分为它可分为天然耐药天然耐药和和获得性耐药获得性耐药，前者，前者是通过染色体是通过染色体D

27、NADNA突变而致，后者往往是由突变而致，后者往往是由质粒、噬菌体及其他遗传物质携带外来质粒、噬菌体及其他遗传物质携带外来DNADNA片段导致产生的耐药性。片段导致产生的耐药性。 突变可由细菌自发产生或在突变可由细菌自发产生或在X X线等物理因线等物理因素或化学物质诱导产生，一般只对一种或两素或化学物质诱导产生，一般只对一种或两种相似药物耐药，在细菌耐药性上不占主要种相似药物耐药，在细菌耐药性上不占主要地位。地位。 获得性耐药获得性耐药可通过接合、转化。转导、可通过接合、转化。转导、转换形式产生耐药转换形式产生耐药 。二、细菌耐药性的生物化学机制二、细菌耐药性的生物化学机制 1. 1. 产生产

28、生内酰胺酶内酰胺酶，水解药物，水解药物内酰内酰 胺环而失去抗菌活性。胺环而失去抗菌活性。2. 2. 产生产生钝化酶钝化酶使抗生素失活，钝化酶有三类：使抗生素失活，钝化酶有三类： 氨基糖苷类钝化酶氨基糖苷类钝化酶 ； 氯霉素乙酸转移酶；氯霉素乙酸转移酶； 红霉素酶和其他灭活酶。红霉素酶和其他灭活酶。3.3.青霉素结合蛋白青霉素结合蛋白改变，导致对抗生素的改变，导致对抗生素的 亲和力下降亲和力下降 。4.4.药物作用靶位的改变药物作用靶位的改变使抗生素不易结使抗生素不易结 合产生耐药性。合产生耐药性。5.5.抗菌药物渗透障碍抗菌药物渗透障碍，如外膜蛋白减少，如外膜蛋白减少 和药物外排作用等。和药物

29、外排作用等。6.6.代谢途径的改变代谢途径的改变 。 第四节 细菌耐药性检测 一、一、特殊菌特殊菌耐药性表型检测耐药性表型检测（一）（一）耐药筛选试验：耐药筛选试验：琼脂筛选试验琼脂筛选试验 以单一药物单一浓度检测某种细菌的耐药性。以单一药物单一浓度检测某种细菌的耐药性。 在含一定浓度测试药物的特殊培养上，点种在含一定浓度测试药物的特殊培养上，点种0.50.5麦麦氏比浊度直接菌落配制细菌悬液，氏比浊度直接菌落配制细菌悬液，3535孵育孵育24h24h后后观察平板上是否有菌落生长识要有观察平板上是否有菌落生长识要有1 1个菌落生长，个菌落生长，均视为耐药。均视为耐药。 临床上常用于对临床上常用于

30、对耐甲氧西林葡萄球菌耐甲氧西林葡萄球菌、耐耐 万古霉素肠球菌，对庆大霉素或链霉素高水平万古霉素肠球菌，对庆大霉素或链霉素高水平 耐药的肠球菌的检测耐药的肠球菌的检测。（二）折点敏感试验（二）折点敏感试验仅用特定抗生素浓度（敏感、中介或耐药仅用特定抗生素浓度（敏感、中介或耐药折点折点MICMIC）而不使用测定）而不使用测定MICMIC时所用系列对时所用系列对倍抗生素浓度测试细菌对药物的敏感性称倍抗生素浓度测试细菌对药物的敏感性称折点敏感试验。当选择区分中介和耐药折折点敏感试验。当选择区分中介和耐药折点值药物浓度时，若两种抗药物浓度培养点值药物浓度时，若两种抗药物浓度培养基均生长可判断为耐药；如在

31、两种药物浓基均生长可判断为耐药；如在两种药物浓度均不生长则为敏感；仅在较低药物浓度度均不生长则为敏感；仅在较低药物浓度培养基中生长提示为中介。培养基中生长提示为中介。（三）双相纸片试验（三）双相纸片试验 挑取血平板上菌落，稀释成挑取血平板上菌落，稀释成0.50.5麦氏浓麦氏浓度菌液。均匀涂布于度菌液。均匀涂布于MHMH平板。中央贴上阿莫平板。中央贴上阿莫西林西林/ /克拉维酸纸片，在距该纸片克拉维酸纸片，在距该纸片25mm25mm处分处分别贴头孢噻肟或头孢曲松、头孢他啶和氨曲别贴头孢噻肟或头孢曲松、头孢他啶和氨曲南等药敏纸片作为指示剂，南等药敏纸片作为指示剂，3535孵育孵育18h18h观察观

32、察结果。结果。 若指示剂在朝向阿莫西林若指示剂在朝向阿莫西林/ /克拉维酸方向克拉维酸方向有抑菌圈扩大的现象（协同现象），则说明有抑菌圈扩大的现象（协同现象），则说明待检菌产生超广谱待检菌产生超广谱内酰胺酶。内酰胺酶。（四）自动化仪器（四）自动化仪器 自动化仪器自动化仪器MicroscanMicroscan有测定抗菌药物抑有测定抗菌药物抑菌的菌的MICMIC值功能。值功能。 原理原理是先测定细菌对抗生素的是先测定细菌对抗生素的MICMIC值，值，当头孢他啶与头孢他啶十克拉维酸的当头孢他啶与头孢他啶十克拉维酸的MICMIC比比值或头孢噻肟与头孢噻肟十克拉维酸的值或头孢噻肟与头孢噻肟十克拉维酸的M

33、ICMIC比值大于或等于比值大于或等于8 8（即（即3 3个对倍稀释度）即判个对倍稀释度）即判定为此细菌产生定为此细菌产生ESBLESBL。二、二、 内酰胺酶内酰胺酶检测检测 1. 1.头孢哨噻吩滤纸片法头孢哨噻吩滤纸片法 用接种环挑取受试菌于商品化头孢哨噻用接种环挑取受试菌于商品化头孢哨噻 吩滤纸片上，于吩滤纸片上，于1010分钟内由黄色转变为分钟内由黄色转变为 红色即阳性结果，示产色头孢菌素的红色即阳性结果，示产色头孢菌素的 内酰胺环被酶打开。内酰胺环被酶打开。 2 .2 .碘淀粉测定法碘淀粉测定法 用接种环挑取受试菌混于青霉素溶液中，用接种环挑取受试菌混于青霉素溶液中， 室温下振摇室温下

34、振摇3030分钟。加入淀粉液后，再加分钟。加入淀粉液后，再加 入碘液，溶液变蓝，继续振摇。若检测菌入碘液，溶液变蓝，继续振摇。若检测菌 产生酶，则可水解青霉素产生酶，则可水解青霉素内酰胺环变内酰胺环变 为青霉素噻唑酸，后者与碘结合，使碘淀为青霉素噻唑酸，后者与碘结合，使碘淀 粉复合物转变为无色，粉复合物转变为无色，1010分钟之内蓝色消分钟之内蓝色消 失者为产酶株。失者为产酶株。四、特殊耐药菌检测四、特殊耐药菌检测 （一）耐甲氧西林葡萄球菌检测（一）耐甲氧西林葡萄球菌检测1 1定义定义 对对1g1g苯唑西林纸片的抑菌圈直径苯唑西林纸片的抑菌圈直径 10mm10mm，或其，或其MICMIC4g4

35、gmlml的的金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌； 对对1g1g苯唑西林抑菌圈直径苯唑西林抑菌圈直径17mm17mm，或，或MIC MIC 0 05g5gmlml的的凝固酶阴性葡萄球菌凝固酶阴性葡萄球菌； 都称耐甲西林葡萄球菌（都称耐甲西林葡萄球菌（MRSMRS）。）。2 2临床意义临床意义 MRS MRS不论其体外药敏试验结果，所有不论其体外药敏试验结果，所有的的内酰胺类药物内酰胺类药物和和内酰胺内酰胺内酰胺酶抑制剂内酰胺酶抑制剂均无临床疗效均无临床疗效； 绝大多数的绝大多数的MRSMRS常示多重耐药常示多重耐药，包括，包括氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类。氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类。 （二

36、）耐青霉素肺炎链球菌检测（二）耐青霉素肺炎链球菌检测1.1.定义定义 当对当对1 g1 gmlml苯唑西林纸片抑菌苯唑西林纸片抑菌 圈圈20mm20mm或或MICMIC0 006 g06 gmlml互应视互应视 为耐青霉素肺炎链球菌（为耐青霉素肺炎链球菌（PRSPPRSP）。）。2.2.临床意义临床意义PRSPPRSP对氨苄西林、氨苄西林对氨苄西林、氨苄西林 舒巴坦、头孢克肟、头孢唑肟，临床治舒巴坦、头孢克肟、头孢唑肟，临床治 疗的疗效很低。但应检测对头孢曲松、疗的疗效很低。但应检测对头孢曲松、 头孢噻肟和美咯培南的头孢噻肟和美咯培南的MICMIC以判断是否对以判断是否对 这些抗生素敏感。这些

37、抗生素敏感。 （三）耐万古霉素肠球菌检测（三）耐万古霉素肠球菌检测1 1定义定义 对对 30g 30g万古霉素纸片抑菌圈直万古霉素纸片抑菌圈直 径径 14mm 14mm或其或其 MIC MIC32g32gmlml应视应视 为耐万古霉素肠球菌（为耐万古霉素肠球菌（VREVRE）。）。2 2临床意义临床意义 对青霉素敏感的对青霉素敏感的VREVRE可用青霉可用青霉 素和庆大霉素联合治疗，若对青霉素耐素和庆大霉素联合治疗，若对青霉素耐 药而不是高水平耐氨基糖苷类可用壁霉药而不是高水平耐氨基糖苷类可用壁霉 素庆大霉素。素庆大霉素。 （四四）超广谱超广谱内酰胺酶内酰胺酶肠杆菌科细菌检测肠杆菌科细菌检测

38、1 1定义定义 超广谱超广谱-内酰胺酶内酰胺酶就就是能水解青霉素是能水解青霉素、头孢菌素头孢菌素及及单胺类的酶单胺类的酶，主要由，主要由克雷伯菌克雷伯菌和和大肠埃大肠埃希菌希菌、肠杆菌肠杆菌等细菌产生。等细菌产生。 初筛试验初筛试验 使用使用1 1种以上药物，其抑菌环直径满足以下条件：种以上药物，其抑菌环直径满足以下条件： 对对 头孢泊肟、头孢他啶（头孢泊肟、头孢他啶（10ug10ug片）抑菌圈片）抑菌圈 22mm 22mm 或或 氨曲南、头孢噻肟（氨曲南、头孢噻肟（30 ug30 ug片）片） 27mm 27mm 为初筛试验阳性即为产为初筛试验阳性即为产ESBLESBL菌株。菌株。 确证试验

39、确证试验 经经头孢他啶（头孢他啶（30ug30ug片）、头孢他啶克拉维酸（片）、头孢他啶克拉维酸（303010ug10ug）；）； 头孢噻肟头孢噻肟30ug30ug、头孢噻肟克拉维酸（、头孢噻肟克拉维酸（303010ug10ug） 两组中任何一组药物加克拉维酸与不加克拉维酸相比，两组中任何一组药物加克拉维酸与不加克拉维酸相比，其抑菌环增大其抑菌环增大5mm5mm者，判断为产者，判断为产ESBLESBL菌株。菌株。2.试验方法 同K-B法单纸片扩散法（初筛试验）将0.5麦氏单位的待检菌液涂抹于MH琼脂平板上，稍干后，在琼脂培养基上贴头孢他啶(Ceftazidime,CAZ)、头孢噻肟(Cefot

40、axime,CTX)、头孢曲松(Ceftriaxone,CRO)、氨曲南(Aztreonam,ATM)、头孢泊肟(Cefprozil,CPD)纸片，置35过夜培养，若抑菌环直径CAZ22mm、CTX27mm、CRO25mm、ATM27mm、CPD22mm时可疑为产ESBLs菌株。 双纸片增效法（确认试验）将0.5麦氏单位的待检菌液涂抹于MH琼脂平板上，稍干后，在琼脂培养基上分别贴头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟/克拉维酸、头孢曲松/克拉维酸、氨曲南/克拉维酸、头孢泊肟/克拉维酸纸片，置35过夜培养后量取抑菌环直径，与单纸片平皿对照，若加克拉维酸纸片较未加克拉维酸纸片抑菌环直径5mm，即为ESBL阳

41、性。 3 3临床意义临床意义 产产ESBLESBL克雷伯菌和大肠埃希克雷伯菌和大肠埃希 菌不论其体外药物敏感试验结果如何，菌不论其体外药物敏感试验结果如何， 对青霉素、头孢菌素和氨曲南治疗无对青霉素、头孢菌素和氨曲南治疗无 效。效。 第五节 抗分枝杆菌药物敏感性试验 一、抗分枝杆菌药物一、抗分枝杆菌药物 第一线药物为异烟肼、利福平、吡酸胺、第一线药物为异烟肼、利福平、吡酸胺、 乙胺丁醇和链霉素；乙胺丁醇和链霉素； 第二线药物包括对氨基水杨酸、乙硫异第二线药物包括对氨基水杨酸、乙硫异 烟胺、环丝氨酸、卷曲霉素、卡那烟胺、环丝氨酸、卷曲霉素、卡那 霉素、丁胺卡那霉素和利福布丁。霉素、丁胺卡那霉素和

42、利福布丁。 二、结核分枝杆菌和缓慢生长分枝二、结核分枝杆菌和缓慢生长分枝杆菌体外抑菌试验杆菌体外抑菌试验 （一）结核分枝杆菌体外药敏试验指征（一）结核分枝杆菌体外药敏试验指征 首次分离的分枝杆菌需做药敏试验，有助于首次分离的分枝杆菌需做药敏试验，有助于合理用药和监测药物敏感性。合理用药和监测药物敏感性。 另外经过三个月正规治疗，标本分离培养仍另外经过三个月正规治疗，标本分离培养仍为阳性患者，或感染的严重疾患（如播散性结核为阳性患者，或感染的严重疾患（如播散性结核病和结核性脑膜炎）以及来自高耐药流行区的患病和结核性脑膜炎）以及来自高耐药流行区的患者，均须做体外药敏试验。者，均须做体外药敏试验。1

43、 1培养基培养基 Middlebrook7H10 Middlebrook7H10琼脂添加油琼脂添加油 酸、白蛋白、葡聚精触酶是慢生菌比例酸、白蛋白、葡聚精触酶是慢生菌比例 法的推荐培养基；法的推荐培养基；2 2药敏试验药物药敏试验药物 抗菌药物直接来自厂商，抗菌药物直接来自厂商， 不能用治疗的抗结核药物作为试验用不能用治疗的抗结核药物作为试验用 药。药物原液浓度至少为药。药物原液浓度至少为1000g/ml1000g/ml， 2020贮存期贮存期6 6个月。个月。3 3细菌接种细菌接种直接直接比例比例法药敏试验采用涂片阳性患者法药敏试验采用涂片阳性患者标本；接种物是充分消化、无杂菌污染标本；接种

44、物是充分消化、无杂菌污染的标本的标本, ,接种菌液的稀释方法如下：接种菌液的稀释方法如下：抗酸染色（抗酸染色（1000 1000 ）未见细菌，荧光染）未见细菌，荧光染色（色（450450）2525，菌液不稀释。抗酸染，菌液不稀释。抗酸染色（色（10001000）l l1010，荧光染色（，荧光染色（450450）2525250250，菌液稀释或，菌液稀释或 10 101 1，10102 2。观察含药琼脂格细菌生长情况用以观察含药琼脂格细菌生长情况用以4 4 表示：（：表示：（：5050100100个菌落；个菌落；2 2：100100200200个菌落；个菌落；3 3：200200500500个

45、菌落；个菌落；4 4 ：500500个以上菌落）。若测试菌生长个以上菌落）。若测试菌生长数大于对照格菌落数数大于对照格菌落数1 1，即判读为耐药菌。，即判读为耐药菌。 6 6质量控制质量控制结核分枝杆菌结核分枝杆菌 H37RV ATCC 27294 H37RV ATCC 27294为一线、为一线、二线药的敏感质控菌株；二线药的敏感质控菌株；H37RV ATCC35820H37RV ATCC35820为链霉素耐药质控菌株；为链霉素耐药质控菌株；H37RV ATCC35822H37RV ATCC35822为异烟耐药质控菌株；为异烟耐药质控菌株；H37RV ATCC35826H37RV ATCC35

46、826为环丝氨酸耐药质控菌株；为环丝氨酸耐药质控菌株；H37RV ATCC35827H37RV ATCC35827为卡那霉素耐药质控菌株；为卡那霉素耐药质控菌株；三、快速生长分枝杆菌体外药敏试验三、快速生长分枝杆菌体外药敏试验 快速生长分枝杆菌是在合适的固体培养快速生长分枝杆菌是在合适的固体培养基上孵育基上孵育5 57 7天内能肉眼可见细菌菌落生长。天内能肉眼可见细菌菌落生长。人类感染密切相关的有人类感染密切相关的有3 3种：偶发分枝杆菌、种：偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌、龟分枝亚种和脓肿亚种。龟分枝杆菌、龟分枝亚种和脓肿亚种。 药物敏感试验药物敏感试验操作方法基本同需氧和兼操作方法基本同需氧和兼

47、性厌氧菌。性厌氧菌。第六节 厌氧菌体外抑菌试验由于厌氧菌感染系内源性感染，厌氧由于厌氧菌感染系内源性感染，厌氧菌药物敏感性稳定，一般不做体外药菌药物敏感性稳定，一般不做体外药敏试验。敏试验。下述情况应考虑药敏试验：下述情况应考虑药敏试验：明确厌明确厌氧菌引起的严重感染；氧菌引起的严重感染；已确证的厌已确证的厌氧菌感染，经验性的选药治疗未能奏氧菌感染，经验性的选药治疗未能奏效；效；需长期用药的厌氧菌感染。需长期用药的厌氧菌感染。厌氧菌体外药敏试验的基本原理和方厌氧菌体外药敏试验的基本原理和方法与需氧菌相同，只是在培养基、操法与需氧菌相同，只是在培养基、操作环境和培养条件等应根据厌氧菌的作环境和培

48、养条件等应根据厌氧菌的特定需要变动。培养基为布氏血琼脂特定需要变动。培养基为布氏血琼脂再加人补充剂再加人补充剂 5g/ml 5g/ml氯化血红素氯化血红素, ,5 5脱纤维羊脱纤维羊,1g/ml Vit K,1g/ml Vit K。厌氧。厌氧孵育条件孵育条件 ，质控菌株为脆弱类杆菌，质控菌株为脆弱类杆菌ATCC25285ATCC25285。 第七节 抗真菌药物敏感性试验 一、抗真菌药物一、抗真菌药物 分成三类：分成三类： 多烯类抗生素多烯类抗生素 如两性霉素如两性霉素B B、制、制 霉菌素、曲古霉素等；霉菌素、曲古霉素等； 毗咯类毗咯类 包括酮康唑、伊曲康唑、包括酮康唑、伊曲康唑、 氟康唑、克

49、霉唑、益康唑等；氟康唑、克霉唑、益康唑等； 其他类其他类 如氟胞嘧啶。如氟胞嘧啶。 二、抗真菌药物敏感性试验二、抗真菌药物敏感性试验 操作同抗菌药物敏感性试验，原则为：操作同抗菌药物敏感性试验，原则为： 提供两种以上有相当活性的抗提供两种以上有相当活性的抗 真菌药物的可信测量方法；真菌药物的可信测量方法； 和体内的活性具有相关性，可和体内的活性具有相关性，可 预测治疗的效果；预测治疗的效果； 可用来监控敏感群体菌株耐药可用来监控敏感群体菌株耐药 性发生；性发生； 可预期研究新药的潜在治疗效能。可预期研究新药的潜在治疗效能。抗酵母菌的药物敏感性试验抗酵母菌的药物敏感性试验1 1培养基培养基 含谷

50、氨酸胺和含谷氨酸胺和PHPH指示剂、指示剂、 不含碳酸氢钠，不含碳酸氢钠，RPMI 1640RPMI 1640为试为试 验用的培养基。验用的培养基。2. 2. 药物原液配制药物原液配制 来自药厂，不能来自药厂，不能 使用临床应用的药物，原液使用临床应用的药物，原液1010倍倍 于最高试验浓度，于最高试验浓度，6060贮存。贮存。3 3接种菌液制备接种菌液制备 沙氏琼脂培养基沙氏琼脂培养基3535 孵育孵育24h,24h,传代两次，保证纯种，以传代两次，保证纯种，以 RPMll640 RPMll640稀释成稀释成2102103 3CFUCFUmlml。药。药 液对倍稀释为试验时用量。液对倍稀释为试验时用量。4. 4. 试验时应有生长对照和阴性对照。试验时应有生长对照和阴性对照。 5.5.结果判断结果判断 观察各管（孔）生长情观察各管（孔）生长情 况。二性霉素况。二性霉素B B的的MICMIC为抑制测试菌为抑制测试菌 肉眼可见生长的最低药物浓度。肉眼可见生长的最低药物浓度。5FC5FC 和吡咯类通常采用和吡咯类通常采用 80 80MICMIC判断标准。判断标准。6.6.质量控制质量控制 采用标准菌株作为每次测采用标准菌株作为每次测 定质控菌株，其定质控菌株，其MICMIC应在预期值范围应在预期值范围 内（内（g/ml ）。）。