亚病毒感染因子课件

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1、第六章第六章 亚病毒感染因子亚病毒感染因子 Subviral agents亚病毒感染因子非细胞生物非细胞生物朊病毒朊病毒：只含：只含蛋白质蛋白质一种组分一种组分 prion 亚病毒亚病毒:Subvirus至少有至少有核酸核酸和和蛋白质蛋白质两种组分两种组分类病毒类病毒：只含具有单独侵染性的只含具有单独侵染性的RNA组分组分 viroid卫星病毒、卫星卫星病毒、卫星RNA：天生缺陷病毒天生缺陷病毒,satellitevirussatellitevirus包括卫星包括卫星RNARNA真病毒真病毒:Euvirus亚病毒感染因子疯牛病疯牛病(Mad Cow disease)亚病毒感染因子一、类病毒一、

2、类病毒viroid1922年发现，减产年发现，减产20%-70%潜伏期长，提纯和电镜观察无病毒粒子潜伏期长，提纯和电镜观察无病毒粒子瑞士学者瑞士学者T.O.Diener1971年发现马铃薯纺锤形块茎年发现马铃薯纺锤形块茎病的病原是一种只有侵染性小分子病的病原是一种只有侵染性小分子RNA而无蛋白而无蛋白质的感染因子，称为类病毒质的感染因子，称为类病毒(viroid)PSTVPSTV。类病毒经带毒叶片、种子以及媒介昆虫传播，可引起马铃薯、类病毒经带毒叶片、种子以及媒介昆虫传播，可引起马铃薯、西红柿、苹果、柑桔、椰子等多种经济植物严重病害西红柿、苹果、柑桔、椰子等多种经济植物严重病害Potatosp

3、indletuberdisease,PSTD亚病毒感染因子T.O.DienerT.O.Diener几项研究试验几项研究试验(1967-1971, 用番茄研究用番茄研究)1、超离心：2、有机溶剂处理：3、酚处理：4、核酸酶处理：5、密度梯度离心：105 000gg仅仅10%在沉淀中在沉淀中(去脂肪去脂肪)沉降系数不变沉降系数不变RNaseRNase处理，丧失活性处理，丧失活性(蛋白变性）侵染活性更高蛋白变性）侵染活性更高PSTVPSTV沉降系数沉降系数710S710S亚病毒感染因子定定 义义v类病毒类病毒是一个裸露的闭合环状是一个裸露的闭合环状RNA分子，它能感染寄主细胞并在其中分子，它能感染寄

4、主细胞并在其中进行自我复制使寄主产生病症。进行自我复制使寄主产生病症。v类病毒的分子量小，仅为最小类病毒的分子量小，仅为最小RNA病毒的十分之一，约病毒的十分之一，约10万万Da类病毒是共价闭合的单链环状类病毒是共价闭合的单链环状RNA分子，大小为分子，大小为246-399个核个核苷酸。所有的类病毒苷酸。所有的类病毒RNA没有没有mRNA活性，不编码任何蛋白活性，不编码任何蛋白亚病毒感染因子马铃薯纺锤形块茎病类病毒马铃薯纺锤形块茎病类病毒Potatospindletuberviroid(PSTV)提纯后的提纯后的PSTV在电镜下观察在电镜下观察(脲展层脲展层)：长长50nm的棒状的棒状dsRN

5、A分子，由分子，由2个互补的个互补的半体组成，一个含半体组成，一个含179个核苷酸，另一个个核苷酸，另一个含含180个核苷酸，两者间有个核苷酸，两者间有70%的碱基以的碱基以氢键方式结合，形成氢键方式结合，形成122个碱基对，整个个碱基对，整个棒状结构中有棒状结构中有27个内环，最大的螺旋含个内环，最大的螺旋含8个碱基对，最大的内环含有个碱基对，最大的内环含有12个核苷酸。个核苷酸。亚病毒感染因子PSTV的结构的结构亚病毒感染因子类病毒的分类类病毒的分类目前目前ICTV公布的类病毒有公布的类病毒有27种，分为种，分为2个科、个科、7个属：个属：1、马铃薯纺锤形块茎类病毒科、马铃薯纺锤形块茎类病

6、毒科 5属属2、 鳄梨白斑类病毒科鳄梨白斑类病毒科 2属属亚病毒感染因子类病毒病诊断和鉴定类病毒病诊断和鉴定KochspostulatesKochspostulates1 1、在病体中找不到细胞和体细胞的致病因在病体中找不到细胞和体细胞的致病因子，可机械摩擦或昆虫媒介传染子，可机械摩擦或昆虫媒介传染2、检测小分子核酸、检测小分子核酸5S7S,S7S,区别于植物的区别于植物的RNARNAPAGE PAGE 浓度浓度5%5%、10%10%、20%20% ( (一般病毒一般病毒2%2%）3、接种、接种 电泳带酚抽提液接种敏感寄主电泳带酚抽提液接种敏感寄主4、提纯、提纯亚病毒感染因子生产实际诊断的几种

7、方法生产实际诊断的几种方法1、指示植物、指示植物2、凝胶电泳、凝胶电泳 （应用广，但手续复杂）（应用广，但手续复杂）3、互补、互补DNADNA（精确，适用）（精确，适用） 分子杂交，有已知类病毒分子杂交，有已知类病毒RNARNA亚病毒感染因子类病毒的提纯类病毒的提纯 酚相酚相（去掉）（去掉）（去掉）（去掉） 样品样品 上清上清（去掉）（去掉）（去掉）（去掉） 酚相酚相（去掉）（去掉）（去掉）（去掉） 水相水相 沉淀沉淀 离心离心 水相水相 离心离心上清 沉淀上清( (去去) ) 沉淀( (类病毒类病毒) )(RNA)(RNA)乙醇乙醇( (各种各种RNA)RNA)DNaseDNaseSDSSD

8、S 酚酚LiClLiCl大分子大分子RNARNAbufferbuffer酚、酚、SDS冷乙醇冷乙醇破坏寄主破坏寄主DNA去酶蛋白去酶蛋白亚病毒感染因子类病毒致病性机理类病毒致病性机理类病毒类病毒RNARNA分子直接干扰寄主细胞的分子直接干扰寄主细胞的核酸核酸代谢代谢类病毒也能结合到前类病毒也能结合到前mRNAmRNA的识别位点上，的识别位点上，干扰干扰mRNAmRNA的加工的加工类病毒的类病毒的+RNARNA和和-RNARNA还能作为寄主基因还能作为寄主基因组组DNADNA模板的竞争者模板的竞争者，与依赖于，与依赖于DNADNA的的RNARNA聚合酶聚合酶结合，使之指导类病毒的复制，结合，使之

9、指导类病毒的复制，破坏了破坏了mRNAmRNA的合成的合成。亚病毒感染因子类病毒复制类病毒复制类病毒的遗传信息不足以编码任何复制酶类病毒的遗传信息不足以编码任何复制酶健康植物中含两种类型的健康植物中含两种类型的RNARNA合成系统：合成系统：1、依赖于、依赖于DNADNA的的RNARNA聚合酶聚合酶、 和和2、依赖于、依赖于RNARNA的的RNARNA聚合酶聚合酶v类病毒类病毒RNARNA在分子内的高度碱基配对和在分子内的高度碱基配对和G:CG:C含量，使其非常象含量，使其非常象DNADNA分子，寄主的分子，寄主的依赖于依赖于DNADNA的的RNARNA聚合酶可能以其作模板合成类病聚合酶可能以

10、其作模板合成类病毒的毒的RNARNA亚病毒感染因子类病毒复制的滚环理论：类病毒复制的滚环理论：+RNA-RNA+RNA-RNA寡聚物寡聚物 +RNARNA寡聚物寡聚物裂解成裂解成+RNARNA单位单位长度的线状分子长度的线状分子共价闭合共价闭合环状分子环状分子类病毒前体类病毒前体末端修饰末端修饰亚病毒感染因子亚病毒感染因子环状类病毒进入宿主细胞后：环状类病毒进入宿主细胞后：首先以首先以(+)链类病毒为模板转录生成多个单位长度的链类病毒为模板转录生成多个单位长度的(-)链复制链复制中间体，其中间体，其(-)(-)链复制中间体链复制中间体链复制中间体链复制中间体有两种可能的命运：有两种可能的命运：

11、先被切割，再环化：先被切割，再环化：(-)链复制中间体链复制中间体先被切割先被切割生成单位长生成单位长度的线状度的线状(-)链分子，再自我链分子，再自我环化环化，然后以环化，然后以环化(-)链为模板链为模板转录出多个单位长度的转录出多个单位长度的(+)链复制中间体，再进一步链复制中间体，再进一步修饰和修饰和连接连接，形成具有感染性的单体环化的类病毒分子；，形成具有感染性的单体环化的类病毒分子；先转录，再被切割修饰：先转录，再被切割修饰：多个单位长度的多个单位长度的(-)链复制中间体链复制中间体直接转录生成直接转录生成(+)链复制中间体的模板，然后剪接修饰。链复制中间体的模板，然后剪接修饰。v鳄

12、梨白斑类病毒鳄梨白斑类病毒ASBVd(+)链和链和(-)链复制中间体中均发现有链复制中间体中均发现有锤头样核酶结构，因此推测锤头样核酶结构，因此推测ASBVd可能是采取第一种复制途可能是采取第一种复制途径，而径，而PSTVd可能是利用第二种复制途径。可能是利用第二种复制途径。类病毒复制的滚环理论类病毒复制的滚环理论亚病毒感染因子类病毒的起源类病毒的起源推测、设想：推测、设想：1、原始生命形态、原始生命形态非生命非生命类病毒类病毒类病毒类病毒病毒病毒原始细胞原始细胞2、起源于寄主核酸、起源于寄主核酸存在于细胞核，与寄主核酸同源性高存在于细胞核，与寄主核酸同源性高3、起源于病毒核酸、起源于病毒核酸

13、缺失编码外壳蛋白的基因，缺失编码外壳蛋白的基因，RNA噬菌体核酸复制噬菌体核酸复制亚病毒感染因子类病毒病的防治类病毒病的防治1、综合防治、综合防治 避病、防侵染、培育无病种苗、避病、防侵染、培育无病种苗、 防治传播介体防治传播介体2、抗病品种、抗病品种3、药剂：、药剂：微量元素微量元素ZnSO4、H3BO3、CuSO4 等等4、弱毒株保护、弱毒株保护亚病毒感染因子二、朊病毒二、朊病毒prionprion美国动物病毒学家美国动物病毒学家Prusiner1982年研究羊的瘙年研究羊的瘙痒病痒病(Scrapie)病原（病原（核酸酶、蛋白酶、紫外线核酸酶、蛋白酶、紫外线和其它化学因子处理和其它化学因子

14、处理）时发现的一种对人有侵）时发现的一种对人有侵染性的蛋白质颗粒，称为染性的蛋白质颗粒，称为“Prion”(Protein infection的缩写的缩写)或或“Virion”，译为，译为“朊病朊病毒毒”，或，或“毒朊毒朊”。Prusiner1997年因此获诺贝尔生理和医学奖年因此获诺贝尔生理和医学奖2004年年Prusiner证明证明,将提纯的朊病毒注射到基因工将提纯的朊病毒注射到基因工程小鼠的脑中时，可以引起脑病，该项研究发表于程小鼠的脑中时，可以引起脑病，该项研究发表于2004年年7月月30日日Science。亚病毒感染因子二、朊病毒二、朊病毒prionprion人和哺乳动物人和哺乳动物

15、朊病毒病朊病毒病的潜伏期特别长一般为数月乃至数的潜伏期特别长一般为数月乃至数10年时间，病程进行缓慢，由朊病毒感染中枢神经系统所产生年时间，病程进行缓慢，由朊病毒感染中枢神经系统所产生的病理学特点为：的病理学特点为： 神经原、神经轴索、星状细胞、树枝细胞呈进行性神经原、神经轴索、星状细胞、树枝细胞呈进行性空泡化空泡化 神经胶质神经胶质增生增生； 细胞外淀粉样变性细胞外淀粉样变性蛋白沉积蛋白沉积，形成光镜下可见的病理学特征，形成光镜下可见的病理学特征 如羊搔痒病呈现羊搔痒病相关纤丝如羊搔痒病呈现羊搔痒病相关纤丝(scrapic-associated fibril，SAF)CJD则表现为淀粉样蛋白

16、斑则表现为淀粉样蛋白斑(amyloid plaque)，其实质均为传，其实质均为传染性朊病毒蛋白的团块。染性朊病毒蛋白的团块。亚病毒感染因子亚病毒感染因子朊病毒在电镜下呈杆状颗粒，直径25nm，长100-200nm(一般为125-150nm)，杆状颗粒不单独存在，总是呈丛状排列，其大小和形状不一，有的丛含有多达100个杆状颗粒。朊病毒蛋白朊病毒蛋白(PrP)是由一种分子量为是由一种分子量为33-35kD的正常的正常细胞蛋白细胞蛋白prpc发生构型转变形成的，由于它类似于发生构型转变形成的，由于它类似于羊搔痒因子，故又称为羊搔痒因子，故又称为prpsc 。朊病毒蛋白朊病毒蛋白(prion pro

17、tein, PrP)亚病毒感染因子prpsc是是prpc 的异构体，的异构体，2者的一级结构和分子量者的一级结构和分子量大小完全相同。大小完全相同。prpsc在蛋白酶解作用下切去在蛋白酶解作用下切去N端端序列，可生成序列，可生成prpsc 27-30kD。 prpsc 27-30kD是一种蛋白酶抗性蛋白是一种蛋白酶抗性蛋白(proteinase-resistant protein)，该蛋白能够聚合，该蛋白能够聚合成电镜下可见的棒状淀粉样蛋白。成电镜下可见的棒状淀粉样蛋白。正常的正常的prpc与与prpsc之间在构型上的差异主要表现之间在构型上的差异主要表现为为螺旋含量减少，螺旋含量减少，折叠的

18、含量增加。折叠的含量增加。朊病毒蛋白朊病毒蛋白(Prion protein, PrP)亚病毒感染因子朊病毒蛋白朊病毒蛋白(Prion protein, PrP)亚病毒感染因子侵染性的朊病毒的单体含有侵染性的朊病毒的单体含有3 3个或少于个或少于3 3个个prp 分分子，而杆丛聚合体可能含多到子，而杆丛聚合体可能含多到10105 5个个prpprp分子，其分子，其半感染剂量半感染剂量(ID(ID5050) )介于介于10-10010-100个杆状体。个杆状体。朊病毒的分子量为朊病毒的分子量为27-30 kDa27-30 kDa。提纯的朊病毒用。提纯的朊病毒用刚果红染色，在光学显微镜下可看到许多无

19、定形刚果红染色，在光学显微镜下可看到许多无定形结构，大小为结构，大小为1-20m1-20m。PrpPrp具两种形式具两种形式prpprpc c 和和prpprpscsc。来源于同一个基因，。来源于同一个基因，宿主染色体基因编码，人的宿主染色体基因编码，人的prpprp基因定位于基因定位于2020号号染色体的短臂上。染色体的短臂上。朊病毒蛋白朊病毒蛋白(Prion protein, PrP)亚病毒感染因子 prpc是一种细胞膜结合的糖蛋白，但通过膜内陷可进是一种细胞膜结合的糖蛋白，但通过膜内陷可进入细胞内，通常位于细胞内的入细胞内，通常位于细胞内的prpc是可溶性蛋白。是可溶性蛋白。 在神经系统

20、中的可能作用：在神经系统中的可能作用： v参与神经系统功能的维持参与神经系统功能的维持 v通过通过抗氧化抗氧化途径而保护神经系统细胞免受氧化损伤，途径而保护神经系统细胞免受氧化损伤，PrPc通过与铜原子形成复合物而发挥抗氧化活性通过与铜原子形成复合物而发挥抗氧化活性参与淋巴细胞的信号转导参与淋巴细胞的信号转导 参与核酸代谢参与核酸代谢 PrPC可能可能具有具有调整程序整程序细胞死亡的功能胞死亡的功能PrPc的生理功能的生理功能 亚病毒感染因子PrP2730是羊搔痒症致病因子证据是羊搔痒症致病因子证据1、核酸酶、蛋白酶、紫外线和其它化学、核酸酶、蛋白酶、紫外线和其它化学 因子处理因子处理2、用生

21、化方法与搔痒因子共纯化，其浓、用生化方法与搔痒因子共纯化，其浓 度与传染力在正相关度与传染力在正相关3、 PrP2730的分解动力学与传染性相同的分解动力学与传染性相同4、亲和层析纯化的、亲和层析纯化的PrP2730具有传染性具有传染性5、用中和抗体中和用中和抗体中和PrP2730其传染性消失其传染性消失亚病毒感染因子- -+ +溶于非变性洗涤剂溶于非变性洗涤剂+ +- -与特异的抗体反应与特异的抗体反应不释放不释放可从膜释放可从膜释放依赖依赖GPIGPI（糖基磷酸肌醇）附（糖基磷酸肌醇）附着细胞膜着细胞膜-(-(部分耐受部分耐受) )+ +蛋白酶消化蛋白酶消化prpprpscscprpprp

22、c c性性 状状Prp 构型变化导致蛋白质性质变化构型变化导致蛋白质性质变化v prp功能：功能： 学习和长期记忆的保持所必须学习和长期记忆的保持所必须 CJD、GSS痴呆痴呆这些功能的丧失这些功能的丧失亚病毒感染因子朊病毒蛋白的传染过程朊病毒蛋白的传染过程少量少量PrPSc与细胞与细胞PrPc结合后，以结合后，以PrPSc为模板，为模板，使使PrPc发生明显的构象改变而转变为发生明显的构象改变而转变为PrPSc；PrPSc传染扩增，最后使传染扩增，最后使PrPc全部转变成不溶性全部转变成不溶性的的PrPSc；脑组织形成淀粉样斑块直至死亡；脑组织形成淀粉样斑块直至死亡； PrPc转变成转变成P

23、rPSc后造成后造成PrPPrPc c缺失缺失缺失缺失，使得：，使得：神经细胞神经细胞SOD酶活性下降，从而对超氧化物等所造酶活性下降，从而对超氧化物等所造 成的氧化损伤的敏感性增加成的氧化损伤的敏感性增加神经细胞对高谷氨酸和高铜毒性的敏感性增加，综神经细胞对高谷氨酸和高铜毒性的敏感性增加，综合导致合导致神经细胞死亡变性神经细胞死亡变性 亚病毒感染因子PrP c分子（圆圈左侧）分子（圆圈左侧）与与PrPSc分子（圆圈右侧）分子（圆圈右侧）相互作用，并转化为后者相互作用，并转化为后者的循环过程。的循环过程。PrPSc分子通过形成长纤分子通过形成长纤维（右）的方式破坏正常维（右）的方式破坏正常的脑

24、组织（左）。的脑组织（左）。 2005/4/22cell 传染过程传染过程PrPcPrPsc亚病毒感染因子朊病毒蛋白质的构象转变假说朊病毒蛋白质的构象转变假说1、“种子种子”模型模型 2、重折叠模式、重折叠模式 1、“种子种子”模型模型 prpsc 充当充当“种子种子”, prpc单体构象比单体构象比prpsc更稳定更稳定在没有在没有“种子种子”存在存在时，固有的，固有的PrPC和极少量和极少量PrPsc单体之体之间发生快速的可逆性构象生快速的可逆性构象变化。化。当当条件适宜条件适宜时，PrPsc分子之分子之间可互可互补缔合而合而变得得稳定。从定。从而使平衡式向而使平衡式向PrPsc方向反方向

25、反应，直至形成一，直至形成一稳定的定的“种子种子”。这个个“种子种子”可通可通过互相粘着而互相粘着而继续生生长，最后碎裂成小的感，最后碎裂成小的感染染单位。位。此模式能解此模式能解释经脑内潜育后才内潜育后才发病的病的朊病毒疾病。已有科学病毒疾病。已有科学实验支持支持。2、重折叠模式、重折叠模式 模板介导的转换过程模板介导的转换过程依靠催化依靠催化PrPc或一个不或一个不稳定的中定的中间体的重排来提高体的重排来提高转换，以，以形成更形成更稳定的定的PrPsc构象构象。能解能解释由于点突由于点突变而引起的而引起的遗传性性朊病毒病。点突病毒病。点突变的的发生生增加了不增加了不稳定的中定的中间分子的数

26、量，同分子的数量，同时加快它加快它转换成成PrPsc的速率。的速率。但此模型但此模型还无科学无科学实验支持。支持。亚病毒感染因子朊病毒研究进展朊病毒研究进展科学家首次观察到朊病毒入侵脑细胞的活动科学家首次观察到朊病毒入侵脑细胞的活动 将标记后的prpsc加入到培养的神经细胞中观察并用共焦显微镜照相利用激光来扫描荧光样品，并获得清晰的三维图像。绘制1000多张不同的图像并将获得的照片作成录像，显示出了prpsc进入细胞、沿着窄小的神经突前进并最终进入最接近的邻居细胞的过程 2005/5/25 Journal of Neuroscience 朊病毒传染性与蛋白分子大小有关：朊病毒传染性与蛋白分子大

27、小有关： prpc以单分子状态存在，对机体没有任何危害。但变异prpsc会多个分子聚集在一起（14至28个蛋白分子），然后扭曲变形。变异的朊病毒颗粒，会吸引单分子状态存在的prpc并将其“同化”，最终使动物脑组织海绵化，产生许多孔洞。（2005/9/8 Nature）亚病毒感染因子朊病毒研究进展朊病毒研究进展 淋巴结是传播朊病毒的关键淋巴结是传播朊病毒的关键 淋巴结是传播少量朊病毒到神经系统的关键所在； 不能排除：淋巴结和朊病毒在身体内向其它非神经组织传播有关。 2007/9/25 BMC Veterinary Research致死型朊病毒传播中的关键蛋白被发现致死型朊病毒传播中的关键蛋白被发

28、现 有一种蛋白可能是朊病毒中关键蛋白，裂解感染性蛋白生成“种子”片段，然后侵袭脑组织致宿主迅速死亡。传播过程中还存在另一关键步骤朊病毒复合物的裂解片段的存在。朊病毒复制需要有热休克蛋白热休克蛋白(Hsp104)参与 ，可能具有这种蛋白“粉碎机”的功能。 （2007 PLoS Biology）亚病毒感染因子朊病毒研究进展朊病毒研究进展找到疯牛病致病新病毒找到疯牛病致病新病毒 欧洲分子生物学组织杂志欧洲分子生物学组织杂志 2007，10除了已知的被称为除了已知的被称为PrP的朊病毒蛋白外，新发现了另一种被称的朊病毒蛋白外，新发现了另一种被称为为沙杜沙杜（Shadoo）的朊病毒蛋白。）的朊病毒蛋白。

29、 “像疯牛病这样的朊病毒疾病，我们在许多方面都尚未搞清。像疯牛病这样的朊病毒疾病，我们在许多方面都尚未搞清。比如正常的朊病毒蛋白有哪些功能，朊病毒如何在动物之间比如正常的朊病毒蛋白有哪些功能，朊病毒如何在动物之间进行传播，以及如何导致脑细胞死亡等。希望新的沙杜朊病进行传播，以及如何导致脑细胞死亡等。希望新的沙杜朊病毒的发现，会在这些重要问题上给我们新的启迪。毒的发现，会在这些重要问题上给我们新的启迪。” 亚病毒感染因子朊病毒研究展望朊病毒研究展望已经从已经从结构水平上构水平上认识朊病毒病毒： PrPC的的结构、折叠构、折叠动力学和可能力学和可能转变成成PrPsc的折叠途的折叠途径。蛋白径。蛋白

30、酶消化敏感性消化敏感性实验和和脑组织杂交分析交分析证明明PrPsc可采取不同的构象可采取不同的构象。已已经知道知道朊病毒有不同的株型且相互病毒有不同的株型且相互杂交。交。朊病毒病毒传播和致病的必需区域已被限定播和致病的必需区域已被限定为两个不同片两个不同片段，共同区域只包含段，共同区域只包含106个残基个残基。随着随着X-射射线衍射技衍射技术、核磁共振光、核磁共振光谱等技等技术应用，用，朊病毒病毒结构的研究即将取得成功，其构的研究即将取得成功，其功能学功能学功能学功能学的研的研究已成究已成为科研的工作重点。科研的工作重点。亚病毒感染因子疯牛病疯牛病(Mad cow disease)亚病毒感染因

31、子疯牛病疯牛病(Mad cow disease)(Mad cow disease)牛海绵状脑病 BSEBSE(Bovine Spongiform EncephalopathyBovine Spongiform Encephalopathy)一、来源与分布一、来源与分布19851985年英国农场牛群比利时、法国、德国、意大利、加拿大、日本等二、易感动物：二、易感动物：小白鼠、羊、猪、猫、羚羊、金丝猴、猕猴等，但不感染仓鼠三、传播途径：三、传播途径：垂直传播、被污染的饲料经口腔传染。常见的传染源：骨、肌肉、肉骨粉、脏器、淋巴结、唾液、血液等亚病毒感染因子四、病原四、病原1986分离到分离到“痒病相

32、关原纤维痒病相关原纤维”(Scrapie-associated Fibrils,SAF)，经氨基酸分析确认与，经氨基酸分析确认与“锯形蛋白锯形蛋白Prp-Scrapie, PrPsc”有有98%同源性同源性1987，用，用BSE患牛脑组织匀浆接种小白鼠，症状相似患牛脑组织匀浆接种小白鼠，症状相似分布于分布于中枢神经系统中枢神经系统，其次存在于脾、淋巴结，肠、，其次存在于脾、淋巴结，肠、唾液腺中浓度高，唾液腺中浓度高，肌肉和血液中较低，肌肉和血液中较低，粪便、尿液中粪便、尿液中很少很少对高强度理化灭活处理有很强抵抗力，经核辐射仍可对高强度理化灭活处理有很强抵抗力，经核辐射仍可存活，普通烹调温度、

33、消毒、冷冻和干燥均无灭活作存活，普通烹调温度、消毒、冷冻和干燥均无灭活作用，对强酸强碱抵抗力强，对福尔马林、紫外线不敏用，对强酸强碱抵抗力强，对福尔马林、紫外线不敏感，感，121耐耐30min，用，用2-5%次氯酸钠处理次氯酸钠处理24h才灭才灭活活疯牛病疯牛病( (Mad Cow Disease) )亚病毒感染因子疯牛病疯牛病(Mad cow disease)五、临床症状五、临床症状1、行为变化：、行为变化：恐惧、神经质、狂暴、具攻击性恐惧、神经质、狂暴、具攻击性2、姿势和运动异常：、姿势和运动异常：后躯运动失调、站立困难、后躯运动失调、站立困难、头部和肩部肌肉震颤抽搐、倒地不起头部和肩部肌

34、肉震颤抽搐、倒地不起3、感觉变化：、感觉变化：对声音、气味和触摸过敏对声音、气味和触摸过敏离群、不安、体温偏高、体质下降、产奶量离群、不安、体温偏高、体质下降、产奶量减少、呼吸频率高、震颤、倒地不起、死亡减少、呼吸频率高、震颤、倒地不起、死亡 发病几个星期发病几个星期12个月个月 潜伏期潜伏期28年（年（4-5） 牛：牛：22个月个月17岁（岁（3-5年）年）亚病毒感染因子疯牛病疯牛病(Mad cow disease)六、病理变化六、病理变化1、脑灰质呈空泡变性、脑灰质呈空泡变性2、神经元消失、神经元消失3、原胶质细胞肥大、原胶质细胞肥大七、英国疯牛病风波七、英国疯牛病风波1985年首次发现，

35、年首次发现，1996/3/20（新型克（新型克-雅氏病）直接经雅氏病）直接经济损失济损失450亿美元，补偿农民亿美元，补偿农民120-180亿，社会问题亿，社会问题（牛只存栏数（牛只存栏数1180万头，从业万头，从业20万人，总产值万人，总产值60亿亿美元）、对英国政治、外交等影响大美元）、对英国政治、外交等影响大八、我国检疫政策八、我国检疫政策牛只存栏数牛只存栏数1.5亿头，年产牛肉亿头，年产牛肉600多万吨，牛奶多万吨，牛奶700多多万吨万吨 如如扑杀扑杀 1500亿元直接损失亿元直接损失亚病毒感染因子朊病毒消毒方法和朊病毒病的防治朊病毒消毒方法和朊病毒病的防治病原因子病原因子136高压蒸

36、汽消毒高压蒸汽消毒1h 12mol/L NaOH 处理处理1h以上以上5 mol/L以上的以上的NaClO溶液消毒溶液消毒2h960ml/L的乙酸溶液浸泡的乙酸溶液浸泡1h以上以上 （固定组织的甲醛（固定组织的甲醛100ml/L对对病料消毒不彻底病料消毒不彻底）焚烧病畜及产品焚烧病畜及产品培养抗病家畜培养抗病家畜 蛋白质构象变化的机理蛋白质构象变化的机理亚病毒感染因子人的朊病毒病可分为人的朊病毒病可分为传染型、遗传型传染型、遗传型和和散发型散发型三种形式三种形式传染型传染型朊病毒在朊病毒在人群中水平传播人群中水平传播KuruKuru病病: :主要局限于巴布亚新几内亚的主要局限于巴布亚新几内亚的

37、ForeFore族人群，传族人群，传播途径与食人肉习俗有关播途径与食人肉习俗有关, ,症状与羊搔痒病相似症状与羊搔痒病相似医原性医原性CJD:CJD:通过接受通过接受CJDCJD患者捐献的器官或静脉注射污患者捐献的器官或静脉注射污染有朊病毒的人生长激素传播染有朊病毒的人生长激素传播遗传型遗传型家族性家族性CJDCJD、FFIFFI和和GSSGSS，由，由生殖细胞突变生殖细胞突变形成形成散发型散发型大多数大多数CJDCJD和部分和部分GSSGSS，其致病机制可能与，其致病机制可能与体细体细胞突变胞突变或或PrPPrP的的自发性构型改变自发性构型改变有关有关除此之外，在英国和法国还发现一种变异型除

38、此之外，在英国和法国还发现一种变异型CJDCJD，可能是由，可能是由牛朊病毒传染给人所引起的牛朊病毒传染给人所引起的人类朊病毒病人类朊病毒病亚病毒感染因子人类朊病毒病人类朊病毒病1 1、库鲁病（、库鲁病（kuru)/kuru)/震颤病震颤病2 2、克雅氏病（克雅氏病（CJD)CJD)3 3、格斯综合症（格斯综合症（GSS)GSS)4 4、新型克雅氏病（新型克雅氏病（vCJD)vCJD)5 5、传染性病毒痴呆病（早老性痴呆病）、传染性病毒痴呆病（早老性痴呆病） ( (PresenileDementia) )6 6、致死性家族失眠病、致死性家族失眠病 ( (FatalFamilialInsomni

39、a,FFI) )亚病毒感染因子库鲁病（库鲁病（kuru)kuru)亚急性传染性海绵状脑病亚急性传染性海绵状脑病小脑共济失调、震颤小脑共济失调、震颤丧失运动能力，丧失运动能力，伴有构音障碍，患者伴有构音障碍，患者100%死亡。死亡。潜伏期潜伏期430年年新几内亚东高原新几内亚东高原ForeFore人陋习人陋习吃尸脑吃尸脑流行区有流行区有3万多人万多人/1000英里英里2发病成年女发病成年女:男男5 : 1 男男 : 女女 23 : 1高原温度（水沸点）高原温度（水沸点） 95 亚病毒感染因子克雅氏病克雅氏病（CJD)CJD)全球分布，我国有发生全球分布，我国有发生(潜伏期可长达潜伏期可长达30年

40、年)感冒样症状感冒样症状精神异常，痴呆、小脑共济精神异常，痴呆、小脑共济失调、昏迷伴有肺部感染死亡失调、昏迷伴有肺部感染死亡病程病程 ：数月：数月1年（平均年（平均5个月）个月）散发型散发型90%、遗传型、遗传型10%医源型少医源型少：污染的医疗器械、组织移植、注：污染的医疗器械、组织移植、注射脑垂体源激素（生长素、促性腺素等）射脑垂体源激素（生长素、促性腺素等） 100%死亡死亡亚病毒感染因子新型克雅氏病新型克雅氏病（vCJD)207例CJD中中10人有明显不同人有明显不同临床：临床：忧虑、抑郁、进行性神经异常忧虑、抑郁、进行性神经异常小脑小脑 综合症，健忘、痴呆肌综合症，健忘、痴呆肌阵挛或

41、舞蹈病阵挛或舞蹈病 无无CJD脑电图异常脑电图异常 病理：病理：海绵状脑海绵状脑与与BSE的关系：的关系：亚病毒感染因子用于诊断朊病毒病的技术用于诊断朊病毒病的技术亚病毒感染因子CJD - human Kuru - human BSE - (cow) Scrapie - (sheep) 亚病毒感染因子三、卫星病毒三、卫星病毒satellitessatellites在植物病毒中，有些病毒含有两种相关的病毒颗粒在植物病毒中，有些病毒含有两种相关的病毒颗粒: 一种是较大的病毒颗粒，另一种是较小的病毒颗粒一种是较大的病毒颗粒，另一种是较小的病毒颗粒 这两种病毒颗粒之间的这两种病毒颗粒之间的抗原性抗原性

42、完全不同完全不同; 它们的它们的RNA核苷酸序列核苷酸序列也无同源性也无同源性; 小病毒颗粒小病毒颗粒RNA的侵染与复制必需的侵染与复制必需依赖依赖于大病于大病 毒颗粒毒颗粒 将这种小病毒颗粒称为将这种小病毒颗粒称为卫星病毒卫星病毒，大病毒颗粒称为，大病毒颗粒称为辅助病毒辅助病毒helper virus。SatelliteTobacconecrosisvirus(STNV)16.8nm/28nmSatelliteTobacconecrosisvirus(STNV)16.8nm/28nm亚病毒感染因子三、卫星病毒三、卫星病毒satellitessatellites丁型肝炎病毒HDVHBV比较不同

43、卫星病毒，发现它们都有下列性质：比较不同卫星病毒，发现它们都有下列性质：单独没有侵染性，必需依赖辅助病毒才能侵染和复单独没有侵染性，必需依赖辅助病毒才能侵染和复制（制（基因组有缺陷基因组有缺陷）非辅助病毒复制所必需，可非辅助病毒复制所必需，可抑制抑制辅助病毒的复制辅助病毒的复制卫星病毒的卫星病毒的RNA能够编码自身的能够编码自身的外壳蛋白外壳蛋白，其外壳，其外壳蛋白与辅助病毒没有血清学关系蛋白与辅助病毒没有血清学关系卫星病毒卫星病毒RNA与辅助病毒基因组与辅助病毒基因组RNA核苷酸序列核苷酸序列无无同源性同源性亚病毒感染因子四、卫星核酸四、卫星核酸1976年美年美Kaper等在等在CMV中首先

44、发现中首先发现:卫星卫星RNA是伴随病毒复制的低分子量（是伴随病毒复制的低分子量（300 400b)线状小线状小RNA，不能独立复制，不能独立复制,完全依赖于特定辅助病完全依赖于特定辅助病毒毒, 它与病毒它与病毒RNA无序列同源性。无序列同源性。CMV的卫星的卫星RNA：335个核苷酸组成，复制依赖于个核苷酸组成，复制依赖于辅助病毒，但又干扰辅助病毒辅助病毒，但又干扰辅助病毒RNA的复制，降低病的复制，降低病毒的致病能力，并改变寄主植物的症状表现。毒的致病能力，并改变寄主植物的症状表现。既是既是侵染病毒的侵染病毒的侵染病毒的侵染病毒的RNARNA，又是亚病毒之一。，又是亚病毒之一。卫星卫星RN

45、A能作为黄瓜花叶病毒病的生防因子能作为黄瓜花叶病毒病的生防因子亚病毒感染因子ICTV已将卫星核酸分为：已将卫星核酸分为：单链卫星单链卫星DNA：番茄卷叶病毒卫星：番茄卷叶病毒卫星DNA双链卫星双链卫星RNA：啤酒酵母：啤酒酵母M病毒卫星病毒卫星RNA单链卫星单链卫星RNA：CMV卫星卫星RNA等等亚病毒感染因子我国卫星核酸的研究：我国卫星核酸的研究：中科院微生物所中科院微生物所田波田波研究员，研究员，1981年从年从应用角度，将其作为生防因子，研究中应用角度，将其作为生防因子，研究中发现卫星发现卫星RNA完全符合完全符合Kochs法则，侵法则，侵染特异的寄主（病毒），且能维持自身染特异的寄主（

46、病毒），且能维持自身的遗传特性。的遗传特性。提出卫星提出卫星RNA属于亚病毒属于亚病毒亚病毒感染因子病毒卫星病毒卫星RNA致弱病毒机理致弱病毒机理一、抑制病毒及其基因组复制一、抑制病毒及其基因组复制CMV为三分体为三分体RNA基因组病毒，含：基因组病毒，含：RNA-1（3900b）RNA-2（3400b） 侵染性所必须侵染性所必须RNA-3（2193b）另含有亚基因组另含有亚基因组RNA-4(1027b)， 其卫星其卫星RNA称称RNA-5（335b） 研究单独卫星研究单独卫星RNARNA对病毒复制的影响对病毒复制的影响（1）去除卫星）去除卫星RNA的的CMV（电泳洗脱（电泳洗脱,多次单斑分离

47、，纯化）多次单斑分离，纯化）（2）表达卫星）表达卫星RNA的转基因植株的转基因植株亚病毒感染因子 卫星卫星RNA 弱弱CMV 强强CMV A492(单抗单抗ELISA检测检测) + + + 0.240.27 (31.5%) - + + 0.380.42 (49.4%) - - + 0.770.85转卫星基因和未转化（对照）的烟草和番茄幼苗接种转卫星基因和未转化（对照）的烟草和番茄幼苗接种不含卫星不含卫星RNA的的CMV后后(用病汁液定量接种藜用病汁液定量接种藜)：表达卫星表达卫星RNA的斑点数只相当于对照的的斑点数只相当于对照的8.5%23.7%卫星卫星RNA对对CMV复制的影响复制的影响亚病

48、毒感染因子烟草分别接种烟草分别接种含卫星含卫星RNA的的CMV不含卫星不含卫星RNA的的CMV用用3H尿嘧啶核苷酸标记尿嘧啶核苷酸标记 提取总提取总RNA后后 PAGE分离，分离，分别测定分别测定RNA量，结果：量，结果：接种含卫星接种含卫星RNA的的CMV处理处理卫星卫星RNA含量高含量高接种不含卫星接种不含卫星RNA的的CMV处理处理病毒病毒RNA含量稳定含量稳定卫星卫星RNA大量积累，而病毒基因组大量积累，而病毒基因组RNA复制受抑复制受抑卫星卫星RNA对病毒基因组对病毒基因组RNA的体外复制有抑制作用的体外复制有抑制作用测定卫星测定卫星RNA量与病毒量与病毒RNA量量亚病毒感染因子二、

49、抑制外壳蛋白进入叶绿体二、抑制外壳蛋白进入叶绿体病毒致病机理：病毒致病机理：1、病毒外壳蛋白、病毒外壳蛋白(CP)的致病作用的致病作用2、CMV-CP可进入完整的离体叶绿体可进入完整的离体叶绿体3、CMV-CP抑制离体叶绿体光系统抑制离体叶绿体光系统 卫星卫星RNA干扰干扰CMV-CP、番茄不孕病毒、番茄不孕病毒 (TAV) CP进入叶绿体进入叶绿体亚病毒感染因子卫星卫星RNA对其它病原物的生物学效应对其它病原物的生物学效应1、卫星、卫星RNA抑制类病毒抑制类病毒 卫星卫星RNA直接作用于直接作用于PSTVd复制过程复制过程2、卫星、卫星RNA致弱的致弱的CMV诱导植物产生对诱导植物产生对 真

50、菌病害的抗性真菌病害的抗性 黄瓜霜霉病黄瓜霜霉病 为对照发病率为对照发病率20%30%卫星卫星dsRNA诊断：温度梯度（诊断：温度梯度（3070）电泳）电泳核苷酸序列有核苷酸序列有12个核苷的突变也可在变性图谱和转变温度个核苷的突变也可在变性图谱和转变温度上反应出来上反应出来亚病毒感染因子DI颗粒、卫星病毒、卫星颗粒、卫星病毒、卫星RNA、类病毒性质的比较类病毒性质的比较性质性质DI颗粒颗粒 卫星病毒卫星病毒 卫星卫星RNA类病毒类病毒依赖辅助病毒依赖辅助病毒复制复制是是是否特异性外壳壳特异性外壳壳体化体化是是否否辅助病毒外壳辅助病毒外壳壳体化壳体化是a是是否抑制辅助病毒抑制辅助病毒复制复制是

51、是是- 与辅助病毒序与辅助病毒序列同源性列同源性是否b否c- 在体内和体外在体内和体外RNA的稳定性的稳定性低低高高a: 因缺失部位而有所不同，脊髓灰质炎病毒因缺失部位而有所不同，脊髓灰质炎病毒DI RNA能复制但不被壳体化能复制但不被壳体化b: STMV基因组的基因组的3端与辅助病毒有序列和结构的相似性端与辅助病毒有序列和结构的相似性c: 某些嵌合的卫星某些嵌合的卫星RNA与其辅助病毒基因组有广泛的与其辅助病毒基因组有广泛的3序列同源性序列同源性亚病毒感染因子亚病毒研究提供的启发亚病毒研究提供的启发1、传染病病原物的种类远未穷尽、传染病病原物的种类远未穷尽2、类病毒和朊病毒病害防治研究和实践

52、证明，病、类病毒和朊病毒病害防治研究和实践证明，病毒的基因组愈小愈简单，它所引起的病害的毒的基因组愈小愈简单，它所引起的病害的防治越困难防治越困难(对紫外线（对紫外线（260nm）的抵抗力比）的抵抗力比一般病毒高一般病毒高500040000倍）倍）3、可复制的致病基因组大小的下限也未穷尽、可复制的致病基因组大小的下限也未穷尽4、生物大分子无疑是分子生物学研究的主要对象，、生物大分子无疑是分子生物学研究的主要对象，但生物小分子也不容忽视但生物小分子也不容忽视亚病毒感染因子本章要点本章要点1、亚病毒的类型，各有何特点？、亚病毒的类型，各有何特点？2、了解朊病毒的研究进展，常见的朊病毒病。、了解朊病毒的研究进展，常见的朊病毒病。3、研究亚病毒的意义、研究亚病毒的意义4、有关名词、有关名词亚病毒感染因子亚病毒感染因子