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1、微小微小RNARNA及其在医学中的应用及其在医学中的应用一、微小一、微小RNARNA的发现的发现 人类基因组中，蛋白质编码区只占人类基因组中，蛋白质编码区只占1-2。其它。其它98的基因组有什么功能的基因组有什么功能呢？约呢？约24为内含子序列，为内含子序列，这么冗长的内含子序列有什么生物学功能呢？这么冗长的内含子序列有什么生物学功能呢？后基因组时代的中心法则后基因组时代的中心法则RNA 加工加工 基因调节基因调节DNA 修复和重组修复和重组基基因因组组的的保保持持基基因因组组的的表表达达后基因组时代的基因调控：后基因组时代的基因调控：RNA RNA 调控调控人类基因组绝大部分人类基因组绝大部
2、分被转录成被转录成RNA非编码非编码RNA的数量是的数量是编码编码RNA的数百倍的数百倍生物体复杂性被隐藏生物体复杂性被隐藏在它们所输出的非编在它们所输出的非编码码RNA内，而非编码内，而非编码序列内。序列内。 2006年的诺贝尔生理学奖获得者：年的诺贝尔生理学奖获得者：Andrew Z. FireAndrew Z. FireAndrew Z. FireCraig C. MelloCraig C. MelloCraig C. Mello第一个被发现的第一个被发现的miRNA (lin-4)由哈佛大学的由哈佛大学的Victor Ambros 发现的（发现的（1993）第二个被发现的第二个被发现的
3、miRNA（let-7）由哈佛大学的博由哈佛大学的博士后士后Frank Slack (Ruvkun 实验室）发现的（实验室）发现的（2000)Victor Victor AmbrosAmbrosGary Ruvkun微小微小RNARNA（microRNA, miRNAmicroRNA, miRNA）的发现）的发现第一个被发现的第一个被发现的miRNA: lin-4Ruvkun G, Wightman B, Ha I. The 20 years it took to recognize the importance of tiny RNAs. Cell. 2004 Jan 23;116 (2 S
4、uppl):S93-6.Lee R, Feinbaum R, Ambros V. A short history of a short RNA. Cell. 2004 Jan 23;116 (2 Suppl):S89-92 近年来被鉴定的近年来被鉴定的miRNAs越来越多越来越多 至今超过至今超过17000 miRNAs已被发现已被发现 可以免费获得可以免费获得 http:/microrna.sanger.ac.uk/sequences/二、微小二、微小RNA的特点的特点微小微小RNA的作用特点的作用特点n n主要是在蛋白质水平调控n n端-个核苷酸高度保守，主要作用在靶mRNA的端非翻译区（
5、unstranslatedunstranslated region, UTRregion, UTR）n n分完全和不完全配对两种方式，哺乳动物主要为不完全配对结合，影响mRNA的成熟、转运、稳定性或者在直接调控翻译n n是翻译抑制还是剪切mRNA，除配对因素外，还取决于RISC中组装元件的功能，如Arg蛋白小干扰小干扰RNA（small interfering RNA; siRNA） 和微小和微小RNA的异同点的异同点相同点相同点 siRNA miRNA长度长度22nt左右左右合成的底物合成的底物由双链由双链RNA或或RNA前体形成的前体形成的Dicer酶酶是是Dicer的产物的产物 Argo
6、naute家族家族 需要需要Argonaute家族蛋白参与家族蛋白参与蛋白蛋白RISC组分组分都是都是RISC组分，其功能界限变得不清晰，组分，其功能界限变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠如二者在介导沉默机制上有重叠 作用方式作用方式在转录水平后和翻译水平起作用在转录水平后和翻译水平起作用 siRNA和和miRNA的相同点的相同点不同点不同点siRNAmiRNA机制性质机制性质外源引起，如病外源引起，如病毒感染诱导产生，毒感染诱导产生，异常情况异常情况生物体自身的正生物体自身的正常调控机制常调控机制 直接来源直接来源长链双链长链双链RNA发夹发夹miRNA前体前体分子结构分子结构双链双链
7、RNA单链单链RNA对靶对靶RNA特异性特异性 较高较高相对较低相对较低互补性互补性一般要求完全互一般要求完全互补补不完全互补，存不完全互补，存在错配现象在错配现象生物学功能生物学功能 抵抗病毒感染；抵抗病毒感染； 沉默过分表达的沉默过分表达的mRNA； 保护基因组免受保护基因组免受转座子的破坏转座子的破坏对机体生长发育，对机体生长发育，神经分化，脂类神经分化，脂类代谢，细胞增殖代谢，细胞增殖分化，肿瘤发生分化，肿瘤发生有重要作用有重要作用三、微小三、微小RNARNA的主要功能的主要功能miRNA 发育发育增殖增殖(干细胞干细胞)疾病疾病分化分化凋亡凋亡Victor R. Ambros秀丽线虫
8、秀丽线虫 C. elegans1. 1. 调控发育过程调控发育过程调控发育过程调控发育过程miR-124a局限表达于神经组织局限表达于神经组织miR-1局限表达于骨骼肌和心肌局限表达于骨骼肌和心肌青鳉青鳉斑马鱼斑马鱼小鼠小鼠果蝇果蝇miRNAmiRNA的表达具有组织特异性的表达具有组织特异性的表达具有组织特异性的表达具有组织特异性( Science 2004)3 3种种miRNAmiRNA控制造血干细胞向淋巴细胞的分化过程控制造血干细胞向淋巴细胞的分化过程2. 调控细胞分化调控细胞分化3. miRNAs与心血管疾病与心血管疾病（调控心肌前体细胞（调控心肌前体细胞的增殖）的增殖）microRNA
9、host or virus禽流感病毒禽流感病毒 Avian influenza virus疱疹病毒家族疱疹病毒家族EBV,KSHV,MHV-68,HCMV,HSV-1HBV,HCV逆转录病毒家族逆转录病毒家族HIV-1 多瘤病毒家族多瘤病毒家族SV40(Simian virus 40)腺病毒家族腺病毒家族 hAV(adenovir)4、miRNA 与病毒感染与病毒感染miRNA与肝炎病毒与肝炎病毒HCVHCVHBVHBVmiRNA基因表达基因表达信号传导信号传导肝细胞肝癌肝细胞肝癌发生、发展发生、发展诊断、治疗诊断、治疗在肝炎模型中发现的肿瘤相关在肝炎模型中发现的肿瘤相关miRNAHCVHCV
10、HBVHBVhas-miR-191Worse survival in acute myeloid leukemiap53 tumor supressor pathwayhas-miR-34has-let-7aras and c-myc geneshas-miR-133bSequamous cell carcinomahas-miR-142-5pHematopoietic specificNormal5.5.微小微小RNARNA与肿瘤的关系与肿瘤的关系微小微小RNARNA调控癌基因表达调控癌基因表达下调下调miRNA表达，促进了表达，促进了E2F1的表达的表达Western BlottingNo
11、rternBlotting有些微小有些微小RNARNA可能是致癌基因可能是致癌基因mir-1792高表高表达达增加增加mir-1719b的表达，加速了的表达，加速了c-myc诱导的淋巴瘤形成诱导的淋巴瘤形成miRNAs与肿瘤的关系与肿瘤的关系miRNA与疾病关系的研究策略哪些哪些哪些哪些miRNAmiRNA表达表达表达表达miRNAmiRNA文库筛选文库筛选文库筛选文库筛选分离分离分离分离, ,克隆克隆克隆克隆, ,测序测序测序测序miRNAmiRNA表达谱分析表达谱分析表达谱分析表达谱分析哪些基因是哪些基因是哪些基因是哪些基因是miRNAmiRNA的靶基因的靶基因的靶基因的靶基因哪些重要的哪
12、些重要的哪些重要的哪些重要的miRNAmiRNA影响到影响到影响到影响到 某种生命活动某种生命活动某种生命活动某种生命活动miRNAmiRNA在什么时候、在什么时候、在什么时候、在什么时候、在哪里表达在哪里表达在哪里表达在哪里表达功能分析功能分析功能分析功能分析治疗诊断诊断诊断诊断(一一)胃癌概述胃癌概述n n胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。n n中老年发病较多，男女比例约中老年发病较多，男女比例约2比比1n n全球肿瘤发病和癌症死亡率的第二位。全球肿瘤发病和癌症死亡率的第二位。四、微小四、微小RNARNA与胃癌的关系与胃癌的关系(二二)目前胃癌诊治的现状目前胃
13、癌诊治的现状n n早期胃癌多无症状或仅有轻微症状。当临床症状早期胃癌多无症状或仅有轻微症状。当临床症状早期胃癌多无症状或仅有轻微症状。当临床症状早期胃癌多无症状或仅有轻微症状。当临床症状明显时，病变已属晚期明显时，病变已属晚期明显时，病变已属晚期明显时，病变已属晚期。n n进展期胃癌，从症状出现到死亡，平均约进展期胃癌，从症状出现到死亡，平均约进展期胃癌，从症状出现到死亡，平均约进展期胃癌，从症状出现到死亡，平均约1 1年。胃年。胃年。胃年。胃癌癌癌癌5 5年总生存率一般在年总生存率一般在年总生存率一般在年总生存率一般在10%10%左右。左右。左右。左右。n n胃癌缺乏早期特异性的肿瘤诊断标志
14、物，现有肿胃癌缺乏早期特异性的肿瘤诊断标志物，现有肿胃癌缺乏早期特异性的肿瘤诊断标志物，现有肿胃癌缺乏早期特异性的肿瘤诊断标志物，现有肿瘤标志物如瘤标志物如瘤标志物如瘤标志物如CEACEA灵敏度仅灵敏度仅灵敏度仅灵敏度仅40%40%，使肿瘤常常发生，使肿瘤常常发生，使肿瘤常常发生，使肿瘤常常发生浸润转移浸润转移浸润转移浸润转移n n肿瘤药物化疗、放射线手段副作用大。对患者正肿瘤药物化疗、放射线手段副作用大。对患者正肿瘤药物化疗、放射线手段副作用大。对患者正肿瘤药物化疗、放射线手段副作用大。对患者正常细胞伤害较大，亟需高特异性的肿瘤药物常细胞伤害较大，亟需高特异性的肿瘤药物常细胞伤害较大，亟需高
15、特异性的肿瘤药物常细胞伤害较大，亟需高特异性的肿瘤药物胃癌组织癌旁组织胃癌组织癌旁组织总总 RNA 提取提取定量定量RT-PCRmiRNA芯片芯片细胞培养细胞培养, MGC803, SGC-7901 组织类型组织类型 细胞分化细胞分化 侵润深度侵润深度 TNM分期分期 转移转移 生长曲线生长曲线MTT 定量定量PCR检测检测 细胞周期凋亡检测细胞周期凋亡检测 靶基因分析靶基因分析(三三)技术路线技术路线 临床研究临床研究 体外实验体外实验 功能分析功能分析 反义寡核苷酸阻断反义寡核苷酸阻断miRNA的表达的表达 综合分析确定综合分析确定miRNAs可能的致癌机制可能的致癌机制(四四)胃癌组织中
16、微小胃癌组织中微小RNA的表达谱的表达谱n n 芯片分析胃癌组织中异常表芯片分析胃癌组织中异常表芯片分析胃癌组织中异常表芯片分析胃癌组织中异常表达的微小达的微小达的微小达的微小RNARNAGuo J, et al. J Gastroenterol Hepatol. 2009, 24(4): 652-657 19种差异表达的微小种差异表达的微小RNA 12 7 miR-139-5p，miR-497和和miR-768-3p首次在非肿瘤组织中发现首次在非肿瘤组织中发现miR-340*、miR-421和和miR-658首次在癌组织中发现高表达首次在癌组织中发现高表达 n n高表达的微小高表达的微小RN
17、A（miR-106a）与与胃癌胃癌分期的关系分期的关系(五五)临床病理因素分析结果临床病理因素分析结果Xiao B, Guo J, et al. Clin Chim Acta. 2009;400(1-2):97-102. miR-106a异常表达的临床意义异常表达的临床意义因素因素 病例数病例数 变化倍数变化倍数 P直径直径 5cm3068.59 258.49 0.001 5cm25 14.65 29.21分化分化 中中 237.36 15.48 0.001 低低 2259.62 299.13淋巴结转移淋巴结转移 +46 50.69 209.88 0.001 - 910.24 20.52远处转
18、移远处转移 + 9142.35 414.60 0.001 - 4624.84 107.37侵润侵润 T120.14 0.04 T2266.09 12.72 0.001 T31750.49 173.91 =0.005 T410140.69 390.79实时定量实时定量PCR 结果结果Jiang C, Guo J, et al. Journal of Gastroenterology. DOI 10.1007/S00535-009-0135-6癌组织中癌组织中mir-421的表达明显高于癌旁组织的表达明显高于癌旁组织体外实验结果体外实验结果n n合成特异性微合成特异性微小小RNA引物、引物、用未转
19、染肿瘤用未转染肿瘤细胞中的对照，细胞中的对照，比较转染后癌比较转染后癌细胞中微小细胞中微小RNA表达的变表达的变化化蒋振，郭俊明，蒋振，郭俊明，等等. 中国病理生理杂志中国病理生理杂志 2009, 25(9): 1726-1730. 下调下调miR-421miR-421表达对胃癌细胞生长的影响表达对胃癌细胞生长的影响Jiang C, Guo J, et al. Journal of Gastroenterology. DOI 10.1007/S00535-009-0135-6 miR-421靶蛋白实验结果靶蛋白实验结果n n筛选微小筛选微小RNA匹配度最高的匹配度最高的肿瘤相关靶基肿瘤相关靶基
20、因、检测靶基因、检测靶基因在蛋白质水因在蛋白质水平上的变化平上的变化Jiang C, Guo J，et al. Journal of Gastroenterology. DOI 10.1007/S00535-009-0135-6 胃癌相关微小胃癌相关微小RNA的功能研究的功能研究 肿瘤抑制基因肿瘤抑制基因Rb和和PTEN 分别受到分别受到miR-106和和miR-21的调控的调控; E2F1受到受到miR-17-92基因簇调控基因簇调控 免疫组化免疫组化 RbPTENE2F1 癌旁癌旁 癌癌Guo J, et al. J Gastroenterol Hepatol. 2009, 24(4):
21、652-657 结结 论论n n实验显示，实验显示，miR-421在胃癌中显著高表达，下调在胃癌中显著高表达，下调miR-421的表达可以抑制胃癌细胞的生长，它可的表达可以抑制胃癌细胞的生长，它可能是一个潜在的胃癌治疗靶点能是一个潜在的胃癌治疗靶点n nmiR-421发生的初期阶段中可能起重要作用发生的初期阶段中可能起重要作用,它可它可能是一个新的胃癌诊断候选标志物能是一个新的胃癌诊断候选标志物 n n通过临床病例检测，通过临床病例检测， miR-421在肿瘤病人中阳性在肿瘤病人中阳性率为率为73.33%，阳性率较高优于现在临床胃癌标，阳性率较高优于现在临床胃癌标志物志物CEA检出灵敏度（仅检出灵敏度（仅40%）
