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1、 乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒cccDNAcccDNA 检测方法与应用价值检测方法与应用价值一、几个相关问题简介一、几个相关问题简介什么是什么是HBV HBV cccDNAcccDNA? ? 即即 共共 价价 闭闭 合合 环环 状状 DNADNA（ covalently covalently closed closed circular circular DNA)DNA)。乙乙肝肝病病毒毒感感染染宿宿主主细细胞胞后后在在细细胞胞内内复复制制并并建建立立感感染染状状态态，病病毒毒松松弛弛环环状状DNADNA（rcDNArcDNA）进进入入细细胞胞核核，利利用用宿宿主主DNADNA聚聚合合酶酶和和拓拓
2、扑扑酶酶等等“修修复复”形形成的、结构完整的、超螺旋双链成的、结构完整的、超螺旋双链DNADNA分子。分子。乙乙型型肝肝炎炎病病毒毒基基因因组组结结构构示示意意图图乙乙型型肝肝炎炎病病毒毒的的复复制制过过程程我们为什么要关注我们为什么要关注HBV HBV cccDNAcccDNA? ? cccDNAcccDNA存存在在于于细细胞胞核核内内，成成为为乙乙肝肝病病毒毒的的复复制制“池池” 目前尚没有可以进入细胞核内，并能够清除目前尚没有可以进入细胞核内，并能够清除cccDNAcccDNA 的药物，这也是现有抗病毒药物治疗效果不佳和治的药物，这也是现有抗病毒药物治疗效果不佳和治 疗后容易复发的原因之
3、一疗后容易复发的原因之一 肝脏以外器官组织细胞可能存在肝脏以外器官组织细胞可能存在cccDNAcccDNA，成为肝脏，成为肝脏 移植术后乙肝复发的来源移植术后乙肝复发的来源 还没有稳定、可靠、敏感的还没有稳定、可靠、敏感的cccDNAcccDNA检测试剂盒问世检测试剂盒问世为什么没有为什么没有cccDNAcccDNA检测试剂盒问世检测试剂盒问世? ?研究和开发该检测技术的时间不长研究和开发该检测技术的时间不长检测技术上的难度较大检测技术上的难度较大前期研究主要集中于细胞模型和动物肝脏前期研究主要集中于细胞模型和动物肝脏 模，不能满足临床检验的需求模，不能满足临床检验的需求现有技术灵敏度不高，检
4、测低限现有技术灵敏度不高，检测低限10104 4 copycopy /ml /ml左右左右分研究机构和学者对检测技术的特异性认分研究机构和学者对检测技术的特异性认 识不足，存在缺陷识不足，存在缺陷多种同源的乙肝病毒多种同源的乙肝病毒DNADNA分子并存分子并存( (cccDNAcccDNA、 rcDNArcDNA、ssDNAssDNA、整合的、整合的HBV DNAHBV DNA），必须有），必须有 效地分离效地分离cccDNAcccDNA和其他类型的病毒和其他类型的病毒DNADNA如何进一步解决特异性的问题？如何进一步解决特异性的问题？如何解决灵敏度不高的问题（细胞内如何解决灵敏度不高的问题（
5、细胞内cccDNAcccDNA 含量的较低），血清中含量？含量的较低），血清中含量？如何简化检测步骤？如何简化检测步骤？建立建立cccDNAcccDNA检测技术必须克服的难点检测技术必须克服的难点cccDNAcccDNArcDNArcDNA核酸一级结构核酸一级结构完整的双链完整的双链两条链均不完整两条链均不完整核酸空间结构核酸空间结构闭合环状，超螺旋闭合环状，超螺旋松弛环状，非超螺旋松弛环状，非超螺旋是否与蛋白质结合是否与蛋白质结合不结合不结合共价结合共价结合对某些核酸酶抗性对某些核酸酶抗性强，不容易被降解强，不容易被降解弱，容易被降解弱，容易被降解分离分离cccDNAcccDNA和和rcDN
6、ArcDNA的分子基础的分子基础分离分离cccDNAcccDNA和和rcDNArcDNA的任何手段均基于上述差异的任何手段均基于上述差异二、二、HBV cccDNA检测技术检测技术1.1.选择性选择性PCR(PCR(普通普通PCRPCR、套式、套式PCRPCR、荧光、荧光PCR)PCR)2.2.侵入者探针法（侵入者探针法（Invader Invader assaayassaay）3.3.嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR法法现有的几种现有的几种cccDNAcccDNA检测技术简介检测技术简介现有的几种现有的几种cccDNAcccDNA检测技术简介检测技术简介选择性选择性PCR(PCR(普通普
7、通PCRPCR、套式、套式PCRPCR、荧光、荧光PCR)PCR)2.2.侵入者探针法（侵入者探针法（Invader Invader assaayassaay）3.3.嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR法法设计一对特殊引物：跨设计一对特殊引物：跨双双缺口引物缺口引物 正义引物正义引物P1 P1 ：与负链互补结合，位于正：与负链互补结合，位于正 链缺口上游链缺口上游 反义引物反义引物P2 P2 ：与正链互补结合，位于负：与正链互补结合，位于负 链缺口下游链缺口下游目的：目的：rcDNArcDNA不被扩增不被扩增1.1.选择性选择性PCRPCR选择性选择性PCR：rcDNA不被扩增不被扩增选择性
8、选择性PCRPCR：cccDNAcccDNA能被扩增能被扩增PCR产物自身退火（产物自身退火（self annealing）“选择性选择性”PCRPCR：并非万无一：并非万无一失失 rcDNArcDNA被被大大量量扩扩增增，阳阳性性结结果果不不可可靠靠，定定量量结结果果也不可靠也不可靠 HepatologyHepatology Research 2003;15: 234-243 Research 2003;15: 234-243（PBMCPBMC） World J World J GastroenterolGastroenterol 2004;10(1):82-85( 2004;10(1):8
9、2-85(血清血清) )l KockKock等：反应管中等：反应管中rcDNArcDNA含量不能超过含量不能超过10105 5copycopy HepatologyHepatology 1996;23:405-4131996;23:405-413 血血清清HBV HBV rcDNArcDNA超超过过10108 8copy/mlcopy/ml，进进行行荧荧光光PCRPCR可能会出现检测结果假阳性可能会出现检测结果假阳性“选择性选择性”PCRPCR：并非万无一：并非万无一失失 与与定定性性法法比比较较增增加加了了一一个个荧荧光光探探针针，探探针针位位于于扩扩增增片片段段区区（负负链链缺缺口口下游）
10、，与下游），与cccDNAcccDNA的负链互补。的负链互补。选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNArcDNArcDNA不能被扩增不能被扩增无荧光信号无荧光信号EcoR I5+P1 P2 3200(1)53159031820P118201590+ 3200（1）EcoR I P2cccDNAcccDNA能被扩增能被扩增检测到荧光信号检测到荧光信号选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNA实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的原理的原理实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的原理的原理实时荧光定量实时荧光定量PCRPC
11、R的原理的原理l 标准曲线方程标准曲线方程Y YCtCt= 42.0827-3.5554logX= 42.0827-3.5554logXcopycopyl 相关指数：相关指数： R R2 2=0.995=0.995l 灵敏度至少可以达到灵敏度至少可以达到10103 3copy/ml copy/ml 结果结果 ： 选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNA同样存在同样存在PCRPCR产物自身退火引起的产物自身退火引起的rcDNArcDNA 非特异性扩增的问题非特异性扩增的问题由于灵敏度较普通由于灵敏度较普通PCRPCR高，假阳性率比普高，假阳性率比普 通通P
12、CRPCR更高更高缺陷：缺陷：选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNA质粒标准品质粒标准品107copy/ml3.5108copy/ml携带者血清携带者血清质粒标准品质粒标准品105copy/ml105107copy/ml携带者血清携带者血清选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNA解决方案解决方案l 特异性抽提分离特异性抽提分离cccDNAcccDNA与其它形式的病毒与其它形式的病毒DNADNA 采用沉淀法或质粒抽提试剂盒抽提法采用沉淀法或质粒抽提试剂盒抽提法l 酶切纯化酶切纯化cccDNAcccDNA 采用绿豆核
13、酸酶或采用绿豆核酸酶或ATPATP依赖的依赖的plasmid-safe DNAplasmid-safe DNA酶酶选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNA1.1.选择性选择性PCR(PCR(普通普通PCRPCR、套式、套式PCRPCR、荧光、荧光PCR)PCR)侵入者探针法（侵入者探针法（Invader Invader assaayassaay）3.3.嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR法法现有的几种现有的几种cccDNAcccDNA检测技术简介检测技术简介2.2.侵入者探针法侵入者探针法(Invader assay)(Invader assay)两个
14、体系：两个体系： 两两 种种 特特 殊殊 的的 探探 针针 ： invader invader probeprobe和和 primary primary probeprobe，后者含与待测模板无关的，后者含与待测模板无关的55侧翼的碱基片段。侧翼的碱基片段。 荧荧 光光 共共 振振 能能 量量 转转 移移 系系 统统 ： 被被 核核 酸酸 内内 切切 酶酶 ( (cleavasecleavase, ,裂裂解解酶酶) )特特异异地地切切割割55侧侧翼翼碱碱基基片片段段作作为为第第二二个个invaderinvader，与与荧荧光光共共振振能能量量转转移移盒盒（FRETCFRETC）结结合合，裂裂解
15、解酶酶切切割割FRETCFRETC上上含含有有荧荧光光基基团团的的短短臂臂，发发出出荧荧光光信信号。号。特特点点：一一个个模模板板可可以以重重复复使使用用，每每“结结合合裂裂解解结结合合裂裂解解”一一次次为为一一个个循循环环，每每循循环环一一次次产产生生一一个个荧荧光光信信号，呈线性信号放大号，呈线性信号放大侵入者探针法侵入者探针法定量检测定量检测cccDNAcccDNA的优缺点的优缺点优点优点：线性信号放大，特异性比荧光：线性信号放大，特异性比荧光 PCRPCR法强法强缺点缺点：灵敏度低：灵敏度低：10104 4copy/mlcopy/ml1.1.选择性选择性PCR(PCR(普通普通PCRP
16、CR、套式、套式PCRPCR、荧光、荧光PCR)PCR)2.2.侵入者分析法（侵入者分析法（Invader Invader assaayassaay）嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR法法现有的几种现有的几种cccDNAcccDNA检测技术简介检测技术简介3. 嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR法法Shao, et al. J Virol Methods 2003； 112：45-52+PNN：与：与HBVDNA非同源片段非同源片段5N533p+rcDNAcccDNAPNNP253533. 嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR法法 嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR的优缺点的优缺点 优点
17、：优点：克服了荧光克服了荧光PCRPCR法的部分缺陷，灵敏法的部分缺陷，灵敏 度比侵入法提高度比侵入法提高 缺点：缺点：仍不能完全避免待测标本中存在的仍不能完全避免待测标本中存在的 rcDNArcDNA被非特异性扩增被非特异性扩增 无无论论是是选选择择性性荧荧光光PCRPCR，还还是是侵侵入入者者探探针针法法或或嵌嵌合合引引物物荧荧光光PCRPCR，本本身身都都不不能能解解决决在在高高rcDNArcDNA背背景景条条件件下下的的假假阳阳性性问问题题，必必须须结结合合抽抽提提分分离离、酶酶切切纯纯化化等等步步骤骤，以以提提高高特特异性。异性。三、影响三、影响cccDNA池的因素池的因素1.ccc
18、DNA1.cccDNA池的自身恒定池的自身恒定 cccDNAcccDNA池：感染肝细胞核内池：感染肝细胞核内HBV HBV cccDNAcccDNA的的 含量在无外来干扰的情况下保含量在无外来干扰的情况下保 持恒定持恒定(5(550copy/cell)50copy/cell) 病毒自身调节：关于病毒的进化病毒自身调节：关于病毒的进化 关于病毒的关于病毒的“思维思维” 病毒自身的调节病毒自身的调节 外来压力：打破病毒含量自身恒定的结果外来压力：打破病毒含量自身恒定的结果2.2.抗病毒药物对抗病毒药物对cccDNAcccDNA的影响的影响l现有抗病毒药物，包括干扰素和各种核苷类现有抗病毒药物，包括
19、干扰素和各种核苷类似物，可以一过性地减少似物，可以一过性地减少cccDNAcccDNA，但均不能，但均不能清除清除cccDNAcccDNAl细胞核内细胞核内cccDNAcccDNA含量的相对稳定性，决定了含量的相对稳定性，决定了长疗程抗病毒治疗的必要性长疗程抗病毒治疗的必要性3.3.肝外组织也是肝外组织也是cccDNAcccDNA的储存池？的储存池？肝外组织细胞中肝外组织细胞中HBVHBV标志的存在情况：标志的存在情况：肾、胰腺、肺、心肌、心包膜、胃肠黏肾、胰腺、肺、心肌、心包膜、胃肠黏 膜、皮肤、睾丸、前列腺、唾液腺膜、皮肤、睾丸、前列腺、唾液腺 等组织或细胞中均检测到等组织或细胞中均检测到
20、HBVHBV的标志物的标志物HBVHBV吸附？暂居？建立感染状态？吸附？暂居？建立感染状态？ 依据：从上述组织细胞中检测到依据：从上述组织细胞中检测到cccDNAcccDNA， 但必须解决检测技术问题但必须解决检测技术问题(2)(2)关于血清中是否存在关于血清中是否存在cccDNAcccDNA的问题的问题 “血清中血清中rcDNArcDNA含量越高，含量越高，cccDNAcccDNA阳性率阳性率 越高和含量越高越高和含量越高”的现象，使我们对方法的现象，使我们对方法 学提出质疑学提出质疑肝衰竭的病人在一定病期有可能大量释放肝衰竭的病人在一定病期有可能大量释放 cccDNAcccDNA入血入血细胞坏死后，细胞坏死后，cccDNAcccDNA释放入血是必然的，释放入血是必然的， 但是，裸露的核酸分子在血清中存在多少但是，裸露的核酸分子在血清中存在多少 时间？时间？
