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1、第第三三章章 酶的生物合成法生产酶的生物合成法生产(1)(1) 提取分离法提取分离法 微生物细胞发酵产酶微生物细胞发酵产酶 酶的生产方法酶的生产方法 生物合成法生物合成法 植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶 化学合成法化学合成法 动物细胞培养产酶动物细胞培养产酶 酶生物合成的调节酶生物合成的调节 调节基因调节基因(regulator gene)：可产生一种组成型可产生一种组成型调节蛋白调节蛋白(regulatory protein) （一种变（一种变构蛋白），构蛋白），通过与效应物通过与效应物(effector) （包括诱导物和辅阻遏物）（包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变
2、它与操纵基因的结合力。的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。调节基因常位于调控区的上游。调节基因常位于调控区的上游。 cAMP-CAP复合物的作用示意图复合物的作用示意图 启动基因（启动基因（promotor gene）（启动子）：）（启动子）：有两个位点：有两个位点： （1）RNA聚合酶的结合位点聚合酶的结合位点（2）cAMP-CAP的结合位点。的结合位点。CAP：分解代谢产物基因活化蛋白（：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolite gene activator protein） 只有只有cAMP-CAP复合物结合到启动子的位点上，复合物结合到启动子的位点上，RNA聚
3、合酶才能结合到聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才能开始。其在启动子的位点上，酶的合成才能开始。 操纵基因（操纵基因（Operater gene）: 位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。与速度。结构基因（结构基因（Structural gene）: 决定某一多肽的决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自的对应关系，其模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为中的遗传信息可转录为mRNA，再翻译为蛋白质。，再翻译为蛋
4、白质。酶合成调节的类型酶合成调节的类型 1.诱导诱导 (induction) 组成酶：细胞固有的酶类。组成酶：细胞固有的酶类。 诱诱导导酶酶：是是细细胞胞为为适适应应外外来来底底物物或或其其结结构构类类似似物物而而临临时时合成的一类酶。合成的一类酶。 2.阻遏阻遏 (repression) 分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏(catabolite repression) 反馈阻遏反馈阻遏(feedback repression)酶合成的调节机制酶合成的调节机制1. 酶合成的诱导酶合成的诱导加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。酶合成诱导的现象：酶合成诱导
5、的现象：已知分解利用乳糖的酶有：已知分解利用乳糖的酶有：半乳糖苷酶；半乳糖苷酶； -半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。实验：实验：（1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；三种酶合成； （2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；酶合成； （3）表明菌体生物合成的经济原则：）表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成需要时才合成。调节调节基因基因操纵操纵基因基因乳糖结构基因乳糖结构基因PLacZLacYLacamRNA 阻遏蛋
6、白阻遏蛋白（有活性）（有活性）基基 因因 关关 闭闭启启动动子子ORPLacZLacYLaca调节调节基因基因操纵操纵基因基因乳糖结构基因乳糖结构基因启启动动子子ORmRNAZmRNAYmRNAa 阻遏蛋白阻遏蛋白（无活性）（无活性） 基基 因因 表表达达mRNAA、乳糖操纵子的结构、乳糖操纵子的结构B、乳糖酶的诱导、乳糖酶的诱导 乳糖乳糖 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性）（有活性）诱诱导导2.末端产物阻遏末端产物阻遏由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。酶合成阻遏的现象：酶合成阻遏的现象：实验：实验： （1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，）
7、大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时， 检测到细检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；胞内有色氨酸合成酶的存在； （2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。的活性降低，直至消失。 （3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则生长的经济原则:不需要就不合成不需要就不合成。 色氨酸操纵子色氨酸操纵子酶的阻遏酶的阻遏调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因mRNA酶蛋白酶蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，阻遏蛋白不能与操纵
8、基因结合，结构基因表达结构基因表达调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因辅阻遏物辅阻遏物代谢产物与阻遏蛋白结代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化合，使之构象发生变化与操纵基因结合，结构基与操纵基因结合，结构基因不能表达因不能表达酶酶的的诱诱导导和和阻阻遏遏操操纵纵子子模模型型B.有活性阻遏蛋白加诱导剂有活性阻遏蛋白加诱导剂A.有活性阻遏蛋白有活性阻遏蛋白C.无活性阻遏蛋白无活性阻遏蛋白D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂操纵基因操纵基因启动基因启动基因调节基因调节基因结构基因结构基因 阻遏蛋阻遏蛋白白(有活性有活性)阻遏蛋白阻挡操纵基因阻遏蛋白阻挡操纵基因结构基因
9、不表达结构基因不表达诱导物诱导物诱导物与阻遏蛋白结合诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起使阻遏蛋白不能起到阻挡操纵基因的作用到阻挡操纵基因的作用,结构基因可以表达结构基因可以表达酶蛋白酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操纵基因结合阻遏蛋白不能跟操纵基因结合, 结构基因可以表达结构基因可以表达阻遏蛋白阻遏蛋白(无活性无活性)酶蛋白酶蛋白mRNA代谢产物与阻遏蛋白结合代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋从而使阻遏蛋白能够阻挡操纵基因白能够阻挡操纵基因,结构基因不表达结构基因不表达代谢产物代谢产物3.3.分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，指细胞内同时有两种分解底
10、物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。的现象。分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。分解代谢物阻遏现象：分解代谢物阻遏现象： 实验：实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开
11、始利用乳糖，产生了两个对数生长期中糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象二次生长现象”(diauxie或或biphasic growth）。）。 这一现象又称葡萄糖效应，产生这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。解乳糖酶系的合成。此调节基因的产此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（物是环腺苷酸受体蛋白（CRP）,亦称亦称降解物基因活化蛋白（降解物基因活化蛋白（CAP）。）。基本概念：基本概念：经过预先设计，通过人工操作，利用经过预先设计，通过人工操作
12、，利用微生物微生物、植植物物或或动物细胞动物细胞的生命活动，获得所需酶的技术过程，的生命活动，获得所需酶的技术过程，称为称为酶的生物合成法生产。酶的生物合成法生产。Section 1 产酶细胞的选择产酶细胞的选择用于酶的生产的细胞必须具备几个条件：用于酶的生产的细胞必须具备几个条件：1.1.酶的产量高酶的产量高2.2.容易培养和管理容易培养和管理3.3.产酶稳定性好，不易变异退化，不易被感染产酶稳定性好，不易变异退化，不易被感染4.4.利于酶的分离纯化利于酶的分离纯化5.5.安全可靠，无毒性安全可靠，无毒性一、微生物一、微生物微生物发酵产酶的优点：微生物发酵产酶的优点：1 1）微生物种类繁多；
13、）微生物种类繁多；2) 2) 微生物生长周期短，繁育快；微生物生长周期短，繁育快；3) 3) 微生物易改造，可通过多种手段育种。微生物易改造，可通过多种手段育种。（一）细菌（一）细菌(bacteria)1) 无芽孢杆菌无芽孢杆菌大肠杆菌大肠杆菌(Escherichia coli)E coli.产生的酶一般都属于胞内酶。产生的酶一般都属于胞内酶。(2) 芽孢杆菌芽孢杆菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)枯草枯草芽孢芽孢杆菌，是杆菌，是芽孢杆菌属芽孢杆菌属的一种。单个的一种。单个细胞细胞 0.70.823微米，微米，着色均匀。无荚膜，周生着色均匀。无荚膜，周生鞭毛鞭毛，
14、能运动。，能运动。革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌，芽孢，芽孢0.60.91.01.5微米，微米，椭圆椭圆到柱状，位于到柱状，位于菌体菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。体不膨大。菌落菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉淀粉，分解色氨，分解色氨酸形成吲哚。酸形成吲哚。(3) 球菌球菌微球菌属微球菌属(Micrococcus)：微球菌微球菌属拉丁学名属拉丁学名(Micrococcus Cohn,1872) 细胞球形，
15、直径细胞球形，直径0.52.0m，成对、四联或成，成对、四联或成簇出现，但不成链。革兰氏阳性。罕见运动，不生芽孢。严簇出现，但不成链。革兰氏阳性。罕见运动，不生芽孢。严格好氧。菌落常有黄或红的色调。格好氧。菌落常有黄或红的色调。链球菌属链球菌属(Streptococcus)：链球菌链球菌(Streptococcus)是一类是一类球形的球形的革兰氏阳性革兰氏阳性细菌细菌，属于，属于厚壁菌门厚壁菌门的一个的一个属属。2放线菌放线菌 （actinomycetes)放线菌是一群高放线菌是一群高GC含量的革兰氏阳性细菌。放线菌能产生含量的革兰氏阳性细菌。放线菌能产生各种胞外酶，如蛋白酶、葡萄糖异构酶、溶
16、菌酶等，而且放各种胞外酶，如蛋白酶、葡萄糖异构酶、溶菌酶等，而且放线菌还是生产抗生素的主要微生物。线菌还是生产抗生素的主要微生物。链霉菌链霉菌3酵母菌酵母菌酵母菌酵母菌(yeast)是是类单细胞微生物，但不同于细菌，属于真类单细胞微生物，但不同于细菌，属于真核微生物。核微生物。酿酒酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)球拟酵母球拟酵母假丝酵母假丝酵母(Candida)拟酵母4. 4. 霉菌霉菌霉菌是一类丝状真菌，用于酶的发酵生产的霉菌主要有黑曲霉菌是一类丝状真菌，用于酶的发酵生产的霉菌主要有黑曲霉、米曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉等。霉、米曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉等
17、。黑曲霉：黑曲霉，半知菌亚门，黑曲霉：黑曲霉，半知菌亚门，丝孢纲丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属曲霉属真菌真菌中的一个常见种。中的一个常见种。米曲霉米曲霉(Aspergillus oryzae)：半知菌亚门半知菌亚门，丝孢纲丝孢纲，丝孢，丝孢目，从梗孢科，目，从梗孢科，曲霉属曲霉属真菌真菌中的一个常见种。米中的一个常见种。米曲霉菌曲霉菌落生落生长快，长快，10d直径达直径达56cm，质地疏松，初白色、黄色，后变，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色。背面无色。分生孢子头放射状，一直径为褐色至淡绿褐色。背面无色。分生孢子头放射状，一直径150300m，也有少数为疏松柱状
18、。分生孢子梗，也有少数为疏松柱状。分生孢子梗2mm左右。左右。青霉青霉(Penicillium)：一般指青霉属。为分布很广的子囊菌纲：一般指青霉属。为分布很广的子囊菌纲中的一属，和曲霉属有亲缘关系，有二百几十种，代表种是中的一属，和曲霉属有亲缘关系，有二百几十种，代表种是灰绿青霉，从土壤或空气中很易分离。分枝成帚状的分生孢灰绿青霉，从土壤或空气中很易分离。分枝成帚状的分生孢子从菌丝体伸向空中，各顶端的小梗产生链状的青绿子从菌丝体伸向空中，各顶端的小梗产生链状的青绿褐色褐色的分生孢子。已知在生理学方面类似曲霉属，同时有很多能的分生孢子。已知在生理学方面类似曲霉属，同时有很多能产生毒枝菌素产生毒枝
19、菌素木霉木霉(Trichoderma)：木霉属于：木霉属于半知菌亚门半知菌亚门，丛梗孢目丛梗孢目，木，木霉属，常见的木霉有绿色木霉、康宁木霉等。霉属，常见的木霉有绿色木霉、康宁木霉等。根霉根霉(Rhizopus)：接合菌亚门接合菌亚门、接合菌纲接合菌纲、毛霉目毛霉目、毛霉科毛霉科真菌中的一个大属。菌丝无隔、多核、分枝状，有匍匐菌丝真菌中的一个大属。菌丝无隔、多核、分枝状，有匍匐菌丝和假根，借此可在基物表面广泛蔓延，不产生定形菌落。和假根，借此可在基物表面广泛蔓延，不产生定形菌落。毛霉毛霉(Mucor)：毛霉又叫：毛霉又叫黑霉黑霉、长毛霉。、长毛霉。接合菌亚门接合菌亚门接合菌接合菌纲纲毛霉目毛霉
20、目毛霉科毛霉科真菌真菌中的一个大属。以中的一个大属。以孢囊孢子孢囊孢子和和接合孢子接合孢子繁殖。繁殖。菌丝菌丝无隔、多核、分枝状，在基物内外能广泛蔓延，无隔、多核、分枝状，在基物内外能广泛蔓延，无无假根假根或或匍匐菌丝匍匐菌丝。1 1土壤中的产酶微生物土壤中的产酶微生物2 2水体中的产酶微生物水体中的产酶微生物3 3空气中的产酶微生物空气中的产酶微生物4 4极端环境中的产酶微生物极端环境中的产酶微生物二、产酶微生物的来源二、产酶微生物的来源三、产酶微生物的分离和筛选三、产酶微生物的分离和筛选1)样品的采集样品的采集:从富含该酶作用底物的场所采集样品从富含该酶作用底物的场所采集样品2)富集培养富
21、集培养: 投其所好，取其所抗投其所好，取其所抗 3)分离获得微生物的纯培养（分离获得微生物的纯培养（pure culture）。）。4)初筛：选出产酶菌种，以多为主。初筛：选出产酶菌种，以多为主。5)复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。 菌种除了可以分离筛选得到，还可通过向菌保中心菌种除了可以分离筛选得到，还可通过向菌保中心购买，购买，中国工业微生物菌种保藏管理中心（中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）中国农业微生物菌种保藏管理中心（中国农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）中国普通微生物菌种保藏管理中心（中国普通微生物菌种保藏管理中心
22、（CGMCC）中国兽医微生物菌种保藏管理中心（中国兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）中国林业微生物菌种保藏管理中心（中国林业微生物菌种保藏管理中心（CFCC）中国药用微生物菌种保藏中心（中国药用微生物菌种保藏中心（CPCC）中国医学微生物菌种保藏管理中心（中国医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）中国海洋微生物保藏中心（中国海洋微生物保藏中心（MCCC）国外菌种保藏中心：国外菌种保藏中心：ATCC(American Type Culture Collection）美国典型菌种美国典型菌种保藏中心保藏中心 NBRC (NITE Biological Resource Center)日本技术评
23、价日本技术评价研究所生物资源中心研究所生物资源中心 CBS (Centraalbureauvoor Schimmelcultures) 荷兰微生荷兰微生物菌种保藏中心物菌种保藏中心 KCTC (Korean Collection for Type Cultures) 韩国典型菌韩国典型菌种保藏中心种保藏中心 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen ) 德国微生物菌种保藏中心德国微生物菌种保藏中心酶发酵生产的一般工艺流程酶发酵生产的一般工艺流程 酶发酵工艺组成部分培养基制备 种子培养发酵罐产物的提取精制无菌空气生长
24、和产酶、经济、高转化纯种、高生长率无菌、高溶氧、均匀混合多相系统传质传热培养条件维持高密度发酵、产酶经济、高收率控制点Medium and InoculationAgitationCooling and heatingAir inlet and outletpH controlVolume control一般性工艺条件Nutrient additionProtein biosynthesisInductionRepressionExcretionGene stability特殊工艺条件Section 2 培养基的配制培养基的配制培养基培养基培养基是人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物质的培
25、养基是人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物质的混合物。混合物。培养基多种多样，千差万别，但培养基的组分一般包括碳源、培养基多种多样，千差万别，但培养基的组分一般包括碳源、氮源、无机盐和生长因子等几个方面。氮源、无机盐和生长因子等几个方面。五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水培养基的设计原则：培养基的设计原则：适宜的营养物质适宜的营养物质营养物质的浓度与配比合适营养物质的浓度与配比合适物理、化学条件合适物理、化学条件合适经济节约经济节约精心设计，试验比较精心设计，试验比较1）培养基的组分）培养基的组分碳源碳源凡能提供细胞营养所需的碳元素凡能提供
26、细胞营养所需的碳元素(碳架碳架)的营养源，称为碳源的营养源，称为碳源(carbon source)。细胞中碳元素含量相当高，一般占干物。细胞中碳元素含量相当高，一般占干物质的质的50左右，因此碳源是工业发酵中使用的主要原料之左右，因此碳源是工业发酵中使用的主要原料之一。一。原料的供应和价格原料的供应和价格 最常用的碳原为淀粉水解物最常用的碳原为淀粉水解物氮源氮源凡能提供细胞生长繁殖所需氮元素的营养源，称为氮源。氮凡能提供细胞生长繁殖所需氮元素的营养源，称为氮源。氮源主要功能是构成细胞的蛋白质、核酸以及含氮代谢产物；源主要功能是构成细胞的蛋白质、核酸以及含氮代谢产物；同时，当培养基中碳源不足时，
27、可作为补充碳源。同时，当培养基中碳源不足时，可作为补充碳源。氮源可分为有机氮源和无机氮源两种。氮源可分为有机氮源和无机氮源两种。有机氮源有机氮源无机氮源无机氮源培养基中碳和氮两者的比例对酶的产量有显著的影响。培养基中碳和氮两者的比例对酶的产量有显著的影响。C/N无机盐和微量元素无机盐和微量元素无机盐的主要作用是提供细胞生命活动不可缺少的无机元素，无机盐的主要作用是提供细胞生命活动不可缺少的无机元素，并对培养基的并对培养基的pH、氧化还原电位和渗透压起调节作用。各种、氧化还原电位和渗透压起调节作用。各种无机元素的功用各不相同，无机元素的功用各不相同，细胞的主要组分细胞的主要组分酶的激活剂或抑制剂
28、酶的激活剂或抑制剂对培养基的对培养基的pH、渗透压、氧化还原电位起调节作用、渗透压、氧化还原电位起调节作用大量元素和微量元素大量元素和微量元素生长因子生长因子生长因子生长因子(growth factor)是一类对细胞正常代谢必不可少是一类对细胞正常代谢必不可少且不能用简单的碳源和氮源自行合成的有机物。它的需要且不能用简单的碳源和氮源自行合成的有机物。它的需要量一般很少。广义的生长因子除了维生素外，还包括各种量一般很少。广义的生长因子除了维生素外，还包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、以及动植物生长的激素等。氨基酸、嘌呤、嘧啶、以及动植物生长的激素等。水水水是微生物最基本的成分（水是微生物最基本的成分（
29、70%-90%）水是微生物吸收营养物质、排泄代谢物的溶剂水是微生物吸收营养物质、排泄代谢物的溶剂水细胞成分，直接参与代谢活动水细胞成分，直接参与代谢活动调节细胞环境的温度稳定调节细胞环境的温度稳定实验室的常用培养基：实验室的常用培养基：细菌：细菌： 牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；放线菌：高氏放线菌：高氏1 1号合成培养基培养；号合成培养基培养；酵母菌：麦芽汁培养基；酵母菌：麦芽汁培养基；霉菌：霉菌： 查氏合成培养基；查氏合成培养基；例如枯草芽孢杆菌：例如枯草芽孢杆菌：一般培养：肉汤培养基或一般培养：肉汤培养基或LB培养基；培养基；自然转
30、化：基础培养基；自然转化：基础培养基；观察芽孢：生孢子培养基；观察芽孢：生孢子培养基；产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；枯草杆菌枯草杆菌BF7658-淀粉酶发酵培养基淀粉酶发酵培养基：玉米粉：玉米粉8%，豆饼粉，豆饼粉4%，磷酸氢二钠，磷酸氢二钠 0.8%，硫酸铵，硫酸铵0.4%，氯化钙，氯化钙0.2%，氯化按，氯化按0.15%（自然（自然pH）。）。枯草杆菌枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶发酵培养基中性蛋白酶发酵培养基：玉米粉：玉米粉4%，豆饼粉，豆饼粉3%，麸皮，麸皮3.2%, 糠糠1%, 磷酸氢二钠磷酸氢二钠0.4%, 磷酸二氢钾
31、磷酸二氢钾0.03%（自然（自然pH）。）。黑曲霉糖化酶发酵培养基黑曲霉糖化酶发酵培养基：玉米粉：玉米粉10%，豆饼粉，豆饼粉4%，麸皮，麸皮1%（pH4.45.0）。）。地衣芽孢杆菌地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶发酵培养基碱性蛋白酶发酵培养基：玉米粉：玉米粉5.5%, 豆饼豆饼4%, 磷酸氢二钠磷酸氢二钠0.4%, 磷酸二氢钾磷酸二氢钾0.03%(pH 8.5)。黑曲霉黑曲霉AS 3.350酸性蛋白酶发酵培养基酸性蛋白酶发酵培养基: 玉米粉玉米粉6%, 豆饼粉豆饼粉4%, 玉米浆玉米浆0.6%, 氯化钙氯化钙0.5%, 氯化铵氯化铵1%, 磷酸氢二钠磷酸氢二钠0.2% (pH 5.5)。 游
32、动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基游动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基：糖蜜：糖蜜2%，豆饼粉，豆饼粉2%，磷酸氢二钠，磷酸氢二钠0。1%，硫，硫酸镁酸镁0。05% (pH 7.2)。桔青霉磷酸二酯酶发酵培养基桔青霉磷酸二酯酶发酵培养基：淀粉水解糖：淀粉水解糖5%，蛋白胨，蛋白胨0.5%, 硫酸镁硫酸镁0.05%, 氯化钙氯化钙0.04%, 磷酸氢二钠磷酸氢二钠0.05%, 磷酸二氢钾磷酸二氢钾0.05% (自然自然pH)。黑曲霉黑曲霉AS3.396果胶酶发酵培养基果胶酶发酵培养基: 麸皮麸皮5%, 果胶果胶0.3%, 硫酸铵硫酸铵2%, 磷酸二氢钾磷酸二氢钾0.25%, 硫酸镁硫酸镁0.05%, 硝
33、酸钠硝酸钠0.02%, 硫酸亚铁硫酸亚铁0.001% (自然自然pH)。枯草杆菌枯草杆菌AS1.398碱性磷酸酶发酵培养基碱性磷酸酶发酵培养基: 葡萄糖葡萄糖0.4%, 乳蛋白水解物乳蛋白水解物0.1%, 硫酸铵硫酸铵1%, 氯化钾氯化钾0.1%, 氯化钙氯化钙0.1mmol/L, 氯化镁氯化镁1.0mmol/L, 磷酸氢二钠磷酸氢二钠20mol/L ( 用用pH7.4的的Tris-HCl缓冲液配制缓冲液配制)2 2）发酵培养基）发酵培养基制工业发酵培养基时的一般要求为：制工业发酵培养基时的一般要求为：营养物质的组成较丰富营养物质的组成较丰富在在一一定定条条件件下下，所所采采取取的的各各种种原
34、原材材料料彼彼此此之之间间不不能能产产生生化化学学反反应应，理化性质相对稳定理化性质相对稳定黏度适中，具有适当的渗透压黏度适中，具有适当的渗透压原材料的品种和浓度与代谢产物生物合成中的调节关系原材料的品种和浓度与代谢产物生物合成中的调节关系生产过程中的问题生产过程中的问题质优价廉，成本低。质优价廉，成本低。二、微生物培养基二、微生物培养基三、植物细胞培养基三、植物细胞培养基四、动物细胞培养基四、动物细胞培养基Section 3 产酶工艺条件及其控制产酶工艺条件及其控制微生物进行发酵生产成为当今酶生产的主要方法。微生物进行发酵生产成为当今酶生产的主要方法。根据细胞培养方式的不同，酶的发酵生产可以
35、分为根据细胞培养方式的不同，酶的发酵生产可以分为固体培养发酵、液体深层发酵、固定化细胞或固定固体培养发酵、液体深层发酵、固定化细胞或固定化原生质体发酵等。化原生质体发酵等。固体培养发酵固体培养发酵液体深层发酵液体深层发酵固定化细胞固定化细胞保存细胞保存细胞细胞活化细胞活化细胞扩大培养细胞扩大培养发酵发酵分离纯化分离纯化 酶酶固定化细胞固定化细胞预培养预培养无菌空气无菌空气原生质体原生质体固定化原生质体固定化原生质体培养基培养基微生物发酵产酶的工艺流程微生物发酵产酶的工艺流程1. 1. 细胞活化细胞活化性能优良的产酶细胞选育出来以后，必须尽可能的保持其生性能优良的产酶细胞选育出来以后，必须尽可能
36、的保持其生长和产酶特性不变异，不死亡，不被杂菌污染等。长和产酶特性不变异，不死亡，不被杂菌污染等。保藏细胞在使用之前必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一保藏细胞在使用之前必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下进行培养，以恢复细胞的生命活动能力，这就叫定的条件下进行培养，以恢复细胞的生命活动能力，这就叫做细胞活化。做细胞活化。2. pH的影响及其控制的影响及其控制(1)pH对发酵的影响对发酵的影响pH对微生物代谢活性产生影响的主要原因有下列几方面：对微生物代谢活性产生影响的主要原因有下列几方面：细胞内的细胞内的H或或OH-离子能够影响酶蛋白的解离度和电荷情离子能够影响酶蛋白的解离度和电荷情况
37、况pH影响细胞对基质的利用速度和细胞的结构影响细胞对基质的利用速度和细胞的结构pH影响细胞膜的电荷状况影响细胞膜的电荷状况(2)影响影响pH变化的因素变化的因素发发酵酵过过程程中中培培养养基基pH的的变变化化由由菌菌种种的的特特性性，培培养养基基组组成成，发发酵条件等决定，引起酵条件等决定，引起pH变化的主要原因：变化的主要原因：生理酸性盐生理酸性盐 生理碱性盐生理碱性盐(3)发酵发酵pH的确定和控制的确定和控制 1) 发酵发酵pH的确定的确定 2) pH的控制的控制首先需要考虑和试验发酵培养基的基础配方：首先需要考虑和试验发酵培养基的基础配方：其次可在发酵过程中直接补加酸或碱和补料的方式来控
38、制其次可在发酵过程中直接补加酸或碱和补料的方式来控制溶解氧调节，控制代谢中间产物的氧化程度溶解氧调节，控制代谢中间产物的氧化程度 3 3温度对发酵的影响温度对发酵的影响(1) (1) 发酵温度的影响发酵温度的影响温度的变化对发酵过程可产生两方面的影响：温度的变化对发酵过程可产生两方面的影响：一方面是影响各种催化酶反应的速率和蛋白质的性质；一方面是影响各种催化酶反应的速率和蛋白质的性质；另一方而是影响发酵液的物理性质另一方而是影响发酵液的物理性质(2) (2) 影响发酵温度变化的因素影响发酵温度变化的因素在发酵过程中温度的变化主要是由于发酵过程中既存在产生在发酵过程中温度的变化主要是由于发酵过程
39、中既存在产生热能的因素，又存在散失热能的因素。热能的因素，又存在散失热能的因素。(3) (3) 最适温度的选择与控制最适温度的选择与控制温度控制一般采用热水升温、冷水降温的方法，故此在发酵温度控制一般采用热水升温、冷水降温的方法，故此在发酵罐中，均设计有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管、罐中，均设计有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等，以保证能较好地控制发酵过程中的温度。夹套、喷淋管等，以保证能较好地控制发酵过程中的温度。4溶氧的影响及其控制溶氧的影响及其控制(1) 溶氧的影响溶氧的影响细胞的生长繁殖以及酶的生物合成过程需要大量的能量，这细胞的生长繁殖以及酶的生物合成
40、过程需要大量的能量，这些能量一般是由些能量一般是由ATP等高能化合物来提供。为了获得足够的等高能化合物来提供。为了获得足够的能量，以满足细胞生长和发酵产酶的需要，培养基中的能源能量，以满足细胞生长和发酵产酶的需要，培养基中的能源一般由碳源提供。碳源必须经过有氧分解才能合成大量的一般由碳源提供。碳源必须经过有氧分解才能合成大量的ATP。(2) (2) 溶氧浓度的控制溶氧浓度的控制发酵液的溶氧浓度变化，是由供氧和需氧两方面所决定发酵液的溶氧浓度变化，是由供氧和需氧两方面所决定的。控制发酵液中的溶氧浓度，需从如下两方面着手：的。控制发酵液中的溶氧浓度，需从如下两方面着手：1) 1) 从供氧方面考虑从
41、供氧方面考虑 提高氧分压。提高氧分压。增加通气量。增加通气量。延长气液接触时间。延长气液接触时间。增加气液比表面积。增加气液比表面积。改变培养液的性质。改变培养液的性质。添加氧载体。添加氧载体。2) 2) 从需氧方面考虑从需氧方面考虑根据需氧，可采用以下两方面的手段来提高发酵液中的溶氧根据需氧，可采用以下两方面的手段来提高发酵液中的溶氧速率：速率：限制培养液中的营养成分，减少细胞生长速率。限制培养液中的营养成分，减少细胞生长速率。降低培养温度：降低培养温度：Section 4 微生物发酵产酶微生物发酵产酶提高酶产量的措施提高酶产量的措施除了具有高产的菌种及合理的发酵工艺外，还可通过一些其除了具
42、有高产的菌种及合理的发酵工艺外，还可通过一些其它的措施如添加诱导物。控制阻遏物浓度、添加表面活性剂它的措施如添加诱导物。控制阻遏物浓度、添加表面活性剂等提高酶的产量。等提高酶的产量。1.1.添加诱导物添加诱导物2.2.控制阻遏物的浓度控制阻遏物的浓度3.3.添加表面活性剂添加表面活性剂4.4.添加产酶促进剂添加产酶促进剂酶发酵动力学酶发酵动力学( (fermentation kinetics) )发酵动力学主要研究在发酵过程中细胞生长速度、产物发酵动力学主要研究在发酵过程中细胞生长速度、产物生成速度、基质消耗速度以及环境因子对这些速度的影响。生成速度、基质消耗速度以及环境因子对这些速度的影响。
43、在酶的发酵生产过程中，研究细胞生长和发酵产酶动力学，在酶的发酵生产过程中，研究细胞生长和发酵产酶动力学，对于了解酶生物合成模式、发酵条件的优化机制、提高酶产对于了解酶生物合成模式、发酵条件的优化机制、提高酶产量，均有相当重要的意义。量，均有相当重要的意义。微生物的生长过程可以用细胞浓度的变化来表示。以细微生物的生长过程可以用细胞浓度的变化来表示。以细胞浓度的对数与细胞培养时间作图，可知，在分批培养中，胞浓度的对数与细胞培养时间作图，可知，在分批培养中，细胞生长一般经历细胞生长一般经历调整期，指数生长期，平衡期，衰亡期调整期，指数生长期，平衡期，衰亡期。一、酶生物合成的模式一、酶生物合成的模式比
44、较酶产生与细胞生长比较酶产生与细胞生长的关系的关系, ,可把酶生物合可把酶生物合成模式分成成模式分成4 4种类型种类型: :。通过计算比较的的生产与细胞生长的关系，可以把酶生物合成的模通过计算比较的的生产与细胞生长的关系，可以把酶生物合成的模式分为式分为4 4种类型：种类型：同步合成型、延续合成型、中期合成型、滞后合成型。同步合成型、延续合成型、中期合成型、滞后合成型。1.1.同步合成型同步合成型 ：酶合成与细胞合成生长同步：酶合成与细胞合成生长同步（1 1）酶的生物合成可以诱导，）酶的生物合成可以诱导，不受分解代谢物不受分解代谢物 阻遏和反阻遏和反应产物阻遏；应产物阻遏；（2 2）当除去诱导
45、物或细胞进）当除去诱导物或细胞进入平衡期后，酶的合成立即停入平衡期后，酶的合成立即停止；止；（3 3）酶所对应的）酶所对应的mRNAmRNA很不稳很不稳定。定。2.2.延续合成型延续合成型 延续合成型是指酶的生物合成在细胞的生长延续合成型是指酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞进入平衡期后，酶还可以延续合成较长的阶段开始，在细胞进入平衡期后，酶还可以延续合成较长的一段时间。一段时间。3.3.中期合成型中期合成型 中期合成型是指：酶的合成在细胞生长中期合成型是指：酶的合成在细胞生长段段时间以后才开始，而在进入细胞平衡期之后，酶的合成也终时间以后才开始，而在进入细胞平衡期之后，酶的合成也终止。
46、止。4.4.滞后合成型滞后合成型 这种类型只有当细胞生长进入平衡期之后，这种类型只有当细胞生长进入平衡期之后，酶才开始合成并大量积累。酶才开始合成并大量积累。影响酶生物合成的模式的主要因素是：影响酶生物合成的模式的主要因素是：（1）mRNA的稳定性；的稳定性；（2）培养基中阻遏物存在与否。）培养基中阻遏物存在与否。规律：规律：（1）mRNA稳定性高，细胞停止生长后继续合成其所对应的稳定性高，细胞停止生长后继续合成其所对应的酶；酶；（2）mRNA稳定性差，酶的合成随着细胞停止生长而终止；稳定性差，酶的合成随着细胞停止生长而终止；（3）受某些物质阻遏，细胞生长一段时间或在平衡期后（解）受某些物质阻
47、遏，细胞生长一段时间或在平衡期后（解除阻遏），开始合成酶。除阻遏），开始合成酶。（4）不受某些物质阻遏，酶的合成随着细胞生长而同步增长。）不受某些物质阻遏，酶的合成随着细胞生长而同步增长。选择与改造选择与改造（1）选择最理想的酶合成模式）选择最理想的酶合成模式延续合成型；延续合成型；（2）改造非理想模式）改造非理想模式 A、同步合成型：适当降低发酵温度，尽量提同步合成型：适当降低发酵温度，尽量提 高相应的高相应的mRNA的稳定性；的稳定性； B、滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢 物阻遏，使酶合成提早开始；物阻遏，使酶合成提早开始； C、中期合成型：努力提
48、高中期合成型：努力提高mRNA稳定性，解稳定性，解 除代谢物阻遏物。除代谢物阻遏物。二、细胞生长动力学二、细胞生长动力学主要研究细胞生长速度及其受外界环境影响的规律。主要研究细胞生长速度及其受外界环境影响的规律。19501950年年, ,法国的法国的MonodMonod首先提出表述微生物生长的动力首先提出表述微生物生长的动力学方程学方程, ,细胞生长速率与细胞浓度成正比。细胞生长速率与细胞浓度成正比。Rx =dX/dt= X只存在一种限制性基质时只存在一种限制性基质时: :Monod方程是基本的细胞生长动力学方程方程是基本的细胞生长动力学方程;从不同情况出发对其进行修饰。从不同情况出发对其进行
49、修饰。 : 比生长速率；比生长速率；S 限制性基质的浓度；限制性基质的浓度； Ks 莫诺德常数；莫诺德常数； m 最大比生长速率最大比生长速率连续全混流反应器发酵过程中连续全混流反应器发酵过程中, ,稳态时游离细胞连续稳态时游离细胞连续发酵的生长动力学方程发酵的生长动力学方程: : dx/dt=(-D)X D：稀释率稀释率D=0,分批发酵分批发酵;Du细胞浓度下降细胞浓度下降,S升高升高,u回升回升; Dum X趋于零趋于零;Monod方程与米氏方程相似方程与米氏方程相似,参数参数um与与Ks也可由双倒数作图也可由双倒数作图法求出法求出.三、产酶动力学三、产酶动力学宏观产酶动力学宏观产酶动力学
50、（非结构动力学）（非结构动力学）: :从整个发酵系统着眼从整个发酵系统着眼, ,研究群体细胞的产酶速率研究群体细胞的产酶速率 ；微观产酶动力学微观产酶动力学（结构动力学）（结构动力学）: :从细胞内部着眼从细胞内部着眼, ,研究细胞中酶合成速率。研究细胞中酶合成速率。1、分类、分类研究细胞产酶速率及各因素对其的影响。研究细胞产酶速率及各因素对其的影响。2、宏观产酶动力学方程通式、宏观产酶动力学方程通式dE/dt=(+)xX细胞浓度；细胞浓度；u细胞比生长速率；细胞比生长速率； 生长偶联的比产酶系数；生长偶联的比产酶系数； 非生长偶联的比产酶速率。非生长偶联的比产酶速率。细胞产酶模式不同，产酶速
51、率与细胞生长动力学关系也不同。细胞产酶模式不同，产酶速率与细胞生长动力学关系也不同。讨论讨论: :（1）同步合成型：生长偶联型）同步合成型：生长偶联型 =0，dE/dt=X（2）中期合成型：特殊生长偶联型）中期合成型：特殊生长偶联型 =0，dE/dt= X 有阻遏存在时，有阻遏存在时， =0，无酶产生，无酶产生 dE/dt= 0 阻遏解除后才开始合成酶阻遏解除后才开始合成酶.（3）滞后合成型：非生长偶联型，）滞后合成型：非生长偶联型， =0 , dE/dt=X（4）延续合成型：部分生长偶联型，）延续合成型：部分生长偶联型， 0， 0 dE/dt= X+XdE/dt=(+)x有关模型参数一般通过
52、线性化处理及尝试误差法有关模型参数一般通过线性化处理及尝试误差法求出求出. .Section 5 动、植物细胞产酶动、植物细胞产酶利用动植物细胞培养生产各种天然物质，是生物工程的一个利用动植物细胞培养生产各种天然物质，是生物工程的一个新领域，新领域，20世纪世纪80年代以来，利用植物细胞培养生产的有用年代以来，利用植物细胞培养生产的有用产物已达产物已达100多种，其中酶制剂有多种，其中酶制剂有10多种。包括糖苷酶多种。包括糖苷酶(胡萝胡萝卜细胞，卜细胞，1981)，过氧化物酶，过氧化物酶(甜菜细胞，甜菜细胞，1983；大豆细胞，；大豆细胞，1989)等。呈现出良好的发展前景。等。呈现出良好的发
53、展前景。一、动植物细胞的特点一、动植物细胞的特点:1 1、体积比微生物大；、体积比微生物大；2 2、对剪切力敏感；、对剪切力敏感；3 3、生长和代谢速率低，生长倍增时间和发酵周期长；、生长和代谢速率低，生长倍增时间和发酵周期长；4 4、动物细胞营养要求复杂；、动物细胞营养要求复杂；5 5、发酵产物不同、发酵产物不同二、植物细胞培养和发酵二、植物细胞培养和发酵1 1、植物细胞发酵技术和特点：、植物细胞发酵技术和特点：植物细胞发酵技术植物细胞发酵技术发酵特点（与直接提取分离相比较而言）：发酵特点（与直接提取分离相比较而言）：（1 1）提高产率；）提高产率；（2 2）缩短周期）缩短周期; ;（3 3
54、）易于管理、减轻劳动强度；）易于管理、减轻劳动强度；（4 4）提高质量。）提高质量。2、植物细胞发酵产酶的工艺条件控制、植物细胞发酵产酶的工艺条件控制（1）植物细胞生长和发酵所使用的培养基：）植物细胞生长和发酵所使用的培养基：大量无机盐、维生素和植物激素、无机氮源、碳源大量无机盐、维生素和植物激素、无机氮源、碳源(蔗糖蔗糖)MS培养基和培养基和B5培养基培养基（2）温度和）温度和pH值值（3）通风与搅拌）通风与搅拌（4）光照的控制）光照的控制（5）前体的添加）前体的添加（6）刺激剂的应用）刺激剂的应用三、动物细胞发酵三、动物细胞发酵1 1、动物细胞可以生产多种具有较高价值的药物，特别是疫、动物
55、细胞可以生产多种具有较高价值的药物，特别是疫苗、激素、单克隆抗体和酶等。苗、激素、单克隆抗体和酶等。由动物细胞培养生产的酶有胶原酶，血纤蛋白溶酶原活性剂由动物细胞培养生产的酶有胶原酶，血纤蛋白溶酶原活性剂等。等。2 2、动物细胞培养方法：、动物细胞培养方法：悬浮培养；固定化细胞培养悬浮培养；固定化细胞培养3 3、动物细胞发酵工艺条件的控制、动物细胞发酵工艺条件的控制Section 7 固定化细胞发酵产酶固定化细胞发酵产酶固定化细胞：固定化细胞：又称固定化活细胞、固定化增殖细胞用各种方法固定又称固定化活细胞、固定化增殖细胞用各种方法固定在载体上又能进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。是在载体上又能进
56、行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。是70年年代后期代后期(1978)发展起来的技术发展起来的技术;在发酵生产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等胞外酶方面在发酵生产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等胞外酶方面取得了成功。取得了成功。 一、固定化细胞发酵产酶的特点一、固定化细胞发酵产酶的特点1 1、提高产酶率：、提高产酶率：细胞密度增大细胞密度增大 生化反应加速生化反应加速 产酶率提高产酶率提高2、可在高稀释度下连续发酵：、可在高稀释度下连续发酵：D不影响固定化细胞不影响固定化细胞;3、基因工程菌的质粒稳定，不易丢失；、基因工程菌的质粒稳定，不易丢失；4、发酵稳定性好：细胞受载体保护，、发酵稳定性好：细胞受载体保护，
57、pH和和T适应性宽；适应性宽；5、缩短发酵周期，提高设备利用率；、缩短发酵周期，提高设备利用率；6、产品容易分离纯化；、产品容易分离纯化；7、适于胞外酶等胞外产物的生产。、适于胞外酶等胞外产物的生产。二、固定化细胞发酵产酶的工艺条件控制二、固定化细胞发酵产酶的工艺条件控制与游离细胞发酵大同小异，需特别注意的几个问题：与游离细胞发酵大同小异，需特别注意的几个问题：1 1、固定化细胞的预培养、固定化细胞的预培养 先预培养，使固定在载体上的细胞生长繁殖，长好后，再用于发酵产酶，先预培养，使固定在载体上的细胞生长繁殖，长好后，再用于发酵产酶，其培养基和工艺条件可以相同或不同。其培养基和工艺条件可以相同
58、或不同。2 2、溶解氧的供给、溶解氧的供给 由于受到载体的影响，使氧的供给成为主要的限制性因素。由于受到载体的影响，使氧的供给成为主要的限制性因素。解决办法：解决办法：（1 1）加大通气量（强烈搅拌会破坏固定化细胞）；）加大通气量（强烈搅拌会破坏固定化细胞）；（2 2）改变固定化载体，如少用琼脂等对氧扩散不利的载体；）改变固定化载体，如少用琼脂等对氧扩散不利的载体；（3 3）过氧化氢酶与细胞共固定化，培养基加入适量的）过氧化氢酶与细胞共固定化，培养基加入适量的H H2 2O O2 2；（4 4）降低培养基的浓度，以降低培养基的粘度。降低培养基的浓度，以降低培养基的粘度。3、温度的控制、温度的控
59、制 连续发酵时，由于连续发酵时，由于D较高，反应器内温度变化较大，先预调流较高，反应器内温度变化较大，先预调流加液温度。加液温度。4、培养基成份的控制、培养基成份的控制 某些固定化载体的结构会受到某些成份的影响，如过量的磷酸某些固定化载体的结构会受到某些成份的影响，如过量的磷酸盐会破坏海澡酸钙凝胶制备的固定化细胞。盐会破坏海澡酸钙凝胶制备的固定化细胞。Section 8 固定化微生物原生质体发酵固定化微生物原生质体发酵产酶产酶原生质体是除去细胞壁后由细胞膜及胞内物质组成的微原生质体是除去细胞壁后由细胞膜及胞内物质组成的微球体。球体。由于原生质体不稳定，通过凝胶包埋法可使之稳定性提由于原生质体不稳定，通过凝胶包埋法可使之稳定性提高；高；可使原来胞内产物分泌到细胞外。可使原来胞内产物分泌到细胞外。一、固定化原生质体的特点一、固定化原生质体的特点1 1、变胞内产物为胞外产物；、变胞内产物为胞外产物；2 2、提高产酶率；、提高产酶率；3 3、稳定性较好；、稳定性较好；4 4、易于分离纯化。、易于分离纯化。二、固定化原生质体发酵产酶的工艺条件及其控制二、固定化原生质体发酵产酶的工艺条件及其控制（1 1）渗透压的控制；）渗透压的控制；（2 2）防止细胞壁的再生；）防止细胞壁的再生；（3 3）保证原生质体的浓度。）保证原生质体的浓度。
