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1、课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段一、一、PCRPCR的原理及反的原理及反应过程程1.1.生物体内生物体内DNADNA复制的条件复制的条件: :(1)(1)原料原料:_:_。(2)(2)模板模板: :解旋后的每一条解旋后的每一条_。(3)(3)酶酶: :打开打开DNADNA双双链的的_和合成和合成DNADNA单链的的_。(4)(4)引物引物: :为DNADNA聚合聚合酶酶的起始提供的起始提供_末端。末端。4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNADNA母母链解旋解旋酶酶DNADNA聚合聚合酶酶332.PCR2.PCR的概念和原理的概念和原理: :(1)(1)概念概念:PCR:PCR即多聚即多聚酶酶链
2、式反式反应, ,是一种体外是一种体外_的技的技术。它能以极少量的。它能以极少量的DNADNA为模板模板, ,在几小在几小时内复制出上百万内复制出上百万份的份的DNADNA拷拷贝。迅速迅速扩增增DNADNA片段片段(2)(2)原理原理: :DNADNA变性性: :在在_的温度范的温度范围内内,DNA,DNA的的_结构构将解体将解体, ,双双链分开分开, ,这个个过程称程称为变性。性。DNADNA复性复性: :当温度当温度缓慢降低后慢降低后, ,两条彼此分离的两条彼此分离的DNADNA链又会重新又会重新_,_,这个个过程称程称为复性。复性。DNADNA合成合成:DNA:DNA聚合聚合酶酶从引物从引
3、物_端开始延伸端开始延伸DNADNA链,DNA,DNA的合成的合成方向方向总是从子是从子链的的_端向端向_端延伸。端延伸。8080100100双螺旋双螺旋结合成双合成双链335533(3)(3)条件条件: :原料原料:_:_。模板模板: :热变性解旋后的两条性解旋后的两条_。酶酶:_:_。引物引物: :能分能分别与与_两端互两端互补配配对的两种引物的两种引物, ,为DNADNA聚合聚合酶酶提供提供33末端。末端。其他条件其他条件: :需要需要稳定的定的_和能自和能自动调节温度的温控温度的温控设备。四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸DNADNA母母链耐耐热的的DNADNA聚合聚合酶酶两条模板两条模板链
4、缓冲溶液冲溶液3.PCR3.PCR的反的反应过程程: :变性性: :当温度上升到当温度上升到_以上以上时, ,双双链DNADNA解旋解旋, ,氢键断裂断裂, ,变为 单链复性复性: :当温度下降到当温度下降到_左右左右, ,两种引物通两种引物通过_ 分分别与两条与两条单链DNADNA结合合延伸延伸: :当温度上升到当温度上升到_左右左右, ,溶液中的四种脱氧核苷酸溶液中的四种脱氧核苷酸 (A,T,G,C)(A,T,G,C)在在_的作用下的作用下, ,根据根据_ 原原则合成新的合成新的DNADNA链90905050碱基互碱基互补配配对7272DNADNA聚合聚合酶酶碱基互碱基互补配配对二、二、P
5、CRPCR的的实验操作操作1.1.实验用具用具: :(1)PCR(1)PCR仪: :该仪器能自器能自动调控控_,_,实现DNADNA的的扩增。如果没有增。如果没有PCRPCR仪, ,可用可用3 3个个_水浴水浴锅代替代替, ,操作操作时按程序在按程序在3 3个水浴个水浴锅中中来回来回转移移PCRPCR反反应的微量离心管。的微量离心管。(2)(2)微量离心管微量离心管: :总容容积为_mLmL, ,实际上是上是进行行PCRPCR反反应的的场所。所。(3)(3)微量移液器微量移液器: :用于向微量离心管中用于向微量离心管中转移移PCRPCR配方中的液体配方中的液体, ,每每吸取一种吸取一种试剂后其
6、上的一次性吸液后其上的一次性吸液枪头都必都必须更更换。温度温度恒温恒温0.50.52.2.实验步步骤: :准准备: :按照按照PCRPCR反反应需要的物需要的物质和条件和条件, ,将需要的将需要的试剂和和仪器准器准 备好好移液移液: :用用_按照配方在微量离心管中依次加入各按照配方在微量离心管中依次加入各试剂混合混合: :盖盖严离心管口的盖子离心管口的盖子, ,用手指用手指轻弹_,_,使反使反应液混液混 合均匀合均匀离心离心: :将离心管放在离心机上将离心管放在离心机上, ,离心离心约10s,10s,使反使反应液集中在液集中在 _反反应: :将离心管放入将离心管放入_中中进行反行反应微量移液器
7、微量移液器管的管的侧壁壁离心管底部离心管底部PCRPCR仪3.DNA3.DNA含量的含量的测定定: :(1)(1)原理原理: :利用利用DNADNA在在_的紫外的紫外线波段有一波段有一强强烈的吸收峰。烈的吸收峰。(2)(2)计算公式算公式: :DNADNA含量含量( (g/mLg/mL)=_)=_稀稀释倍数。倍数。260 nm260 nm5050(260 nm(260 nm的的读数数) )【思考辨析思考辨析】1.1.判断正判断正误(1)PCR(1)PCR过程中程中, ,需要解旋需要解旋酶酶打开打开氢键, ,使使DNADNA双双链解旋解旋为单链。( ( ) )【分析分析】PCRPCR的解旋过程是
8、用热变性的原理打开氢键的解旋过程是用热变性的原理打开氢键, ,未用到未用到DNADNA解旋酶。解旋酶。(2)PCR(2)PCR的引物是一段与的引物是一段与DNADNA相配相配对的的RNARNA片段。片段。( ( ) )【分析分析】PCRPCR的引物可以是的引物可以是RNARNA片段片段, ,也可以是也可以是DNADNA片段。片段。(3)(3)复性复性过程中程中,DNA,DNA母母链与新合成的子与新合成的子链形成双螺旋。形成双螺旋。( ( ) )【分析分析】复性过程是让解旋后的母链通过碱基互补配对与引物复性过程是让解旋后的母链通过碱基互补配对与引物结合。结合。(4)(4)耐耐热的的DNADNA聚
9、合聚合酶酶可以从生活在可以从生活在热泉的泉的细菌中提取。菌中提取。( )( )2.2.问题思考思考(1)PCR(1)PCR反反应过程中的温度控制程中的温度控制为什么要先高温后低温然后再适什么要先高温后低温然后再适当升温当升温? ?请分析原因。分析原因。提示：提示：PCRPCR过程中先高温解旋过程中先高温解旋, ,后低温使引物与模板结合后低温使引物与模板结合, ,然后然后再适当升温尽量达到再适当升温尽量达到TaqDNATaqDNA聚合酶的最适温度聚合酶的最适温度, ,加快反应速度。加快反应速度。(2)PCR(2)PCR过程中程中, ,经过3030次循次循环, ,一个一个DNADNA分子会分子会扩
10、增成多少个增成多少个? ?提示：提示：每循环每循环1 1次次,DNA,DNA分子数会变为原来的分子数会变为原来的2 2倍倍, ,因此经过因此经过3030次次循环循环, ,会扩增成会扩增成2 23030个个DNADNA分子。分子。一、生物体内的一、生物体内的DNADNA复制与复制与PCRPCR反反应的比的比较体内体内DNADNA复制复制PCRPCR反反应不不同同点点时期期细胞有胞有丝分裂分裂间期和减数第期和减数第一次分裂前的一次分裂前的间期期体外随体外随时进行行场所所活活细胞内胞内细胞外胞外酶酶解旋解旋酶酶、DNADNA聚合聚合酶酶耐高温的耐高温的DNADNA聚合聚合酶酶( (TaqDNATaq
11、DNA聚合聚合酶酶) )特点特点边解旋解旋边复制复制, ,半保留复制半保留复制体外迅速体外迅速扩增增是否需是否需缓冲液冲液不需不需缓冲液冲液严格配制格配制1010倍倍浓缩扩增增缓冲液冲液设备无无严格控制温度格控制温度变化的化的温控温控设备体内体内DNADNA复制复制PCRPCR反反应相相同同点点原料原料4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸(A(A、G G、C C、T)T)复制原理复制原理严格遵循碱基互格遵循碱基互补配配对原原则, ,半保留复制半保留复制模板模板以以DNADNA母母链为模板模板引物引物都需要分都需要分别与两条模板与两条模板链相相结合的两种引物合的两种引物【易错提醒易错提醒】(1)(1)
12、解旋酶的作用是使解旋酶的作用是使DNADNA两条链的氢键断开两条链的氢键断开, ,而而DNADNA聚合酶与聚合酶与DNADNA连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。(2)DNA(2)DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的33端上端上, ,需要模板需要模板; ;而而DNADNA连接酶连接的是两条连接酶连接的是两条DNADNA片段的缺口片段的缺口, ,不需要模不需要模板。板。【典例典例训练1 1】PCRPCR过程与程与细胞内的胞内的DNADNA复制复制过程相比程相比, ,主要有两主要有两点不同点不同, ,它它们是是(
13、 () )PCRPCR过程需要的引物是人工合成的程需要的引物是人工合成的单链DNADNA或或RNARNAPCRPCR过程不需要程不需要DNADNA聚合聚合酶酶PCRPCR过程中程中DNADNA的解旋不依靠解旋的解旋不依靠解旋酶酶, ,而是通而是通过对反反应温度的控温度的控制来制来实现的的PCRPCR过程中程中,DNA,DNA不需要解旋不需要解旋, ,直接以双直接以双链DNADNA为模板模板进行复制行复制A.A. B.B. C.C. D.D.【解题关键解题关键】解答本题的关键是解答本题的关键是: :明确明确PCRPCR过程需要人工合成的过程需要人工合成的引物引物, ,利用热变性的原理打开利用热变
14、性的原理打开DNADNA的双链。的双链。【解析解析】选选C C。PCRPCR过程与细胞内的过程与细胞内的DNADNA复制过程相比较复制过程相比较, ,主要有主要有两点不同两点不同:(1)PCR:(1)PCR过程需要的引物是人工合成的单链过程需要的引物是人工合成的单链DNADNA或或RNA,RNA,长度通常为长度通常为20203030个核苷酸。个核苷酸。(2)PCR(2)PCR过程中过程中,DNA,DNA解旋不依赖解解旋不依赖解旋酶旋酶, ,而是通过对反应温度的控制来实现的。而是通过对反应温度的控制来实现的。【误区警示误区警示】无论无论DNADNA是在细胞内还是在体外复制的过程都需是在细胞内还是
15、在体外复制的过程都需要解旋要解旋, ,因为只有解旋使碱基暴露因为只有解旋使碱基暴露, ,母链才能和子链配对母链才能和子链配对, ,进行进行半保留复制。但在细胞内半保留复制。但在细胞内, ,解旋通过解旋酶完成。生物体外解旋通过解旋酶完成。生物体外, ,利利用用DNADNA的热变性原理的热变性原理:80:80100100时时DNADNA的双螺旋结构将解体的双螺旋结构将解体, ,双双链分开。其结果相同链分开。其结果相同, ,但过程不同。但过程不同。二、二、PCRPCR操作操作1.PCR1.PCR解旋与复旋的原理解旋与复旋的原理: :DNADNA热变性与复性：热变性与复性：2.PCR2.PCR的反的反
16、应过程程( (如如图):):3.PCR3.PCR扩增的增的计算与算与DNADNA含量的含量的测定定: :(1)(1)理理论上上DNADNA呈指数方式呈指数方式扩增。若开始只有一个增。若开始只有一个DNADNA提供模板提供模板, ,则循循环n n次后有次后有2 2n n个个DNA;DNA;若开始有若开始有N N0 0个个DNADNA提供模板提供模板, ,则循循环n n次次后后获得的子代得的子代DNADNA数目数目为N N0 02 2n n个。个。(2)DNA(2)DNA含量的含量的测定定: :DNADNA在在260 nm260 nm的紫外的紫外线波段有一波段有一强强烈的吸收峰烈的吸收峰, ,峰峰
17、值的大小与的大小与DNADNA含量有关。可以利用含量有关。可以利用DNADNA的的这一特点一特点进行行DNADNA含量的含量的测定定, ,具体方具体方法如下法如下: :【易错提醒易错提醒】(1)PCR(1)PCR过程中无解旋酶过程中无解旋酶, ,需要升高温度才能打开需要升高温度才能打开氢键氢键, ,但此时的温度还不能破坏磷酸二酯键但此时的温度还不能破坏磷酸二酯键, ,因此因此, ,热变性后是热变性后是DNADNA单链单链, ,并未分解成单体。并未分解成单体。(2)(2)复性时只是在引物和复性时只是在引物和DNADNA单链之间形成氢键单链之间形成氢键, ,两条单链之间两条单链之间并未形成氢键并未
18、形成氢键, ,因此复性后因此复性后, ,无双链无双链DNADNA分子形成。分子形成。【典例典例训练2 2】PCR(PCR(多聚多聚酶酶链式反式反应) )技技术是一是一项在生物体外复在生物体外复制特定制特定DNADNA片段的核酸合成技片段的核酸合成技术, ,下下图表示合成表示合成过程程, ,请据据图分析分析回答回答: :(1)A(1)A过程高温使程高温使DNADNA变性解旋性解旋, ,对该过程的原理叙述程的原理叙述, ,正确的是正确的是 ( () )A.A.该过程用到耐高温的解旋程用到耐高温的解旋酶酶破坏破坏氢键B.B.该过程用到限制程用到限制酶酶破坏磷酸二破坏磷酸二酯键C.C.该过程不需要解旋
19、程不需要解旋酶酶的作用的作用D.D.该过程与人体程与人体细胞的胞的过程完全相同程完全相同(2)C(2)C过程要用到的程要用到的酶酶是是。这种种酶酶在高温下仍在高温下仍保持活性保持活性, ,因此在因此在PCRPCR扩增增时可以可以加入。加入。PCRPCR反反应除提除提供供酶酶外外, ,还需要需要满足的基本条件有足的基本条件有:_:_。(3)(3)如果把模板如果把模板DNADNA的两条的两条链用用1515N N标记, ,游离的脱氧核苷酸不做游离的脱氧核苷酸不做标记, ,控制控制“959555557272”温度循温度循环3 3次次, ,则在形成的子在形成的子代代DNADNA中含有中含有1515N N
20、标记的的DNADNA占占。(4)(4)如果模板如果模板DNADNA分子共有分子共有a a个碱基个碱基对, ,其中含有胞其中含有胞嘧啶m m个个, ,则该DNADNA复制复制1010次次, ,需要加入胸腺需要加入胸腺嘧啶脱氧核苷酸脱氧核苷酸个。个。(5)PCR(5)PCR中由碱基中由碱基错配引起的配引起的变异属于异属于。假。假设对一个一个DNADNA进行行扩增增, ,第一次循第一次循环时某一条模板某一条模板链上上发生碱基生碱基错配配, ,则扩增若干次后增若干次后检测所有所有DNADNA的的扩增片段增片段, ,与原与原DNADNA相相应片片段相同的占段相同的占。【解题关键解题关键】首先要明确首先要
21、明确DNADNA复制的特点复制的特点: :半保留复制半保留复制, ,其次掌其次掌握握DNADNA的复制是呈的复制是呈“指数指数”增长的。此外还要理解增长的。此外还要理解DNADNA复制原则复制原则: :碱基互补配对原则。碱基互补配对原则。【解析解析】(1)(1)高温所起的作用类似于解旋酶高温所起的作用类似于解旋酶, ,使双链使双链DNADNA解聚为解聚为单链。单链。(2)C(2)C过程为过程为PCRPCR技术的延伸阶段技术的延伸阶段, ,当系统温度上升至当系统温度上升至7272左右时左右时, ,溶液中的四种脱氧核苷酸在溶液中的四种脱氧核苷酸在TaqDNATaqDNA聚合酶的作用下合聚合酶的作用
22、下合成新的成新的DNADNA链。链。TaqDNATaqDNA聚合酶是耐热的聚合酶是耐热的, ,高温下不变性高温下不变性, ,所以一所以一次性加入即可。次性加入即可。PCRPCR即为体外即为体外DNADNA复制复制, ,所需条件与体内所需条件与体内DNADNA复制复制基本相同基本相同, ,都需要模板、原料、能量、酶都需要模板、原料、能量、酶, ,只不过为了便于控制只不过为了便于控制DNADNA复制过程复制过程, ,通过设置高温解旋代替了解旋酶的作用通过设置高温解旋代替了解旋酶的作用, ,省掉了省掉了解旋酶作用过程中所需能量的供应解旋酶作用过程中所需能量的供应, ,同时同时, ,加入了与模板链相结
23、加入了与模板链相结合的引物作为子链延伸的起点合的引物作为子链延伸的起点, ,省掉了切除引物的过程省掉了切除引物的过程, ,使使PCRPCR过程更简洁。过程更简洁。(3)PCR(3)PCR技术遵循半保留复制的特点。经过技术遵循半保留复制的特点。经过3 3次次循环循环, ,共产生共产生2 23 3个个DNADNA分子分子, ,其中有其中有2 2个个DNADNA分子含有分子含有1515N N标记。标记。(4)(4)在一个双链在一个双链DNADNA分子中分子中,(C+T),(C+T)占碱基总数的一半占碱基总数的一半, ,故故T T的数的数目为目为a-m,a-m,复制复制1010次次, ,相当于新增加了
24、相当于新增加了(2(21010-1)-1)个个DNADNA分子分子, ,故需故需补充补充T T的数目为的数目为(2(21010-1)(a-m)-1)(a-m)。(5)(5)基因中的碱基对改变属于基因中的碱基对改变属于基因突变。对一个基因突变。对一个DNADNA进行扩增进行扩增, ,第一次循环时某一条模板链第一次循环时某一条模板链上发生碱基错配上发生碱基错配, ,以后按正常配对方式进行扩增以后按正常配对方式进行扩增, ,错配链作模错配链作模板扩增的都是错误的板扩增的都是错误的DNADNA分子分子, ,原正常链扩增得到的原正常链扩增得到的DNADNA分子都分子都是正常的是正常的DNADNA分子分子
25、, ,故若干次后检测所有故若干次后检测所有DNADNA的扩增片段的扩增片段, ,与原与原DNADNA相应片段相同的占相应片段相同的占75%75%。答案答案: :(1)C(1)C(2)TaqDNA(2)TaqDNA聚合酶一次聚合酶一次DNADNA模板模板, ,分别与两条模板链相结合分别与两条模板链相结合的两种引物的两种引物, ,四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸, ,同时通过控制温度使同时通过控制温度使DNADNA复制在复制在体外反复进行体外反复进行(3)25%(3)25%(4)(2(4)(21010-1)(a-m)-1)(a-m)(5)(5)基因突变基因突变75%75%【变式式训练】“X X基因基因
26、”是是DNADNA分子上一个有分子上一个有遗传效效应的片段的片段, ,若若要用要用PCRPCR技技术特异性地拷特异性地拷贝“X X基因基因”, ,需在需在PCRPCR反反应中加入两种引中加入两种引物物, ,两种引物及其与模板两种引物及其与模板链的的结合位置如合位置如图1 1所示。所示。经4 4次循次循环后后产物中有物中有5 5种不同的种不同的DNADNA分子分子, ,如如图2 2所示所示, ,其中第其中第种种DNADNA分子有分子有几个几个( () )A.2A.2 B.4B.4 C.6C.6 D.8D.8【解析解析】选选D D。PCRPCR技术扩增时技术扩增时, ,由两种引物决定所扩增的片段由两种引物决定所扩增的片段的特定序列的特定序列, ,上一次循环的产物为下一次循环的模板。第一次上一次循环的产物为下一次循环的模板。第一次循环形成循环形成和和, ,第二次循环形成第二次循环形成4 4个个DNA,DNA,以此类推以此类推,4,4次循环后共形成次循环后共形成1616个个DNA,DNA,其中其中各各1 1个个,各各3 3个个,共共8 8个。个。
