肉桂地链霉菌的发酵工艺优化

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1、肉桂地链霉菌的发酵工艺优化肉桂地链霉菌的发酵工艺优化 张洁张洁 选取高产菌株选取高产菌株作为底盘细作为底盘细 胞胞底盘细胞 培培养养 形成单菌落形成单菌落 发发酵酵接接合合转转移移构建转化体系构建转化体系ST021菌株菌株对底盘细胞对底盘细胞的目标产物的目标产物进行验证进行验证ST021发酵工艺的优化种子培养基:糊精 2%，豆粕粉1.5%，葡萄糖0.5%，酵母提取物0.25%，用NaoH调PH6.7-6.8. 再加入CaCO3 0.1%发酵培养基：葡萄糖4.5%，豆粕粉4%，硫酸钠0.22%，硝酸钠0.22%，氯化锰0.033%，硫酸铝0.007%，硫酸亚铁0.01%，抗坏血酸0.00019%

2、，硫酸氢二钾0.00075%，碳酸钙0.25%， PH 6.7-6.8第一批发酵第六天测得第一批发酵第六天测得ST021的效价为：的效价为：0.32g/L第二批发酵第七天测得第二批发酵第七天测得ST021的效价为：的效价为：2.43g/LR2 = 0.998900.20.40.60.811.21.41.61.82020406080100120140莫能菌素含量莫能菌素含量含量Linear(含量)存在问题1.发酵过程中PH过高05010015020025030002468ST021发酵酵PH曲曲线PH培养1天后的种子液PH：8.05左右第一批培养6天后的发酵液PH：8.64第二批培养7天后的发酵

3、液PH：7.25计划：1.继续优化ST021的发酵工艺，使其能够达到理想的效价。2.继续做ST021的结合转移，构建其转化体系。3.设计并敲除ST021聚酮合成基因，为埃霉素基因的导入做准备。 1.ST021抗性筛选 将ST021分别划线于含有Apr、Kan、Chl、tsr菌素的高氏培养中，观察知ST021对Apr有抗性，部分对Kan有抗性。3.ST021转化体系的建立 1.与游离型质粒的结合转移 对ST021与W菌进行结合转移，将不同形态的菌落涂到含Apr和Nali的高氏培养基上，验证，然能生长。2 整合型质粒的结合转移 将ST021与整合型质粒PIB进行结合转移，长出转化子，涂到含有Apr

4、和Nali的高氏培养基上，仍能生长，待提基因组，验证整合到基因组的哪个位点上。 ST021单菌落发酵 单菌落单菌落 发酵液发酵液PH 效价效价 ST021-N18.880.653g/L ST021-N28.440.509g/L ST021-N38.820.833g/L ST021-N47.328.676g/L ST021-N58.711.052g/L ST021-N68.8410.01g/L不同浓度豆油发酵 豆油浓度豆油浓度 发酵液发酵液PH 效价效价 2%8.900.635g/L 4%8.441.729g/L 6%8.322.952g/L 补加豆油6.883.442g/LST021单菌落发酵

5、 单菌落单菌落 发酵液发酵液PH 效价效价 N-7 9.06 N-8 9.00 N-9 8.98 N-10 9.02 N-11 8.74 0.789g/LST021-Kan单菌落发酵 单菌落单菌落 发酵液发酵液PH 效价效价 Kan-2 8.94 8.5g/L Kan-3 9.040.91g/L Kan-4 9.07 0.87g/L 对之前筛选出来的高产菌株N4、N6、Kan-2重新进行发酵。 菌落菌落 效价效价 N4-3 1.11g/L N6-3 1.00g/L Kan-3 2.052g/L对N-4、N-6补加豆油发酵，第七天测发酵效价 菌落菌落 发酵液发酵液PH 效价效价 N-4加豆油 6

6、.93 2.52g/L N-6加豆油 7.21 4.38g/L结合转移 对ST021与整合型质粒进行结合转移，长出疑似转化子，用pIB的验证引物进行验证，证明PIB已经整合到ST 021的基因组上。Kan-2单菌落发酵单菌落发酵 编号编号 PH 效价效价 1 9.20 1.64g/L 2 9.07 7.05g/L 3 9.24 2.83g/L 4 9.16 9.10g/LN4单菌落发酵 编号编号 PH 效价效价 1 9.20 1.10g/L 2 8.85 16.20g/L 3 9.22 4.72g/L 4 9.16 2.12g/LN6单菌落发酵 编号编号 PH 效价效价 1 9.23 5.87

7、g/L 2 8.34 19.22g/L 3 9.21 2.67g/L 4 9.32 1.64g/LKan-2单菌落发酵单菌落发酵 编号编号 PH 效价效价 2 2 8.63 _ 3 8.96 0.676g/L 4 7.83 5.43g/L（ ? 135.71mg/25mL）N4单菌落发酵 编号编号 PH 效价效价 1 8.83 _ 2 6.65 5.71g/L 3 8.81 0.571g/L 4 8.95 0.556g/LN6单菌落发酵 编号编号 PH 效价效价 1 8.73 2.43g/L 2 8.81 3 8.83 4 8.79 ST021的敲除体系 MonB，调控基因R的敲除载体构建好，

8、进行结合转移， 并长出转化子，将转化子划线于涂有Apr和Nali的板子上进行验证。 调控基因R敲除载体构建好，进行了多次结合转移。构建调控基因MonH的敲除载体，利用重叠延伸的方法将其同源臂及Apr片段连接起来。ST021发酵(新的发酵培养基) 编号编号 PH 效价效价 1 7.35 4.28g/L 2 7.33 7.46g/L 3 7.53 3.78g/L 4 7.77 6.89g/L 5 7.65 7.12g/L 6 7.65 7.05g/L 7 7.38 3.68g/L 8 8.06 4.69g/L 9 7.44 3.90g/LST021发酵(新的发酵培养基) 编号编号 PH 效价效价

9、1 6.97 6.8g/L 2 7.94 1.8g/L 3 7.32 4.2g/L 4 7.35 4.8 g/L 5 7.05 5.81g/L 6 7.09 5.56g/L 7 7.25 5.92g/L 8 7.43 2.47g/L 9 7.17 2.36g/LST021敲除体系调控基因R（负调控基因）进入到松弛培养第五代，第四代在Apr、kan板上均能生长。调控基因R（正调控基因）进入到松弛培养第四代，挑单菌落30个于高氏培养基上。调控基因MonH （正调控基因）挑了20个转化子在Apr、Nali的高氏培养上验证。MonB进入到松弛培养第三代，挑单菌落20个于高氏培养基上生长。正在构建ST0

10、21全基因敲除的载体。ST021抗性筛选 将ST021分别划线于含有潮霉素、壮观霉素、新霉素的高氏培养中，观察ST021对这三种抗生素的抗性。外源基因簇导入到ST021菌株中 分别将含有iso-migrastatin、Rapamycin基因簇的质粒转入到ST021的菌株中，等转化子长出后，检测这两种抗生素在ST021中的效价。ST021敲除体系进展改用液体培养基对构建的敲除菌株进行松弛培养。传2-3代之后用水把培养基洗掉，将菌丝体涂在抗性培养基上进行筛选。调控基因Mon（正调控基因）出现双交换的个体，待提基因组验证（？）。在斜面培养基上，MonB与调控基因MonR、MonR均出现恢复到野生型的

11、个体，继续采用液体液体培养基对其进行传代。ST021全基因敲除同样采用-Red重组系统进行全基因敲除，在ST021的阅读框外分别选取未知功能域处长度为3211bp、3196bp作为上、下游同源臂。将Apr片段置换到上、下游同源臂之间，待酶切验证。将林春燕构建好的带有部分埃博霉素基因簇的游离型质粒Cos002、整合型质粒Cos004进行结合转移转入到ST021。目前Cos002长出转化子，待验证。将ST021原始菌株，进行单交换菌株 R分别涂在Kan浓度为100ug/ml 、120ug/ml、150ug/ml、180ug/ml、300ug/ml、500ug/ml的斜面培养基上,分别看其所对应的抗性浓度。继续对 R、 R、 H进行液体传代，每两天传代一次，然后吸取5ml菌丝体，用无菌水洗3次，涂在Apr的斜面培养基上。7天后在Apr板子上挑单菌落继续涂在含Apr的培养基上。全基因敲除 将长出来验证过的转化子进行松弛培养，在固体培养基传代第一代，液体传达第二代。其余的转化子在Apr和Nali的高氏培养基上验证。