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1、 第二次实验第二次实验 血清总蛋白测定、血清总蛋白测定、 最低检出限最低检出限 线性范围试验线性范围试验教学要求与目的教学要求与目的1 1. .掌握血清总蛋白测定原理和测定方掌握血清总蛋白测定原理和测定方 法，了解其临床意义。法，了解其临床意义。2.2.掌握最低检出限、线性范围的定义、掌握最低检出限、线性范围的定义、 评价方法及用途。评价方法及用途。3.3.熟悉最低检出限、线性范围的实验熟悉最低检出限、线性范围的实验 方法。方法。教学内容教学内容1.1.双缩脲法测定血清总蛋白。双缩脲法测定血清总蛋白。2.2.最低检出限测定。最低检出限测定。3.3.线性范围试验。线性范围试验。一、血清总蛋白测定
2、一、血清总蛋白测定凯氏定氮法凯氏定氮法 参考方法参考方法 双缩脲法双缩脲法 常规方法常规方法酚试剂法酚试剂法染料结合法染料结合法浊度法、紫外光谱法浊度法、紫外光谱法 （一）实验原理（一）实验原理 血清中蛋白质分子中的肽键在碱性溶液血清中蛋白质分子中的肽键在碱性溶液中能与中能与Cu2+作用生成稳定的紫红色络合作用生成稳定的紫红色络合物，此反应和两个尿素分子缩合后生成物，此反应和两个尿素分子缩合后生成的双缩脲在碱性溶液中与铜离子作用形的双缩脲在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似，故称成紫红色的反应相似，故称双缩脲反应双缩脲反应。 在在540nm波长处有吸收峰，在一波长处有吸收峰，在一定浓度
3、范围内其吸光度增加与蛋白含定浓度范围内其吸光度增加与蛋白含量成正比，由此可求得蛋白质含量。量成正比，由此可求得蛋白质含量。蛋白质蛋白质 + + OHCu2+紫红色络合物紫红色络合物（二）实验试剂（二）实验试剂 1、双缩脲试剂、双缩脲试剂 氢氧化钠、酒石酸钾钠氢氧化钠、酒石酸钾钠 硫酸铜、碘化钾硫酸铜、碘化钾 2、标准液总蛋白、标准液总蛋白50g/L （三）操作方法（三）操作方法 1、操作参数：、操作参数： 波长：波长：540nm温度：温度：37 测定模式：终点法测定模式：终点法 2.操作步骤操作步骤（ul）BSUDH2O20标准液标准液20血清血清20双缩脲试剂双缩脲试剂 1000100010
4、00混匀，混匀，37水浴水浴10分钟，在分钟，在540nm波波长处，用空白管调零，读取各管吸光长处，用空白管调零，读取各管吸光度。度。3、计算、计算血清总蛋白血清总蛋白(g/L)=测定管吸光度测定管吸光度标准管吸光度标准管吸光度蛋白标准液浓度蛋白标准液浓度（50g/L）参考值参考值：6083g/L（四）注意事项（四）注意事项 1.严重溶血和黄疸可使测定结果偏高严重溶血和黄疸可使测定结果偏高,可可作标本空白管消除。作标本空白管消除。2.脂肪乳糜干扰比色，可加丙酮离心。脂肪乳糜干扰比色，可加丙酮离心。3.右旋糖酐可使测定产生混浊影响结果。右旋糖酐可使测定产生混浊影响结果。 1.精密度较好、准确度较
5、高，精密度较好、准确度较高，WHO 推荐方法。推荐方法。2.线性范围宽（线性范围宽（10-120g/L）。）。3.操作简便你、快速，成本低廉。操作简便你、快速，成本低廉。4.灵敏度较低灵敏度较低。 （五）方法学评价（五）方法学评价 （六）临床意义（六）临床意义 1.蛋白浓度升高蛋白浓度升高（1）血液浓缩：脱水、外伤性休克等。）血液浓缩：脱水、外伤性休克等。（2）蛋白质合成增加：多发性骨髓瘤、）蛋白质合成增加：多发性骨髓瘤、免疫增殖病等。免疫增殖病等。（3）蛋白质合成障碍：如肝脏疾病。）蛋白质合成障碍：如肝脏疾病。（1）蛋白丢失：如肾病综合征。）蛋白丢失：如肾病综合征。 2.蛋白浓度降低蛋白浓度
6、降低（2）摄入不足：营养不良。）摄入不足：营养不良。 二、最低检测限试验二、最低检测限试验检测限（检测限（LoD）：）：是检测系统可检测出是检测系统可检测出的最低分析物浓度。的最低分析物浓度。 最低检测限（最低检测限（LLD）：指当标本中）：指当标本中不含有待测分析物时，反应响应量可不含有待测分析物时，反应响应量可能出现的数值范围，即单次测量可达能出现的数值范围，即单次测量可达到的非空白检测响应量对应的分析物到的非空白检测响应量对应的分析物量。量。 功能灵敏度（功能灵敏度（FS）：以日间重复）：以日间重复CV为为20%时对应检测限样品具有的平均浓时对应检测限样品具有的平均浓度确定为检测系统或方
7、法可定量报告的度确定为检测系统或方法可定量报告的分析物的最低浓度或其它量值分析物的最低浓度或其它量值 。（一）原理（一）原理 选择合适的空白标本，该标本与待测选择合适的空白标本，该标本与待测标本的区别在于不含有待测物质，一般标本的区别在于不含有待测物质，一般用处理过的标本或一般标本，在分析步用处理过的标本或一般标本，在分析步骤中省去关键试剂或操作。骤中省去关键试剂或操作。本次实验采用蒸馏水作为空白标本，采本次实验采用蒸馏水作为空白标本，采用双缩脲法进行多次测定，求出吸光度用双缩脲法进行多次测定，求出吸光度的均值及标准差，计算最低检测限。的均值及标准差，计算最低检测限。（二）操作步骤二）操作步骤
8、（ul）BSU（1-10）DH2O20标准液标准液20双缩脲试剂双缩脲试剂 100010001000 混匀，混匀，37水浴水浴10分钟，在分钟，在540nm波长处，波长处，用空白管调零，读取各管吸光度。用空白管调零，读取各管吸光度。（三）计算（三）计算 1.计算计算10次测定的平均吸光度及标准差。次测定的平均吸光度及标准差。 2.计算最低检测限：平均吸光度计算最低检测限：平均吸光度+3S 3.将吸光度值转换成浓度单位。将吸光度值转换成浓度单位。 LLD=A低低/A标标C标标三、线性范围试验三、线性范围试验可报告范围（可报告范围（RR）：指可以报告的所有）：指可以报告的所有结果的范围，包含两种类
9、型的范围，即结果的范围，包含两种类型的范围，即分析测量范围和临床可报告范围。分析测量范围和临床可报告范围。 分析测量范围（分析测量范围（AMR）：指分析样本）：指分析样本未经任何预处理（稀释、浓缩等），由未经任何预处理（稀释、浓缩等），由检测系统直接测量得到的待测物的可靠检测系统直接测量得到的待测物的可靠结果范围，在此范围内一系列不同浓度结果范围，在此范围内一系列不同浓度的样本分析物的测量值与其实际浓度的样本分析物的测量值与其实际浓度（真值）呈线性比例关系。（真值）呈线性比例关系。 临床可报告范围（临床可报告范围（CRR）：指定量）：指定量检测项目向临床能报告的检测范围，患检测项目向临床能报告
10、的检测范围，患者样本可经稀释、浓缩或其它预处理。者样本可经稀释、浓缩或其它预处理。（一）原理（一）原理 线性范围是指系统最终输出值（浓度线性范围是指系统最终输出值（浓度或活性）与被分析物浓度或活性成比例或活性）与被分析物浓度或活性成比例的范围。线性范围的测定即测定浓度曲的范围。线性范围的测定即测定浓度曲线接近直线的程度，它反映整个系统的线接近直线的程度，它反映整个系统的输出特征。输出特征。 本试验使用不同浓度的总蛋白标准溶本试验使用不同浓度的总蛋白标准溶液，用双缩脲试剂测定各自的浓度，以液，用双缩脲试剂测定各自的浓度，以标准液预期浓度为横坐标，测得浓度为标准液预期浓度为横坐标，测得浓度为纵坐标
11、，在坐标纸上作图，即可绘制出纵坐标，在坐标纸上作图，即可绘制出一条直线，即计量反应曲线。一条直线，即计量反应曲线。（二）试剂（二）试剂 1.蛋白质标准液（蛋白质标准液（50g/L） 2.混合血清（混合血清（120g/L） 3.双缩脲试剂双缩脲试剂1.1.制备不同浓度的样本制备不同浓度的样本U1U2U3U4U5U6U7DH2O（ul）200200200200200200血清（血清（ul）300300300300300300浓度（浓度（g/L)5.69.315.625.9 43.2 72.0 120.02.2.按下表操作按下表操作（ul）BSU1U2U3U4.U7DH2O20标准液标准液20血清血
12、清20202020试剂试剂100010001000100010001000 各测定管均测定双份，混匀，各测定管均测定双份，混匀，37水浴水浴10分钟，在分钟，在540nm波长处，用空白波长处，用空白管调零，读取各管吸光度。管调零，读取各管吸光度。（四）记录实验数据，（四）记录实验数据，并绘制剂量反应并绘制剂量反应曲线。以总蛋白浓度预期值为横坐标，曲线。以总蛋白浓度预期值为横坐标，测定值为纵坐标，在坐标纸上绘制曲线，测定值为纵坐标，在坐标纸上绘制曲线，即为剂量反应曲线。即为剂量反应曲线。 （五）评价（五）评价 1.1.目测法：是评估几个不同浓度样本目测法：是评估几个不同浓度样本的多次测量均值与实
13、际值之间是否具有的多次测量均值与实际值之间是否具有肉眼上的直线关系。没有用到统计学方肉眼上的直线关系。没有用到统计学方法来验证线性。法来验证线性。 2.2.平均斜率法：是采用最小二乘法直线平均斜率法：是采用最小二乘法直线回归作统计分析方法。以总蛋白浓度预回归作统计分析方法。以总蛋白浓度预期值为横坐标，测定值为纵坐标，在坐期值为横坐标，测定值为纵坐标，在坐标纸上作图，若所有实验点在坐标纸上标纸上作图，若所有实验点在坐标纸上呈明显直线趋势，呈明显直线趋势，建立回归方程建立回归方程y=a+bx，要求，要求a接近于接近于0，b在在0.971.03之间，若满足此条件，则可之间，若满足此条件，则可直接判断
14、该测定方法是否在所要求的线直接判断该测定方法是否在所要求的线性范围。性范围。 若若a较大，较大，b1.03或或0.97则认为在高浓则认为在高浓度或低浓度处的实测值和预期值间有较度或低浓度处的实测值和预期值间有较大偏差。试着舍去某组数据，另作回归大偏差。试着舍去某组数据，另作回归分析，直到分析，直到a接近于接近于0，b在在0.971.03之间，之间，此时缩小的分析范围是真实的可报告范此时缩小的分析范围是真实的可报告范围。围。 3.用统计软件拟合（了解）用统计软件拟合（了解） 最佳拟合曲线与直线方程的平均偏差最佳拟合曲线与直线方程的平均偏差5%的浓度范围为该方法的线性范围。的浓度范围为该方法的线性范围。下次课内容下次课内容1.血清白蛋白测定。血清白蛋白测定。2.回收试验。回收试验。人有了知识，就会具备各种分析能力，明辨是非的能力。所以我们要勤恳读书，广泛阅读，古人说“书中自有黄金屋。”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识，培养逻辑思维能力；通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，培养文学情趣；通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。有许多书籍还能培养我们的道德情操，给我们巨大的精神力量，鼓舞我们前进。
