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1、临床PCR技术1技术教育Kary B. MullisUSA, for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method 1930年提出了两种核酸DNA和RNA的概念1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构及其半保留复制模型。一、一、PCRPCR概述概述2技术教育一、PCR概述（一）PCR概念PCR （polymerase chain reaction)是一种在体外通过重复DNA合成，以扩增特定核苷酸序列的方法。特点高灵敏度高特异性体外进行快捷3技术教育PCR的概念核心技术是从水栖高温菌中分离到能耐高温的Taq
2、酶，使扩增反应不需要每一个循环加一次DNA聚合酶，从而实现了自动化。应用领域迅速扩大，PCR技术成为了分子生物学中的一项突破性技术。4技术教育PCR概述2000至2013年发表论文1280748篇5技术教育一、PCR概述（二）原理双链DNA 变性 退火 链延伸 （膜板） （双链分成单链） （膜板与引物杂交） （DNA合成）不断重复6技术教育二、实验步骤（一）核酸提取1.DNA提取100ul浓缩液100ul血清吹打混匀12000g离心5min弃上清20ul提取液100煮10min模板7技术教育二、实验步骤2.RNA提取10ulA液200ulB液震荡混匀8000g离心1min200ulDEPC乙醇
3、65干燥10minRNA模板8000g离心1min逆转录为cDNA弃上清重复洗2次50ul血清8技术教育3、细胞或组织剧烈震荡400ul试剂1加入400ul试剂2震荡混匀12000g离心5min完全弃上清加入试剂3模板加样扩增杂交显色9技术教育（二）扩增HBV引物(168bp)：上游：5-GAAGTGTGACGTTGACATCC下游：5-ACAGAGTACTTGCGCTCAGG扩增体系扩增体系：（50l体系） 10*Buffer -5l dNTP -1l MgCl2 -3l Primer F -2l Primer R -2l DNA -2l Taq酶 -1l H2O -34l10技术教育反应程
4、序反应程序预变性 94C 3min循环延伸 72C 5min。注：每组实验阴性对照用无菌生理盐水代替模板58 C45 s45 s72 C45 s45 s94 C45 s30循环11技术教育（三）结果判读12技术教育（四）PCR的常见问题及处理措施常见问题污染：污染：表现为阴性对照同样出现目的表现为阴性对照同样出现目的条带或条带或阴性对照出现阴性对照出现S形曲线。形曲线。污染的来源：污染的来源：来自其他测试样品的来自其他测试样品的DNA来来自自试试验验材材料料如如重重组组克克隆隆的的DNA外外源源DNA污染污染来自同一靶序列前一次来自同一靶序列前一次PCR的扩增的扩增产物。产物。 13技术教育（
5、三）PCR的常见问题及处理措施如何减少污染实验室分区实验室分区14技术教育酶法控制酶法控制尿嘧啶尿嘧啶DNA糖基化酶（糖基化酶（UNG)短短于于100bp的的PCR产产物物不不能能用用UNG完完全全消消除除污污染。染。紫外线表面照射紫外线表面照射消除试剂、加样头中的消除试剂、加样头中的DNA污染。污染。对短对短PCR产物效果不好产物效果不好以预防污染为主以预防污染为主良好的实验室操作良好的实验室操作15技术教育三、荧光定量三、荧光定量PCR16技术教育（一）荧光（一）荧光PCR定量的概念定量的概念 以外参已知数量拷贝数的标准品为标准，通过扩增及对荧光值的监测，对PCR起始模板量的定量。17技术
6、教育（二）荧光定量（二）荧光定量PCR原理原理染料染色染料染色SYBR Green I溴乙锭(Ethidium Bromide)探针标记探针标记TaqManTM 分子信标(Molecular beacons)18技术教育TaqManTaqMan探针reverse primerRQforward primer33553551. PolymerisationprobeRQ33553552. Strand displacementQ33553553. CleavageR3553554. Polymerisation completedQRR = ReporterQ = Quencher319技术教育
7、（三）定量（三）定量PCRPCR的数学原理的数学原理PCR 理理 论论 方方 程程N = N0 x (1+E)nN:扩增数量扩增数量N0:起始模板数量起始模板数量E：扩增效率扩增效率n:循环数循环数 20技术教育指数期指数期PCRPCR定量方程才有效定量方程才有效Log DNALog DNA循环数循环数线性增长期Linear平台期Plateauy = x(1+e)n指数增长期指数增长期GeometricGeometric21技术教育PCR曲线曲线线性图谱半对数图谱22技术教育起点定量与终点定量起点定量与终点定量起点定量起点定量终点定量终点定量“加进不同拷贝的膜板加进不同拷贝的膜板”半对数图谱线
8、性图谱23技术教育同一个样品重复96次起点定量的优势起点定量的优势终点产物数量：误差太大拐点产物数量：重现性好l起始起始DNADNA量，更具意义量，更具意义l重现性好，误差小重现性好，误差小24技术教育起点定量的关键：CT值C CT T值：荧光信号有统计学意义显著增长值：荧光信号有统计学意义显著增长( (穿过穿过 阈值线阈值线) )时的循环次数时的循环次数CT值半对数图谱CT值线性图谱25技术教育C CT T 起始起始DNADNA浓度浓度当循环次数n=CT值时：RT = RB + X0 (1+ E)CT Rs lg (RT - RB) = lg X0 + CT lg (1+ E) + lg R
9、sCT lg (1+ E) = - lg X0 + lg (RT - RB) lg Rs即即 CT = - k lg X0 + b （线性方程）线性方程）Rn = RB + X0 (1+ E)n Rs26技术教育C CT T值值 - - X X0 0 作图CTX0CT = - k logX0 + b27技术教育四、四、PCRPCR检测的临床应用检测的临床应用（一）标本采集要求（一）标本采集要求28技术教育项目项目标本采集标本采集HBVHBV无菌注射器抽取无菌注射器抽取2 2毫升静脉血或其它体液注入毫升静脉血或其它体液注入无菌试管或抗凝管。无菌试管或抗凝管。HCVHCVEBEB1.1.鼻咽拭子或
10、体液标本。鼻咽拭子或体液标本。 2.2.也可取抗凝血标本也可取抗凝血标本, ,但一般不推荐。但一般不推荐。CMVCMV1.1.尿液：中段晨尿尿液：中段晨尿20ml20ml于加盖试管。于加盖试管。2.2.其他体液标本或咽拭子。其他体液标本或咽拭子。3.3.也可取抗凝血标本也可取抗凝血标本, ,但一般不推荐。但一般不推荐。TBTB1.1.痰液：患者深部咳痰痰液：患者深部咳痰1 13ml3ml于无菌加盖试于无菌加盖试管。管。2.2.其他组织标本：留于无菌试管。其他组织标本：留于无菌试管。3.3.也可取抗凝血标本也可取抗凝血标本, ,但需分离单个核细胞检但需分离单个核细胞检测，阳性率才会高。（于发热时
11、抽取）测，阳性率才会高。（于发热时抽取）MP 咽拭子咽拭子29技术教育项目项目标本采集标本采集所需容器所需容器CTCT男性：男性： 尿道分泌物：细小棉拭子伸入尿道尿道分泌物：细小棉拭子伸入尿道约约2 24 4厘米，旋转数圈取出分泌物（应厘米，旋转数圈取出分泌物（应略带粘膜）。略带粘膜）。 前列腺液、精液。前列腺液、精液。女性：女性： 阴道分泌物：用无菌生理盐水洗去阴道分泌物：用无菌生理盐水洗去宫颈外分泌物，再用无菌棉拭子插入宫宫颈外分泌物，再用无菌棉拭子插入宫颈内，停颈内，停5 5秒后旋动棉拭子采取分泌物。秒后旋动棉拭子采取分泌物。 尿道分泌物：同上尿道分泌物：同上一次性一次性无菌带无菌带盖的
12、试盖的试管。管。NGNGUUUUTPHPVHPVHSVHSV30技术教育（二）结果分析、报告及解释1.定性PCR与定量PCR的比较2.定量PCR测定的临床意义3.定性PCR测定的临床意义4.定性和定量测定的结果报告及解释31技术教育1.定性定性PCR与定量与定量PCR的比较的比较32技术教育琼脂糖凝胶电泳33技术教育定量PCR扩增曲线图34技术教育2.定量定量PCR的临床意义的临床意义l对致病微生物核酸含量进行定量检测l弥补免疫检测的缺陷l缩短诊断的窗口期（如HBV,HIV）l对治疗过程进行药物疗效监测l用于基因表达方面的研究35技术教育某患者某患者HBV-DNAHBV-DNA的的PCRPCR
13、结结果动态图果动态图日期日期HBV-DNAHBV-DNA2004-6-39.3E+79.3E+72004-12-72.0E+62.0E+62005-4-191.8E+31.8E+32005-7-250.0E+00.0E+036技术教育3、定性测定的临床应用、定性测定的临床应用n诊断n用于筛检n耐药突变检测n病毒基因型检测GG AG GG AG AA AA37技术教育4.定性和定量测定的结果报告及解释（1）定性u阴性u阳性（2）定量(以我科参考值为例)uHBV-DNA100 IU/ml(不同项目数值不同)u大于参考值，在检测范围之内，是多少报多少。38技术教育n大于107拷贝/ml，日常生活接触强传染性。n小于105拷贝/ml，日常生活接触传染性较小n但不管HBV-DNA的浓度为多少，哪怕是低于检测下限，也均会引起输血后的感染。（3）血浆HBV-DNA浓度与传染性强弱的问题39技术教育 谢 谢40技术教育
