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1、家兔急性家兔急性肾功能不全肾功能不全实验目的实验目的n n复制急性中毒性肾衰动物模型，通过对复制急性中毒性肾衰动物模型，通过对肾功能指标的检测及肾脏形态学改变的肾功能指标的检测及肾脏形态学改变的观察，了解中毒家兔肾功能的改变。判观察，了解中毒家兔肾功能的改变。判断、分析致病因素及导致急性肾衰的可断、分析致病因素及导致急性肾衰的可能发病机制。能发病机制。实验原理实验原理n n肾脏是一个多功能器官，其主要功能之一肾脏是一个多功能器官，其主要功能之一是泌尿功能。肾脏通过调节肾血流、肾小是泌尿功能。肾脏通过调节肾血流、肾小球滤过率、肾小管排泌与重吸收以及排泄球滤过率、肾小管排泌与重吸收以及排泄体内代谢
2、物质以维持机体内环境的稳定。体内代谢物质以维持机体内环境的稳定。当肾血流量减少，肾小球滤过率下降或肾当肾血流量减少，肾小球滤过率下降或肾小管排泌重吸收功能障碍时，肾的泌尿功小管排泌重吸收功能障碍时，肾的泌尿功能受到影响，从而导致肾功能不全。能受到影响，从而导致肾功能不全。n nARF发病机制的中心环节是发病机制的中心环节是GFR的降低。的降低。肾血流量减少，肾小管阻塞、肾小管原尿回肾血流量减少，肾小管阻塞、肾小管原尿回漏或肾细胞损伤等均可导致漏或肾细胞损伤等均可导致GFR的降低。的降低。n n 本实验通过皮下注射本实验通过皮下注射1HgCl2造成家兔造成家兔急性肾小管性坏死。急性肾小管性坏死。
3、n n 通过本实验学习复制急性通过本实验学习复制急性中毒性中毒性肾衰动肾衰动物模型；观察肾衰家兔的一般状态、酚红排物模型；观察肾衰家兔的一般状态、酚红排泄率、肌酐清除率等变化；观察急性肾衰时泄率、肌酐清除率等变化；观察急性肾衰时肾脏大体形态；根据实验指标，判断、分析肾脏大体形态；根据实验指标，判断、分析急性肾衰的发病机制及病理生理变化；对急急性肾衰的发病机制及病理生理变化；对急性肾衰的病因、发病机制和功能代谢变化加性肾衰的病因、发病机制和功能代谢变化加深理解。深理解。实验对象实验对象n n家兔家兔23kg。实验药品与器材实验药品与器材n n1HgCl2、生理盐水、25氨基甲酸乙酯、06酚红、2
4、0葡萄糖、10NaOH、手术器械一套，注射器、试管、加样器、721分光光度计、水浴锅、离心机。实验步骤实验步骤n n复制肾功能衰竭模型：于实验前一天，复制肾功能衰竭模型：于实验前一天，取两只家兔，称重，一只皮下或肌肉注取两只家兔，称重，一只皮下或肌肉注射射1HgCl2(o810mlkg)造成急造成急性肾功能衰竭，为实验组兔；另一只皮性肾功能衰竭，为实验组兔；另一只皮下或肌肉注射等量的生理盐水下或肌肉注射等量的生理盐水(10mlkg)作为对照组兔。作为对照组兔。实验步骤实验步骤n n观察：观察：24h后，比较两组动物的一般状态、后，比较两组动物的一般状态、活动情况与尿量。活动情况与尿量。n n家
5、兔称重，耳缘静脉注射家兔称重，耳缘静脉注射25氨基甲酸氨基甲酸乙酯乙酯40mlkg，待动物麻醉后，固定，待动物麻醉后，固定于兔台于兔台。角角膜膜反反射射夹夹肢肢反反射射实验步骤实验步骤家兔家兔心脏采血心脏采血35ml置于一干燥管中（不抗置于一干燥管中（不抗凝），放置凝），放置10min后，后，3000r/min离心离心15min，小心吸取血清置于另一干燥管中，小心吸取血清置于另一干燥管中，备测血肌酐备测血肌酐实验步骤实验步骤n n如果心脏采血失败，则如果心脏采血失败，则颈总动脉颈总动脉采血采血n n颈部正中剪毛，切开皮肤，分离左侧颈颈部正中剪毛，切开皮肤，分离左侧颈总动脉，在动脉下穿两根丝线，
6、用一根总动脉，在动脉下穿两根丝线，用一根丝线结扎动脉的远心端，近心端用动脉丝线结扎动脉的远心端，近心端用动脉夹夹闭，在结扎线下方的动脉壁上剪一夹夹闭，在结扎线下方的动脉壁上剪一小斜口，然后向心脏方向插入动脉导管小斜口，然后向心脏方向插入动脉导管放血放血3ml备测血肌酐备测血肌酐实验步骤实验步骤n n分离右侧颈外静脉，插管用于输液。分离右侧颈外静脉，插管用于输液。输输液速度一定要慢液速度一定要慢n n下腹部正中剪毛，在耻骨联合上约下腹部正中剪毛，在耻骨联合上约15cm处做切口，长约处做切口，长约4cm，暴露膀胱，暴露膀胱，用用注射器收集注射器收集2ml尿液于试管中，尿液于试管中，做做尿肌酐尿肌酐
7、检查。检查。实验步骤实验步骤n n在膀胱底部，找出两侧输尿管，并分离在膀胱底部，找出两侧输尿管，并分离之。在近膀胱端结扎输尿管，稍等片之。在近膀胱端结扎输尿管，稍等片 刻，刻，待其略充盈后，用眼科剪剪一小口，向待其略充盈后，用眼科剪剪一小口，向肾脏方向插入一细塑料管肾脏方向插入一细塑料管(塑料管事先用塑料管事先用肝素冲洗或充满肝素肝素冲洗或充满肝素)，结扎并固定，用，结扎并固定，用于收集尿液。于收集尿液。实验步骤实验步骤酚红排泄率测定：酚红排泄率测定：n n 1)两组家兔分别耳缘静脉注射两组家兔分别耳缘静脉注射o6酚酚红溶液红溶液(1mlkg)，接着从颈外静脉插管，接着从颈外静脉插管处注射处注
8、射20葡萄糖溶液葡萄糖溶液(30mlkg)。收集。收集从开始注射酚红起从开始注射酚红起15min或或30min的尿液。的尿液。换算成单位时间的尿量换算成单位时间的尿量(mlmin)。实验步骤实验步骤n n将收集的尿液倒入将收集的尿液倒入500ml量筒内，加量筒内，加10NaOH lOml，用自来水补充至，用自来水补充至500ml处，处，混匀后，取出适当量放入与比色管混匀后，取出适当量放入与比色管口径口径相同相同的试管中与标准比色管比较，得出的试管中与标准比色管比较，得出15min或或30min内肾脏酚红排泄率。内肾脏酚红排泄率。实验步骤实验步骤n n肾脏酚红排泄率：是反映肾血流量与肾肾脏酚红排
9、泄率：是反映肾血流量与肾小管排泌功能的指标。小管排泌功能的指标。正常情况下从静正常情况下从静脉注入酚红后脉注入酚红后15min或或30min，肾脏酚红，肾脏酚红排泄率分别排泄率分别30%与与45%。实验步骤实验步骤n n血清和尿液肌酐含量测定血清和尿液肌酐含量测定苦味酸沉定苦味酸沉定蛋白法蛋白法n n原理：在碱性条件下，苦味酸与（血、尿原理：在碱性条件下，苦味酸与（血、尿中）肌酐作用，生成黄红色苦味酸肌酐，中）肌酐作用，生成黄红色苦味酸肌酐，使溶液呈色后进行使溶液呈色后进行比色比色测定；然后加测定；然后加醋酸醋酸，在酸性环境中，黄红色的苦味酸肌酐被清在酸性环境中，黄红色的苦味酸肌酐被清除，非肌
10、酐物质（除，非肌酐物质（假肌酐）假肌酐）呈色，呈色，两者比两者比色之差为血及尿中肌酐。色之差为血及尿中肌酐。按表按表1、表、表2的操的操作步骤测定血清及尿液肌酐。作步骤测定血清及尿液肌酐。表表1 血清肌酐测定血清肌酐测定单位（单位（ml）标准管标准管测定管测定管空白管空白管肌酐标准应肌酐标准应用液用液（0.05mg/ml）0.20_血清血清_0.20_蒸馏水蒸馏水_0.20碱性苦味酸碱性苦味酸2.02.02.0实验步骤实验步骤n n混匀，混匀，37OC水浴水浴30 min，以以510nm波长比波长比色，空白管调零，读色，空白管调零，读OD值，然后，各管加值，然后，各管加50%醋酸醋酸液两滴，放
11、置液两滴，放置6min后，在测后，在测OD值。计算：值。计算：n n Crp(mg%)=OD测测OD测测/ OD标标OD标标0.01/0.2100 n n正常值正常值:0.70.8mg%(1mg%=88.4 mol/L)。表表2 尿肌酐测定尿肌酐测定单位（单位（ml）测定管测定管标准管标准管空白管空白管尿液（原尿或尿液（原尿或1：50稀释）稀释）0.1_尿肌酐标准应尿肌酐标准应用液用液（0.5mg/ml）_0.1_蒸馏水蒸馏水_0.1碱性苦味酸碱性苦味酸222125%NaoH0.50.50.5实验步骤实验步骤n n混匀，放混匀，放10min后加蒸馏水后加蒸馏水6。0ml，摇匀，摇匀，以以530
12、nm波长比色，空白管调零，读波长比色，空白管调零，读OD值。计算：值。计算：n n Cru(mg%)=OD测测/OD标标0.05mg100ml/0.1mln n实验步骤实验步骤n n尿肌酐尿肌酐/血肌酐的意义：器质性肾衰时比血肌酐的意义：器质性肾衰时比值值20；功能性肾衰时比值；功能性肾衰时比值40。内生肌酐清除率内生肌酐清除率(Ccr)：能较准确的反映肾小球滤过率能较准确的反映肾小球滤过率(GFR) n n Ccr=Cr尿尿尿量（尿量（ml/min）/Cr血血n n为此，实验步骤为此，实验步骤收集尿液收集尿液必须采集有必须采集有“记录单记录单位时间的尿量位时间的尿量”的尿液样品做尿肌酐的尿液
13、样品做尿肌酐Cr尿尿测定，测定，才能与血肌酐才能与血肌酐Cr血血比，计算出比，计算出GFR。肌酐能自。肌酐能自由从肾小球滤过，在肾小管中很少被重吸收，由从肾小球滤过，在肾小管中很少被重吸收，但有少量是由近曲小管分泌。内生肌酐在血浆但有少量是由近曲小管分泌。内生肌酐在血浆中的浓度相当低，近曲小管分泌的肌酐量可忽中的浓度相当低，近曲小管分泌的肌酐量可忽略不计，因此略不计，因此Ccr与菊粉清除率相近，可以代表与菊粉清除率相近，可以代表肾小球滤过率。肾小球滤过率。实验步骤实验步骤肾形态学观察：处死家兔，取出肾脏，称肾形态学观察：处死家兔，取出肾脏，称肾重量，计算肾体比，比较两组家兔肾肾重量，计算肾体比，比较两组家兔肾脏外形，纵向剖开肾脏，观察皮髓质条脏外形，纵向剖开肾脏，观察皮髓质条纹、色泽等。纹、色泽等。思考题思考题n n1试分析氯化高汞（升汞）中毒性急性试分析氯化高汞（升汞）中毒性急性肾功能不全的主要发病机制是什么？肾功能不全的主要发病机制是什么？n n2哪些实验结果可说明肾血流量减少也哪些实验结果可说明肾血流量减少也参与升汞中毒性肾衰的发生机制？为什参与升汞中毒性肾衰的发生机制？为什么肾血液量会减少？么肾血液量会减少？n n3. 急性肾功衰时，家兔的尿液有哪些变急性肾功衰时，家兔的尿液有哪些变化？为什么？化？为什么？
