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1、仪 器 分 析 仪 器 分 析包括物理分析法、物理化学分析法一、物理分析法二、物理化学分析法1.电化学分析（电解分析、电位分析、电导分析等）2.光学分析 （1）一般光学分析（折光、旋光分析） （2）光谱分析（可见-紫外、红外、荧光、NMR等）3.色谱分析（LC 、 GC 、 HPLC)4.高效毛细管电泳（HPCE)5.流动注射分析（FIA)4.联用技术（GC-MS 、 HP LC-MS 、GC-FTIR、 GC-FTIR-MS LC-UV、 HPCE-MS等）仪器分析的特点、应用和发展特点：灵敏、快速、高效、微量、自动化、发展快、应用广应用（任务或基本内容）： 定性分析 定量分析 结构分析发展
2、：提高准确度、提高灵敏度、提高分析速度 （相对误差降至0.010.001%、最小检出量ppm-ppb-ppt、 实现在线分析，自动化）1.光谱分析概论2.可见-紫外分光光度法3.红外分光光度法 第一讲第一讲 光谱分析概论光谱分析概论基本概念 光学分析光学分析：以电磁辐射或以物质发射的电磁辐射与物质间的相 互作用建立的仪器分析方法，统称为光学分析。分为一般光学分析（折光、旋光、浊度分析等）和光谱分析光谱分析光谱分析：以物质光谱建立的定性、定量及结构分析的方法。 光谱光谱：当物质与辐射能相互作用时，物质内部发生能级跃迁，记录由能级跃迁所产生的辐射能发射或吸收强度随波长的变化，得到的谱图称为光谱。
3、吸收光谱吸收光谱：A-（由物质对辐射能的选择性吸收而产生的光谱，又称吸收曲线） 吸收光谱法吸收光谱法：利用物质的吸收光谱建立的分析方法。紫外（可见、红外）吸收光谱：紫外（可见、红外）分光光度法：吸收光谱的表示方法 1.可见紫外吸收光谱 图1 某物质的可见紫外吸收光谱 a 末端吸收 b 吸收峰（max) c 吸收谷(min) d 肩峰(sh)吸收光谱的表示方法l2.红外吸收光谱l特点： T （ ） 倒峰 峰形复杂（原因后述）紫外、可见、红外吸收光谱的特点和区别 紫外吸收光谱紫外吸收光谱：紫外线波长短、光子能量大（6.23.1ev)、能引起分子外层价电子的跃迁（伴随振转）-电子光谱，形状简单，具有
4、不饱和结构（共轭）分子，其价电子跃迁所需能量与紫外线光子能量相当，故UV主要研究不饱和化合物、应用范围窄，表示方法不同（A波长）。 可见吸收光谱可见吸收光谱：光子能量较小（3.11.6ev）、能引起长共轭结构有机分子或有色无机物的价电子跃迁（伴随振转）-电子光谱（比色） UV-VIS-合并 红外吸收光谱红外吸收光谱：波长长、光子能量小、只能引起分子振动并伴随转动能级跃迁-振转光谱，光谱复杂、可用于研究各类化合物，应用范围广，图谱表示（T波数）。电磁辐射和电磁波谱（一）电磁辐射电磁辐射 光为电磁辐射，又称电磁波，是宇宙间的一种能量形式，以极高速度通过空间传播（-无线电波）。具有波粒二象性，即波动
5、性和粒子性。 波动性波动性： 其中 : 波数（cm-1) 例 计算=200nm =? =? 粒子性粒子性： 一个光子具有的能量 h: planck (6.62610-34 JS； 6.626 10-27 erg S) 1eV=1.602 10-12 erg = 1.602 10-19 J 由上式知，光子越短，越高，E越大 光子越长，越低，E越小 例 计算 =200nm , 一个光子具有的能量。 (二）电二）电 磁磁 波波 谱谱 电磁辐射按波长长短顺序排列得到的图谱,分为不同区域。 远紫外区：10nm200nm 紫 外 区: 200nm400nm 可 见 区：400nm760nm 近红外区：76
6、0nm2.5m 中红外区：2.5 m50 m（4000400cm-1) 远红外区：50 m1000 m 微 波 区：1000 m100cm 无线电波：100cm1000m 1m=10dm=100cm=103mm=106m=109nm=1010（三）物质对光的选择性吸收 当辐射光通过某物体时（气、液、固）。其中某些频率的光被物质选择性吸收， Io I , 即部分辐射能被转移到了物质的原子或分子上，从而使这些粒子的能级发生跃迁（基态激发态）。 物质对光产生选择性吸收必须符合： 因为不同物质，分子结构不同，跃迁时能级差不同，决定了其对光的选择性吸收。 激发态的分子（原子）不稳定（瞬间），释放能量返回
7、基态，若以发射光的形式释放能量，同样也要符合以上条件。 吸 收 光 谱 法 分子吸收光谱法分子吸收光谱法：物质分子在辐射能作用下，分子内部能级发生跃迁，产生分子吸收光谱，据此建立的分析方法。（UV、 VIS 、 IR) 原子吸收光谱法（基于被测元素基态原子在蒸气状态下对特征电磁辐射的吸收而进行元素定量分析的方法-金属元素） 核磁共振波谱法（在外磁场作用下，用10100m无线电波照射分子，可引起分子中某种核的能级跃迁，使原子核从低能级跃迁到高能级，即核磁共振，且在某些特定磁场强度处产生强弱不同的吸收信号。以吸收信号频率对信号强度作图-NMR波谱图- NMR 法）光谱分析法发展概况 光谱分析是仪器
8、分析的重要组成部分，应用最早（20年代），但涉及繁杂的数值计算，当时未能普及，直到70年代，由于计算机和化学计量学的发展，推动了光谱分析方法和仪器的发展，尤其是90年代后，新方法和现代仪器迅速发展，实现了仪器的自动化、智能化、微型化，满足了分析领域高速度、高灵敏、高选择性的需要，近年来已有各种光谱-色谱联用仪（HPLC-UV 、 GC-FTIR 等）第二讲第二讲 可见紫外分光光度法可见紫外分光光度法定义：以可见紫外吸收光谱建立的定性、定量分析方法。可见紫外区：200nm760nm方法特点：（1）灵敏度高（ppm) (2) 准确度高（相对误差0.50.2%） 适于微量组分测定 (3）应用广泛（定
9、性、定量、结构） 为四大光谱之一。 （4）操作简便、快速、实验成本低。基 本 概 念 基态基态：物质分子处于能量低且稳定的状态。 激发态激发态：物质分子接受了外来辐射能，内部能级由原来低能级跃迁到较高能级，这种具有较高能量且不稳定的状态称为激发态。 跃迁跃迁：物质分子选择性吸收一定辐射能后，由基态到达激发态的过程。 单色光单色光：单一波长的光。 复色光复色光：由不同波长的光组成的混合光。 吸收带吸收带：吸收峰（钝） 红移红移：吸收峰向长波长方向移动的现象。 紫移紫移：吸收峰向短波长方向移动的现象。基 本 概 念 生色团生色团：有机化合物分子结构中含有c=c、 C=o 、 -N=N-等基团，能在
10、可见紫外区产生吸收的基团。 助色团助色团：与生色团或饱和烃相连，能使吸收峰向长波长方向移动并带有杂原子的基团（-OH、-NH2 、CI 、Br 、I)基 本 原 理 由两个定律合并而成 Beer定律: A= KC (L固定） Lambert定律：A=KL (C固定） Lambert-Beer定律 数学表达式为： A=ECL -logT=ECL -logI/Io=ECL T=10-ECL 其中A为吸光度，C为浓度，L为吸收池厚度，T为透光率，T=I/ Io ，A= -logT ， E为吸收系数（含义） 百分吸收系数 与摩尔吸收系数的关系A=ECL E- E- 百分吸收系数（百分浓度百分吸收系数（
11、百分浓度 g/100mlg/100ml）E- E- 摩尔吸收系数（摩尔浓度摩尔吸收系数（摩尔浓度 mol/Lmol/L）则：则：A= CL (A= CL (含义）含义） A=A= CLCLE 吸收系数 含义：单位浓度、单位吸收池厚度时被测物质的吸收值含义：单位浓度、单位吸收池厚度时被测物质的吸收值在给定单色光、溶剂和温度等条件下，为物质的特性常数。在给定单色光、溶剂和温度等条件下，为物质的特性常数。吸收系数的大小，表示物质对某一波长的光的吸收能力，吸收系数的大小，表示物质对某一波长的光的吸收能力，不同物质对同一波长的光，可有不同的吸收系数。吸收系不同物质对同一波长的光，可有不同的吸收系数。吸收
12、系数越大，说明该物质吸光能力越强，灵敏度越高。所以，数越大，说明该物质吸光能力越强，灵敏度越高。所以，吸收系数为定性、定量的基本参数。吸收系数为定性、定量的基本参数。 ：一般在：一般在101010105 5 10104 4 强吸收强吸收 100-100-10104 4 中强吸收中强吸收 100 100 弱吸收弱吸收E 吸收系数的测定 吸收系数不能直接测定，需要用已知准确浓度的稀溶液测定吸收值，再按公式计算。 例：氯霉素（M=323.15).最大吸收波长为278nm,用其纯品配成0.002g/100ml的溶液，用1cm的吸收池，在278nm处测定吸收值为0.614。求百分吸收系数和摩尔吸收系数。
13、 解：Lambert-Beer定律的应用条件 1.单色光（复色光失效） 2.稀溶液 3.可见光、紫外线、红外线 4.气体、液体、透明均质固体 5.吸收值具有加合性，如溶液中有2种或2种以上组分共存且不互相影响性质，此定律仍然适用，则：A总=A1 +A2 +An 这是测定混合物的依据。吸收度的测量 1.溶剂与容器（吸收池 匹配） 要求溶剂和容器在测定波长范围内应无吸收或极弱，否则造成误差。（紫外区：石英池） 2.空白对比法测定A(可抵消干扰：池、溶剂、光反射、光散射等） 空白溶液：除不含被测组分外，和样品液配制完全相同（调节T=100% 或A=0)偏离Beer定律的因素 A=KC (AC 正比关
14、系 线性） 偏离原因偏离原因：化学因素和光学因素 化学因素：吸光物质如浓度较大可发生离解、缔合、溶剂化、络合物组成改变等现象，会导致偏离。 光学因素光学因素：本定律只适合单色光，但所用的光不一定是很纯的单色光，真正的单色光很难得到。其它的杂散光、散射光、反射光、非单色光、非平行光等均会使A变值，造成偏离。原因是物质对不同波长的光有不同E 。在实际工作中应注意： 浓度、池匹配、狭缝等透光率测量误差 工作中实测T-测量误差T(测量中的随机误差，来自暗噪音和讯号噪音。关系到测量结果的准确度） 实际工作中为提高测定的准确度（降低测量误差），可通过调节被测溶液的浓度或吸收池厚度使测定的A落在0.20.8
15、为宜，或透光率落在2070%为宜（精度高的仪器可适当放宽）紫外可见分光光度计 主要部件： 光源单色器吸收池检测器显示器 光源：可见区钨灯（卤钨灯）3502500nm 紫外区氢灯（氘灯）150400nm 单色器：将来自光源的复色光按波长长短顺序分散，取出所需要的单色光，有狭缝、准直镜及色散元件组成。常用色散元件有棱镜和光栅： （1）棱镜：玻璃棱镜可见区 石英棱镜紫外区 （2）光栅：透光光栅，反射光栅（实用） （3）准直镜：以狭缝为焦点的聚光镜 （4）狭缝：精密部件，狭缝的大小影响单色光的纯度和能量 吸收池：石英池可见紫外区（匹配） 玻璃池可见区 检测器：将接收到的光信息转变为电信息，两类 光电池
16、硅光电池可见紫外区 硒光电池可见区 光电管紫敏光电管（200625nm） 红敏光电管（6251000nm） 光电倍增管 讯号处理与显示器（电表指示、数字显示、荧光屏显示、扫描、打印）分光光度计光学性能与类型 光学性能指标（中档） 波长范围：195820nm 波长精度： 0.5nm 透光率测量范围：0150 波长重现性：重复使用同一波长单色光实际波长的变动值 0.5nm A测量范围：0.1732.00 光度准确度：以T测量值误差表示，T满量程误 差为 0.5 光度重复性：重复测定T数次，变动性 0.5 分辨率： 杂散光： 分光光度计的类型：按光路系统分为单光束、双光束、双波长、双重单色器等（国产
17、及进口） 例如： 日本岛津UV2201双光束自动记录分光光度计； 日本岛津UV300；日立556型 国产（北京）WF2 800S型定性分析方法与纯度检测 定性鉴别 1. 对比吸收光谱特征数据（样品和标准品的峰数、峰位max 、峰谷、肩峰、吸收系数） 2. 对比吸收光谱的一致性 例：醋酸可的松、醋酸氢化可的松、醋酸泼尼松，三者的最大吸收波长相同（240nm）吸收系数相同，但光谱形状有差别 3. 对比A（E）的比值 有些物质吸收峰较多，往往规定在几个峰处A（E）比值作为鉴别标准。 例如：VB12 三个峰278nm、361nm、550nm 药典规定 可在三个吸收峰处测定A,计算A的比值,如被鉴定的物
18、质max 相同,A的比值落在范围内,可认为二者结构基本相同。 三种定性方法有一定局限性，只能判断可能属于何类物质，但不能最后肯定，需和其它方法（IR、NMR、MS）配合。因为UV光谱简单信息少，在成千上万种有机物中，有时不同化合物，也有类似或雷同的光谱，所以不能做最后结论。纯 度 检 测 杂质检查 1.如一化合物在可见紫外区无明显吸收，而所含杂质有较强吸收峰，则含少量杂质即可检出 例：乙醇和环己烷中若含杂质苯，苯 max256nm，而乙醇和环己烷在此波长处无吸收，含苯量低达10ppm也能从光谱中检出。 2.如一化合物有较强吸收，可用（E）检查，如杂质在峰处无吸收或吸收很弱，则化合物 （E）降低
19、；若杂质在峰处有比化合物更强吸收， （E）增大，有吸收的杂质也会使化合物光谱变形。 杂质限量检查 药物中的杂质，药典规定限量。 例：肾上腺酮-肾上腺素 如反应不完全，肾上腺酮带入产品（杂质），影响肾上腺素疗效，故规定肾上腺酮在某一限量之下。方法：由二者的光谱知，肾上腺酮在310nm处有最大吸收，而肾上腺素在此波长处无吸收，所以，通过测定肾上腺素在310nm处A，可检测肾上腺酮的混入量。若规定A不超过0.05（已知肾上腺酮E=435），可计算杂质的混入量。如制成品配成2mg/ml的HCI液，1cm吸收池。 则：A=EC 0.05=435C C=0.1149mg/100ml 肾上腺酮%=0.114
20、9/200=0.06%定量分析方法 一、单组分样品的定量方法 测定波长测定波长：先测纯组分吸收光谱，确定最大吸收波长，在此波长下测定样品的A，再根据Beer定律计算C。（选E大、无干扰的峰位，不选末端吸收） 溶剂溶剂：许多溶剂UV有吸收，选用的溶剂应在测定波长范围无干扰，即组分的测定波长必须大于溶剂的极限波长（溶剂的极限波长参考有关资料）。 1.吸收系数法 A=ECL （ 可从有关文献查出，也可用标准品测定） 例：测定VB12 已知VB12 的水溶液在361nm处 =207 L=1cm A=0.414 则：C=A/EL=0.414/207=0.002（g/100ml） 也可将样品的A换算成样品
21、的 如将样品25.0mg用水溶成1000ml后，用1cm池，在361nm处，测A=0.507 则： 样=A/CL=0.507/0.0025=202.8 VB12 %=202.8/207=98.00% 2. 标准曲线法 建立工作曲线（或回归方程）-测定样 品-计算% 3.标准对照法 配制标准溶液和样品溶液-测A-% A标=EC标L A样=EC样L多组分样品的定量方法 一、吸收光谱不重叠（以含a，b两组分为例） 按单组分定量方法测定 二、吸收光谱部分重叠 即在 1处b无吸收，在 2处a有 吸收。可在1处按单组分法测a, 再在2处测A2a+b 根据吸收加合性： 三、吸收光谱互相重叠 1.解线性方程组
22、法 根据吸收度加和性，测 此法需要事先测定四个吸收系数，对仪器性能要求高，为经典方法，方法准确，但操作和计算繁琐，理论上可应用到多组分的 测定。 在此法基础上，有人提出新解法，即不需要E，而是用吸收比代替E,简化了测定方法，增大了方法的灵活性，确保准确度。 原理： （二组分） 假设a ,b二组分令： 若已知、，且测得 按、式可计算出 这样，用数学的方法从 中分别分离出了 从而将多组分分析成功地转化成了普通的单组分分析。 应用此法的条件： （1）测定波长的选择 组分a, b的 max可分别选作1和 2 ， （1比 2要短），应尽可能小于0.5 , 尽可能保证 足够大（至 少大于1.2). （2）
23、二组分在1和 2处应遵守Beer定律。 （3）吸收比、的测定 由Beer定律，吸光物质在特定两波长处吸收比 是一与浓度无关的常数。故在、的测定中，测定溶液无需精确配制。 、值重现性好坏是此法可行与否的关键之一。在、值测定中，只要保证两个吸收值中至少有一个落在0407，则、值重现性良好。 可采用标准曲线法，也可采用标准对比法。 2. 双波长分光光度法 如两组分吸收光谱互相重叠。欲测定其中一种组分，应消除另一组分的干扰。 例：测a 消b 在b光谱上选1和 2 （A相等） 应用此法的条件：（1）干扰组分在所选波长处A相等，即：（2）待测组分在两波长下A足够大。 3.系数倍率法 上法必须找到干扰组分的
24、等吸收点波长，但有些情况找不到，此时可采用本法。 若给定一个比例系数K, 使4.三波长分光光度法 原理：在某一吸收曲线上，如在三个波长处测A. 对于二组分混合物，则； 如b为干扰，吸收曲线上的R、 Q、 P在一条直线上， 则： 此法的关键： （1）所选择的三个波长应满足对于干扰 组分的A=0，即三个波长对应于干扰组分吸收曲线恰好在一条直线上。 （2）所选择的三个波长对应于被测组分的A足够大。 （3）通常以被测组分的 max为 2 。5.多波长直线回归法二组分混合物，在某一波长 A t=1C1+2C2 (1) A t为混合物吸收值。C1 、1 和 C2 、2 分别为组分1和组分2的浓度与摩尔吸收
25、系数。（1）式可以改写为： 因此，根据许多波长（设为n个）的数据，可按（a）式以A t/1对2/1建立直线回归方程：Y=b0+b1X (5a) 或按（b）式以A t/2对1/2建立直线回归方程： Y=b1X+b0 （5b） 则截距b0为所求C1 (或C2) , 斜率 b1 为所求的浓度C2 (或C1)。将测定数据输入计算程序后，即可直接打印出C1 (或C2)的浓度和回归方程的相关系数。 此法的优点：方法简单、用计算机处理数据、用相关系数检验结果的准确性。UV光谱在有机化合物分子结构方面的研究 UV光谱是分子中生色团和助色团及共轭结构的特征，不能完全反映分子结构。如确定分子结构，需和IR 、NM
26、R、 MS配合。 UV光谱的作用：推断分子骨架、判断发色团间共轭关系、估计共轭系中取代基种类、位置和数目。 1. 饱和烃-紫外区无吸收（超出） 2. 含孤立助色团和生色团的有机化合物-杂原子取代、孤立双键（超出）；孤立生色团如醛基、酮基（n*）275295nm。 3. 共轭烯烃-链越长，峰长移、 越大。 4. -不饱和酮、醛、酸和酯-若双键和羰基未形成共轭，约200nm有2个强峰，280nm出现R带（弱） 5. 芳香族化合物- *引起E1,E2, B带 有机化合物结构的研究 一、从吸收光谱推断官能团 1. 如在220800nm透明，可能为脂肪族饱和CH化合物、胺、腈、醇、醚、羧酸等，不含双键或
27、环状共轭体系，无醛酮或溴、碘代等基团。 2. 在210250nm有强吸收，可能含2个共轭单位。 3. 260300nm有强吸收，可能含35个共轭单位。 4. 250300nm有弱吸收，表示有羰基存在。 5. 250300nm有中强吸收，且有振动结构，有苯环。 6. 如化合物有颜色，分子中含共轭生色团一般在5个以上。 二、判断异构体应 用 示 例1 准确称取某试样7.11mg于100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀后，从中取出5.00ml于50ml量瓶中，加浓盐酸2.0ml，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。取此稀释液在0.5cm石英池中于323nm波长处测得吸收度为0.320。计算试样中该化合物的百
28、分含量（已知）应 用 示 例2 精密称取安定（M=284.8）样品14.40mg于100ml容量瓶中，用0.5%H2SO4-甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀。精密量取10.00ml上述溶液，稀释至100ml。取该溶液在284nm处，用1cm吸收池测得吸光度为0.642。已知摩尔吸光系数为12896，试求安定的及样品中安定的百分含量。应用示例3 取咖啡酸，在105干燥至恒重，精密称取10.00mg，加少量乙醇溶液，转移至200ml量瓶中，加水至刻度，取出5.00ml置于50ml量瓶中，加6mol/L HCl 4ml，加水至刻度。取此溶液于1cm石英吸收池中，在323nm处测得吸收度为0.463，已知咖啡酸，求咖啡酸的百分含量？ 谢谢 谢谢
