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1、血清碱性磷酸酶活性测定磷酸苯二钠法ALP姓名：刘慧姓名：刘慧班级：班级：20104289学号：学号：2010415125主要内容主要内容 实验目的 实验原理 实验器材与试剂 实验操作 计算 临床意义 注意事项 思考 实验目的掌握酶活力测定的一般方法掌握血清中ALP活力测定方法掌握血清中ALP测定的临床意义 思考思考 ？如何测定酶活力的大小如何测定酶活力的大小？ 酶活力酶活力：酶催化某一化学反应的能力，其衡量的标准是酶催化某一化学反应的能力，其衡量的标准是酶催化某一化学反应的能力，其衡量的标准是酶催化某一化学反应的能力，其衡量的标准是酶促反应速度的大小。酶促反应速度的大小。酶促反应速度的大小。酶
2、促反应速度的大小。 酶促反应的速度：酶促反应的速度：常用单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示。 反应速度反应速度反应速度反应速度 活力活力活力活力酶活力测定方法 终止测定法（或定时法）：终止测定法（或定时法）：终止测定法（或定时法）：终止测定法（或定时法）： * *本次实验的方法本次实验的方法本次实验的方法本次实验的方法 通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内底物的减少量或产
3、物的生成量，计算酶促反应的平促反应，测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应的平促反应，测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应的平促反应，测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应的平均速度。均速度。均速度。均速度。 连续监测法：连续监测法：连续监测法：连续监测法： 连续监测法是指每隔一定时间（连续监测法是指每隔一定时间（连续监测法是指每隔一定时间（连续监测法是指每隔一定时间（2 260s60s），连续多次测定酶反），连续多次测定酶反），连续多次测定酶反），连续多次测定酶反应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数据，求出酶反应初速应过程中某一反应产物
4、或底物量随时间变化的数据，求出酶反应初速应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数据，求出酶反应初速应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法。度，间接计算酶活性浓度的方法。度，间接计算酶活性浓度的方法。度，间接计算酶活性浓度的方法。 适用于自动生化分析仪适用于自动生化分析仪适用于自动生化分析仪适用于自动生化分析仪 目前已取代固定时间法而成为临床实验室测目前已取代固定时间法而成为临床实验室测目前已取代固定时间法而成为临床实验室测目前已取代固定时间法而成为临床实验室测什么是ALP？碱性磷酸酶碱性磷酸酶ALP是一组在是一组在碱性环境碱性环境中中水解磷酸
5、酯水解磷酸酯的酶类。的酶类。来源：广泛分布于人体的骨、肾、肝、肠、血清、来源：广泛分布于人体的骨、肾、肝、肠、血清、胆汁等部位，但骨骼、牙齿、肾和肝脏中含量较胆汁等部位，但骨骼、牙齿、肾和肝脏中含量较多。正常人血清中多。正常人血清中ALP主要来源于主要来源于肝脏肝脏。是一种能够将对应底物是一种能够将对应底物去磷酸化去磷酸化的酶，即通过水的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团磷酸基团除去，并生除去，并生成成磷酸根离子磷酸根离子和和自由的羟基自由的羟基，这类底物包括核酸、，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程称为蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的
6、过程称为去磷酸化或脱磷酸化。去磷酸化或脱磷酸化。碱性磷酸酶在碱性环境中有最大活力。碱性磷酸酶在碱性环境中有最大活力。 实验原理实验原理测定测定ALP的方法主要分为两种的方法主要分为两种一是测定底物解离下的一是测定底物解离下的磷酸根磷酸根来计算酶活力来计算酶活力，如如-甘油磷酸钠法，但存在血清本身有磷酸根甘油磷酸钠法，但存在血清本身有磷酸根的缺点；的缺点；二是测定底物解离磷酸根后的二是测定底物解离磷酸根后的羟基化合物羟基化合物，这，这种方法又可分为：种方法又可分为： 酚化合物在显色剂的作用下显色比色测定。酚化合物在显色剂的作用下显色比色测定。 生成的酚化合物本身在一定的条件下就可生成的酚化合物本
7、身在一定的条件下就可显色，如对硝基苯磷酸二钠（显色，如对硝基苯磷酸二钠（PNPP）法）法 在PH=10的环境中，ALPALP催化磷酸苯二钠磷酸苯二钠水解 苯酚苯酚和磷酸氢二钠磷酸氢二钠苯酚苯酚与4-4-氨基安替比林氨基安替比林 色素原色素原该色素原经铁氰化钾铁氰化钾氧化生成红色醌亚胺衍生物醌亚胺衍生物测定红色物质的吸光度就可以计算酶活力的大小。磷酸苯二钠磷酸苯二钠磷酸苯二钠磷酸苯二钠+H+H2 2O O (ALP, PH=10) 苯酚 + 磷酸氢二钠苯酚苯酚苯酚苯酚+ 4-+ 4-氨基安替比林氨基安替比林氨基安替比林氨基安替比林（铁氰化钾）（铁氰化钾）（铁氰化钾）（铁氰化钾） 醌亚胺衍生物醌亚
8、胺衍生物试剂与仪器试剂与仪器（一）（一） 0.1mol/L0.1mol/L碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液（含（含（含（含4-4-氨基安替比林）氨基安替比林）氨基安替比林）氨基安替比林）4-4-氨基安替比林：氨基安替比林：氨基安替比林：氨基安替比林： 淡黄色结晶。熔点淡黄色结晶。熔点淡黄色结晶。熔点淡黄色结晶。熔点109109。溶于水、苯和乙醇，微溶于乙醚。溶于水、苯和乙醇，微溶于乙醚。溶于水、苯和乙醇，微溶于乙醚。溶于水、苯和乙醇，微溶于乙醚 。 4一氨基安替比林用量与吸光度成正相关，需准确加入。铁氰化钾用量不一氨基安替比林用量与吸光度成正相关，需准确加入。铁氰化钾用量不足时
9、，反应不完全，测量结果偏低，因此铁氰化钾用量必须加足或稍稍过量足时，反应不完全，测量结果偏低，因此铁氰化钾用量必须加足或稍稍过量 （二）（二）20mmol/L20mmol/L磷酸苯二钠溶液磷酸苯二钠溶液磷酸苯二钠溶液磷酸苯二钠溶液（三）（三）铁氰化钾的硼酸溶液铁氰化钾的硼酸溶液铁氰化钾的硼酸溶液铁氰化钾的硼酸溶液（四）（四）酚标准工作液酚标准工作液酚标准工作液酚标准工作液器材：器材：器材：器材： 5ml 5ml移液管、移液管、移液管、移液管、1ml1ml移液管、加样枪、分光光度计、移液管、加样枪、分光光度计、移液管、加样枪、分光光度计、移液管、加样枪、分光光度计、1cm1cm比色皿比色皿比色皿
10、比色皿 37C37C水浴锅水浴锅水浴锅水浴锅实验操作实验操作取取取取4 4 4 4支试管，如下操作：支试管，如下操作：支试管，如下操作：支试管，如下操作：立即混匀。用立即混匀。用510nm510nm波长（红色醌物质的最大吸收波长）比色，波长（红色醌物质的最大吸收波长）比色，以蒸馏水调零点，读取各管吸光度。以蒸馏水调零点，读取各管吸光度。* *保持反应时温度是均衡的，保持反应时温度是均衡的，保持反应时温度是均衡的，保持反应时温度是均衡的，37C 37C 计算公式计算公式ALP活性金氏单位定义:每100ml血清再37摄氏度时与底物作用15分钟，产生酚1mg为1金氏单位。ALP活性=(At-Ac)/
11、(As-Ab)*0.05*100(金氏单位)参考值参考值成人：成人：成人：成人：313313金氏单位；儿童：金氏单位；儿童：金氏单位；儿童：金氏单位；儿童：528528金氏单位。金氏单位。金氏单位。金氏单位。注意事项注意事项酚标准液开后不能久置。底物液不能含有酚，若含酚则显红色，说明磷酸苯二钠已分解，不宜使用。加入铁氰化钾后必须迅速混匀(为了改变PH来终止酶促反应），否则有影响，偏大。铁氰化钾溶液中加入硼酸有稳定最后所显色的作用。此液应避光保存，如出现蓝绿色即作废。临床意义临床意义 在临床上，血清在临床上，血清ALPALP测定常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临测定常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床辅助诊
12、断指标。床辅助诊断指标。1.1.血清血清ALPALP活性升高活性升高 肝胆疾病肝胆疾病：阻塞性黄疸、急性或慢性黄疸性肝炎、肝癌等；骨阻塞性黄疸、急性或慢性黄疸性肝炎、肝癌等；骨骼疾病：由于骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的骼疾病：由于骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的ALPALP释放进入血液中，引起血清释放进入血液中，引起血清ALPALP活性增高，如纤维性活性增高，如纤维性骨炎、成骨不全症、佝偻病、骨软化病、骨转移癌和骨折骨炎、成骨不全症、佝偻病、骨软化病、骨转移癌和骨折修复愈合期等修复愈合期等。2.2.血清血清ALPALP活性降低活性降低 : :比较少见，主要见于呆小病，比较少见，主
13、要见于呆小病，ALPALP过少症，维生素过少症，维生素C C缺乏症。缺乏症。思考题思考题1. 本次实验是用的什么方法？终止剂是什么？为什么加入铁氰化钾本次实验是用的什么方法？终止剂是什么？为什么加入铁氰化钾硼酸液后必须迅速混匀？有何影响？硼酸液后必须迅速混匀？有何影响？ 答：终止法；终止剂是答：终止法；终止剂是 铁氰化钾硼酸液；硼酸改变了铁氰化钾硼酸液；硼酸改变了PH，使其，使其不再处于最适不再处于最适PH。 2.2.BB管与管与管与管与C C管在实验中有何作用管在实验中有何作用管在实验中有何作用管在实验中有何作用? ?不设两管有何影响？不设两管有何影响？不设两管有何影响？不设两管有何影响？
14、答：做参比溶液。答：做参比溶液。答：做参比溶液。答：做参比溶液。 3.3.实验过程两次水浴保温，一次实验过程两次水浴保温，一次实验过程两次水浴保温，一次实验过程两次水浴保温，一次5min5min，一次，一次，一次，一次15min15min。意义相同吗。意义相同吗。意义相同吗。意义相同吗？有何区别？有何区别？有何区别？有何区别？ 答：不同。前者是达到最适温度，后者是反应时间。答：不同。前者是达到最适温度，后者是反应时间。答：不同。前者是达到最适温度，后者是反应时间。答：不同。前者是达到最适温度，后者是反应时间。4.4.用标准曲线如何设计本实验操作过程？用标准曲线如何设计本实验操作过程？用标准曲线
15、如何设计本实验操作过程？用标准曲线如何设计本实验操作过程？标准曲线法标准曲线法 取试管按表操作取试管按表操作取试管按表操作取试管按表操作加入物（ml)0 12345酚标准应用液00.20.40.60.81.0蒸馏水1.10.90.70.50.30.1碳酸盐缓冲液1.01.01.01.01.01.0铁氰化钾溶液3.03.03.03.03.03.0相当于金氏单位01020304050立即混匀，选择波长立即混匀，选择波长立即混匀，选择波长立即混匀，选择波长510nm510nm，用零号管调零，读取各，用零号管调零，读取各，用零号管调零，读取各，用零号管调零，读取各管吸光度，并与相应酶金氏单位对应，绘制
16、校正曲线管吸光度，并与相应酶金氏单位对应，绘制校正曲线管吸光度，并与相应酶金氏单位对应，绘制校正曲线管吸光度，并与相应酶金氏单位对应，绘制校正曲线。其他方法：其他方法：磷酸对硝基酚连续监测法 在碱性条件下，碱性磷酸酶将无色磷酸对硝基苯酚水解为黄色对硝基苯酚，在 405nm测定对硝基苯酚生成的速率，这个速率与血清中ALP活性成正比。反应需要Mg2+作为激活剂。 实验小结实验小结 磷酸苯二钠比色法水解速度快，故保温时间较短。磷酸苯二钠比色法水解速度快，故保温时间较短。磷酸苯二钠比色法水解速度快，故保温时间较短。磷酸苯二钠比色法水解速度快，故保温时间较短。该法灵敏度较高，显色稳定，不需去蛋白，操作简
17、单、该法灵敏度较高，显色稳定，不需去蛋白，操作简单、该法灵敏度较高，显色稳定，不需去蛋白，操作简单、该法灵敏度较高，显色稳定，不需去蛋白，操作简单、快速。磷酸苯二钠比色法水解速度快，故保温时间较短。快速。磷酸苯二钠比色法水解速度快，故保温时间较短。快速。磷酸苯二钠比色法水解速度快，故保温时间较短。快速。磷酸苯二钠比色法水解速度快，故保温时间较短。该法灵敏度较高，显色稳定，不需去蛋白，操作简单、该法灵敏度较高，显色稳定，不需去蛋白，操作简单、该法灵敏度较高，显色稳定，不需去蛋白，操作简单、该法灵敏度较高，显色稳定，不需去蛋白，操作简单、快速。但与磷酸对硝基酚连续监测法相比，准确度、精快速。但与磷
18、酸对硝基酚连续监测法相比，准确度、精快速。但与磷酸对硝基酚连续监测法相比，准确度、精快速。但与磷酸对硝基酚连续监测法相比，准确度、精密度较低，操作比较繁琐，灵敏度低；酶单位不是国际密度较低，操作比较繁琐，灵敏度低；酶单位不是国际密度较低，操作比较繁琐，灵敏度低；酶单位不是国际密度较低，操作比较繁琐，灵敏度低；酶单位不是国际单位；受胆红素和溶血的干扰。单位；受胆红素和溶血的干扰。单位；受胆红素和溶血的干扰。单位；受胆红素和溶血的干扰。 但是若用磷酸对硝基但是若用磷酸对硝基但是若用磷酸对硝基但是若用磷酸对硝基酚法测定，在反应过程中会生成有毒的对硝基苯酚法测定，在反应过程中会生成有毒的对硝基苯酚法测定，在反应过程中会生成有毒的对硝基苯酚法测定，在反应过程中会生成有毒的对硝基苯 酚，对皮肤和黏膜有很大的伤害。酚，对皮肤和黏膜有很大的伤害。酚，对皮肤和黏膜有很大的伤害。酚，对皮肤和黏膜有很大的伤害。
