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1、器材准备器材准备斜面培养物斜面培养物4 4支，营养肉汤支，营养肉汤4 4支，生理盐水支，生理盐水2 2支，支，镜油瓶、拭镜纸镜油瓶、拭镜纸1 1套，吸水纸套，吸水纸1 1本，载玻片本，载玻片4 4张。张。染色瓶染色瓶6 6组，染色架组，染色架8 8个。个。医学微生物学实验综合性实验一v脓汁和粪便标本中病原菌的检测（四）斜面培养物的观察革兰染色法肉汤接种法显微镜油镜的使用斜面培养物的观察v分别从斜面的正面和背面观察。v从普通平板普通平板上挑取的黄色或白色菌落接种的斜面，菌苔的颜色，还是原来菌落的颜色，黄色或白色。v从伊红美蓝伊红美蓝平板上挑取的紫黑色或粉红色菌落接种的斜面，菌苔已经没有原来菌落的
2、颜色。菌苔灰白色、表面湿润、光滑、不透明（紫黑）或半透明（粉红）。为了讲解方便，以后的实验，仍然沿用沿用初次分离得到菌落的颜色，紫黑色或粉红色。v从斜面上取菌时，不管是涂片，还是接种，每次只取半个小菌落大小的菌量；接种环或接种针在培养基表面轻轻刮一下即可。 细菌染色法细菌染色法v单染色法单染色法：只用一种染料染色，如美蓝或复红，能清楚观察菌体大小、形态与排列，不能鉴别细菌。v复染色法复染色法（鉴别染色）：采用两种或两种以上的不同染料进行先后染色，可将细菌染成不同的颜色，以便鉴别细菌。抗酸染色抗酸染色:用于检查结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌等抗酸性细菌，阳性者为红色。特殊染色特殊染色：荚膜染色，芽胞
3、染色，鞭毛染色，极体染色（用于白喉杆菌异染颗粒染色）。结核分枝杆菌结核分枝杆菌抗酸染色抗酸染色麻风分枝杆菌麻风分枝杆菌抗酸染色抗酸染色产气荚膜梭菌荚膜产气荚膜梭菌荚膜Hiss Hiss 染色染色破伤风破伤风梭梭菌芽胞菌芽胞芽胞染色芽胞染色变形杆菌鞭毛变形杆菌鞭毛LeifsonLeifson染色染色 白喉棒状杆菌异染颗粒白喉棒状杆菌异染颗粒AlbertAlbert染色染色革兰染色法革兰染色法 Gram Staining Gram Staining 革兰染色法是丹麦内科医生 Christain Gram于1884年创立的一种细菌染色方法，已有120多年的历史，仍在广泛使用，是细菌学中最为经典的染色
4、法。革兰染色法原理的三种学说革兰染色法原理的三种学说v通透性学说通透性学说：G+菌细胞壁结构比较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，酒精不易透入，反而可使细胞壁脱水而形成一道屏障，阻止染料向细胞外渗。G-菌细胞壁比较疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质，易被酒精溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫碘复合物容易被酒精脱出。v等电学说等电学说：G+菌等电点(pH23)比G-菌(pH45)低，一般染色时染液的酸碱度在pH7.0左右，电离后阳性菌带的负电荷比阴性菌多，因此与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。v化学学说化学学说：G+菌细胞内含有某种特殊化学成分，一般认为是核糖核
5、酸镁盐与多糖的复合物，它与染料媒染剂复合物结合，使已着色的细菌不易脱色。 革兰染色的意义革兰染色的意义v鉴别细菌：把细菌分成G+和G-两大类。v选择抗菌药物：G+球菌球菌对青霉素敏感,G-杆菌杆菌耐药。v了解细菌的致病机理：G+菌大多产生外毒素,G-菌产生内毒素。革兰染色的步骤革兰染色的步骤 涂片 干燥 固定 染色接种环取生理盐水34ul，2滴。菌苔少许（1mm小菌落的半量）与盐水混匀，涂成1cm2。涂毕环移至涂膜中央侧立，环内菌膜破裂，接种环灭菌。涂片的制备涂片的制备甲黄色，紫黑。乙黄色，紫黑。丙白色，粉红。丁白色，粉红。涂片涂片涂片干燥固定革兰染色方法步骤革兰染色方法步骤涂片涂片 干燥干燥
6、 固定固定 结晶紫结晶紫 初染初染1 1分钟分钟水洗水洗 卢戈碘液卢戈碘液媒染媒染1 1分钟分钟水洗水洗 9595乙醇乙醇脱色约脱色约2020秒钟秒钟水洗水洗 稀释复红稀释复红复染复染1 1分钟分钟水洗水洗 吸干吸干, ,镜检。镜检。取菌适量取菌适量, ,涂片均匀涂片均匀, ,水洗轻缓水洗轻缓, ,脱色适当。脱色适当。影响革兰染色的关键是涂片太厚和脱色。影响革兰染色的关键是涂片太厚和脱色。革兰阳性菌革兰阳性菌 革兰阴性菌革兰阴性菌G G+ +链球菌链球菌G G- -双球菌双球菌G G+ +杆菌杆菌G G+ +短杆菌短杆菌G G- -弧菌弧菌G G- -螺菌螺菌甲黄色, 乙白色, 丙紫黑, 丁粉
7、红。标记：组号，颜色36培养4小时45108cfu/ml液体培养基接种液体培养基接种 Broth Transfer Broth Transfer 悬浮法悬浮法 Suspending Method Suspending Method细菌在液体培养基的生长情况细菌在液体培养基的生长情况v均匀浑浊：例如金黄色葡萄球菌均匀浑浊：例如金黄色葡萄球菌, 大肠杆菌。大肠杆菌。v表面生长形成菌膜：例如枯草杆菌。表面生长形成菌膜：例如枯草杆菌。v沉淀生长：例如链球菌。沉淀生长：例如链球菌。生物安全警告v本次实验操作，可产生几十至几百个微生物气溶胶颗粒。v气溶胶粒径100um沉降很快,50um在0.4s内扩散开,
8、5um通过呼吸道直接到达肺泡。vPike博士对实验室感染统计分析结果发现，不明原因的感染高达82%，大多数是气溶胶在空气中扩散引起的。v实验时应坐着，在火焰周围1020厘米内操作，保持安静、有序，尽量少说话、少走动，以免感染病原菌。100倍浸油物镜使用方法v油镜放入光路之前，一定要在标本的观察部位上加一滴浸油。v旋转物镜转盘，使油镜进入光路，用微调旋钮对好焦距。v如果浸油内有气泡，会影响观察，可稍微旋转物镜转盘，使油镜来回通过12次浸油，排除油内气泡。香柏油折射率香柏油折射率n=1.515n=1.515空气折射率空气折射率n=1.00n=1.00玻片折射率玻片折射率n=1.52n=1.52油浸
9、镜的原理光线光线 滴加香柏油可使滴加香柏油可使光线更多进入物镜光线更多进入物镜, ,避避免光线通过折射率低免光线通过折射率低的空气而散失的空气而散失, ,以提高以提高物镜的分辨率物镜的分辨率, ,使物象使物象明亮清晰。明亮清晰。 放大倍数：目镜放大倍数：目镜1010倍倍物镜物镜9090或或100100倍倍显微镜油镜的使用P13v10物镜标本位置滴加香柏油100油镜浸泡油中,几乎与标本接触（工作距离0.13mm）细调节调焦，观察物像记录结果关闭电源。v油镜处理：擦镜纸拭去香柏油 擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭擦镜纸擦拭油镜。v显微镜罩上防尘罩 横放在实验柜内。(顺德校区）实验台两侧的
10、电源插座，只能插入一个插头，请选择离你最近的电源插座。（校本部）实验台中间，三个位的插座，中间那位插孔没有电，不能使用，只能用两侧的插座。 v革兰染色法P15 甲黄色，紫黑 乙黄色，紫黑 丙白色，粉红 丁白色，粉红v肉汤接种法P10 甲黄色 乙白色 丙紫黑 丁粉红v油镜的使用P13 10物镜标本位置滴加香柏油100油镜浸泡油中,几乎与标本接触（工作距离0.13mm）细调节调焦，观察物像记录结果关闭电源 擦镜纸拭去香柏油 擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭擦镜纸擦拭油镜。思考题v革兰染色法的关键步骤是什么?为什么?v染色时为什么通常要用新鲜的细菌培养物? v如何使用油镜?实验小结实验小结
11、v用普通平板，从浓汁标本中分离得到黄色黄色、白色白色两种菌落，这两株细菌，显微镜油镜下均为G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌。结合菌落色素，这两株葡萄球菌可能是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。电镜油镜葡萄葡萄球菌三个种的鉴别葡萄球菌三个种的鉴别试验金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌腐生葡萄球菌血浆凝固酶+-甘露醇发酵+-新生霉素敏感性SSRA蛋白+-注：敏感（Sensitive S）, 耐药（Resistant R）。v用伊红美蓝平板,从粪便标本分离、获得紫黑色和粉红色半透明两种菌落。紫黑色紫黑色菌落是能分解乳糖的非致病菌大肠埃希菌。粉红色粉红色菌落是不能分解乳糖的致病菌。显微镜下，均为
12、G-杆菌，散在排列，从形态上不能鉴别是什么细菌。电镜油镜常用器材摆放顺序：电源插座常用器材摆放顺序：电源插座试管架试管架酒精灯酒精灯污物盘。污物盘。试管架上器材：靠近插座一侧第试管架上器材：靠近插座一侧第1 1和第和第2 2列分别放置接种针列分别放置接种针和接种环，另一侧中间两行放置油性笔和打火机。和接种环，另一侧中间两行放置油性笔和打火机。器材使用后，必须放回原处，依次摆整齐。器材使用后，必须放回原处，依次摆整齐。实验器材实验器材 整齐有序整齐有序革兰染色瓶革兰染色瓶染色架染色架石蜡油石蜡油拭镜纸拭镜纸吸吸水水纸纸乙乙醇醇乙乙醚醚微生物学器材柜微生物学器材柜-1-1（边台西侧中段）（边台西侧中段）革兰染色器材革兰染色器材 收拾入柜收拾入柜 依次摆整齐依次摆整齐
