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1、实验实验3 3 硝酸盐和光诱导对硝酸还原硝酸盐和光诱导对硝酸还原酶（酶（NRNR）活性的影响）活性的影响硝酸还原酶硝酸还原酶植植物物从从土土壤壤中中吸吸收收的的NONO3 3必必须须经经代代谢谢性性还还原原才才能能被被利利用用，因因为为细细胞胞组组分分中中的的N N均均呈呈高高度度还还原原态态，而而NONO3 3中中的的N N为为高高度度氧氧化化态态。硝硝酸酸盐盐的的还还原原由由硝硝酸酸还还原原酶酶(nitrate (nitrate reductasereductase, , NR)NR)催催化化。硝酸还原酶存在于细胞液中，为一种诱导酶。硝酸还原酶存在于细胞液中，为一种诱导酶。诱诱导导酶酶(i
2、nduced (induced enzyme):enzyme):植植物物体体本本来来不不含含有有，但但在在特特定定外外来来物质物质( (如底物如底物) )的诱导下的诱导下, ,可以产生的酶。可以产生的酶。受光促进受光促进1. 实验目的意义实验目的意义 掌握硝酸还原酶活性的测定方法掌握硝酸还原酶活性的测定方法了解硝酸还原酶的特性了解硝酸还原酶的特性硝酸还原酶（硝酸还原酶（EC.1.6.6.1，缩写，缩写NR）是硝酸盐同化中第一）是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响，物
3、吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响，因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。一，也可作为品种选育的指标之一。硝酸还原硝酸还原酶可将酶可将NO3-还原成还原成NO2- ，其反应为：，其反应为：NO3- + NADH + H+ NO2- + NAD+ + H2ONR 在在一一定定条条件件下下，NO2-的的生生成成量量与与NR的的活活性性呈呈正正相相关关，因此，可以通过因此，可以通过测定测定NO2-的生成量来代表的生成量来代表NR的活性的活性。2. 实验原理实验原理 NO2-含量测定（磺胺比色法）
4、含量测定（磺胺比色法） 在在酸酸性性溶溶液液中中，NO2-与与磺磺胺胺形形成成重重氮氮盐盐，重重氮氮盐盐再再与与-萘萘胺胺偶偶联联，形形成成紫紫红红色色的的偶偶氮氮化化合合物物。该该偶偶氮氮化化合合物物在在540nm有最大吸收峰，可以用分光光度计测定（有最大吸收峰，可以用分光光度计测定（OD540）。）。（！（！不稳定，见光容易分解，测定需迅速。不稳定，见光容易分解，测定需迅速。）当磺胺与当磺胺与-萘胺均过量时，所生成的红色深浅与萘胺均过量时，所生成的红色深浅与NO2-含量成含量成直线关系。直线关系。 NO2-含量标准曲线：含量标准曲线： NO2- (mol/ml) = 0.00260.359
5、OD540 NR活性活性(NO2- , mol/hgfw) =鲜重鲜重(g)时间时间(h) NO2- (mol/ml)稀释倍数稀释倍数离离体体法法：将将材材料料磨磨成成匀匀浆浆，经经过过滤滤或或离离心心除除去去残残渣渣，以以上上清清液液为硝酸还原酶粗酶液进行测定。为硝酸还原酶粗酶液进行测定。缺点：缺点：由于研磨中由于研磨中NADH受损失，必需外加受损失，必需外加NADH方可测定。方可测定。活活体体法法：直直接接用用鲜鲜活活组组织织进进行行测测定定。环环境境中中的的NO3-进进入入细细胞胞后后被被NR还还原原成成NO2-，并并扩扩散散到到细细胞胞外外在在溶溶液液中中积积累累，测测定溶液中定溶液中
6、NO2- 的含量即可得知的含量即可得知NR的大小。的大小。优优点点：不不破破坏坏细细胞胞原原有有的的酶酶反反应应系系统统，NADH可可由由代代谢谢反反应应不不断断生生成成，无无需需外外加加。简简便便、快快速速，不不需需要要贵贵重重仪仪器器设设备备及低温条件。及低温条件。缺点缺点: 重复性欠佳，应作一定量的重复。重复性欠佳，应作一定量的重复。硝酸还原酶活性测定硝酸还原酶活性测定3. 材料与试剂材料与试剂两种处理的小麦：两种处理的小麦：水水 (ck)， KNO3（N）A液：液：磷酸缓冲液磷酸缓冲液: 水水: DNP溶液溶液: 蔗糖溶液蔗糖溶液 5: 5: 1: 1B液：液：磷酸缓冲液磷酸缓冲液:
7、KNO3: DNP溶液溶液: 蔗糖溶液蔗糖溶液 5: 5: 1: 1 磷酸缓冲液磷酸缓冲液(pH7.5): 0.2mol/L； KNO3溶液溶液: 0.2mol/L DNP (2-4-二硝基苯酚二硝基苯酚)溶液溶液: 1mmol/L； 蔗糖溶液蔗糖溶液: 2.5mmol/L磺胺试剂磺胺试剂-萘胺试剂萘胺试剂取取样样前前一一天天，用用50mM KNO3加加到到培培养养小小麦麦的的水水中中，光光照照，以以诱诱导导硝硝酸酸还原酶还原酶产生。产生。两两种种材材料料水水(ck)，KNO3 (N)各各取取2份份新新鲜鲜叶叶片片中中段段，用用蒸蒸馏馏水水洗洗净净、擦擦干干，剪剪成成1cm小小段段，称称取取0
8、.3克克；将将4份份（ck、N）叶叶段段分分别别置置于于含含有有10ml A、B溶液的两只试管中，即溶液的两只试管中，即ckA、ckB、NA和和NB四管；四管；用用纱纱网网将将材材料料压压于于液液面面以以下下，将将试试管管放放在在真真空空干干燥燥器器中中抽抽气气30分分钟钟，放放气后摇晃直至叶段沉于溶液中气后摇晃直至叶段沉于溶液中；将试管置于将试管置于2530温箱中，温箱中，黑暗黑暗保温保温30分钟；分钟；立立即即吸吸取取1ml反反应应液液，加加入入2ml磺磺胺胺试试剂剂，摇摇匀匀，再再加加入入2ml-萘萘胺胺试试剂剂（注注意意顺顺序序），用用漩漩涡涡仪仪混混合合摇摇匀匀，25 水水浴浴（水水
9、浴浴锅锅）反反应应5分分钟钟, 取取出出后后桌桌面面静静置置10分分钟钟，随随后后5分分钟钟内内，在在540nm测测定定样样品品的的吸吸光光值值（以蒸馏水为对照）（以蒸馏水为对照）。取取A液液和和B液液1ml代代替替反反应应液液，加加入入2ml磺磺胺胺试试剂剂和和2ml-萘萘胺胺试试剂剂，作作为对照管，在为对照管，在540nm测定样品的吸光值测定样品的吸光值（以蒸馏水为对照）（以蒸馏水为对照） 。 4. 实验步骤实验步骤5. 结果与分析结果与分析处 理理 A 液液 B 液液 吸光度吸光度 NO2- NR活性活性 吸光度吸光度 NO2- NR活性活性 （uMol/ml）（uMol/hgfw） （
10、uMol/ml）（uMol/hgfw）H2OKNO3对照对照 NO2- （uMol/ml）= 0.00260.359OD540NR活性（活性（ NO2- , uMol/hgfw）= NO2- 10ml/1ml （鲜重（鲜重g0.5h）分析硝酸盐对硝酸还原酶活性的影响。分析硝酸盐对硝酸还原酶活性的影响。6. 注意事项注意事项 抽真空放气后，摇晃直至叶段沉于溶液中；抽真空放气后，摇晃直至叶段沉于溶液中； 硝酸还原过程应在黑暗中进行；硝酸还原过程应在黑暗中进行； 磺胺试剂和磺胺试剂和-萘胺试剂加入时，注意顺序；萘胺试剂加入时，注意顺序； 正确使用分光光度计；正确使用分光光度计；避免移液管使用交叉感染
11、。避免移液管使用交叉感染。1） 为何提前一天施为何提前一天施KNO3，并且取样应在晴天进行，并且取样应在晴天进行？2） NR酶活性（酶活性（ NO2- ，uMol/hgfw）= NO2- 10ml/1ml （鲜重（鲜重g0.5h） 公式中的公式中的0.5 h 指哪一个？指哪一个？7. 思考题思考题酶酶反反应应要要在在暗暗条条件件下下进进行行的的原原因因是是叶叶绿绿体体在在光光合合作作用用时时可可产产生生亚亚硝硝酸酸还还原原酶酶的的辅辅酶酶铁铁氧氧还还蛋蛋白白，与与亚亚硝硝酸酸还还原原酶酶同同时时存存在在时时可可还还原原NO2- ，所所以以在在暗暗条条件件下下进进行行反反应应可可阻阻止止NO2- 的继续反应的继续反应，以保证测定结果的准确。，以保证测定结果的准确。
