《生物传感器》PPT课件.ppt

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1、生物传感器中国科学院研究生院姚 鑫E-mail: 学习这门课的目的 通过本课程的学习，了解各类生物传感器的基本原理、特点、技术方法和应用。了解生物传感器的及发展趋势，为以后从事相关领域研究打好基础. 参考书 张先恩主编，生物传感器，化学工业出版社，北京，2006 布莱恩 R. 埃金斯 著，罗瑞贤等译，化学传感器与生物传感器，化学工业出版社，北京，2005 几个生物传感器的例子DNA-表面等离子激元共振仪表面等离子激元共振仪(SPR)多肽多肽-电化学电化学DNA-电化学电化学PNA/DNA-SPR葡糖淀粉酶葡糖淀粉酶支链淀粉支链淀粉酶酶-石英晶体微天平石英晶体微天平Figure 2. (A) T

2、ime courses of frequency changes of the amylopectinimmobilized QCM, responding to the addition of glucoamylase at (a) 16, (b) 27, (c) 38, and (d) 54 nM. The curve (e) shows the hydrolysis of the pullulan-immobilized QCM at 540 nM glucoamylase (25 C, 20 mM acetate buffer, pH 4.8, 0.1 M NaCl).传感器传感器:是

3、一种装置,是检测或测量一种物理性质并进行记录,显示或以其他方式作出响应.化学传感器:一种装置,通过某种化学反应以选择性方式对特定的待分析物质产生响应从而对分析质进行定性或定量测定传感器物理传感器:用以测量距离,重量,温度,压力和电性能生物传感器:一种装置,其采用某种生物敏感元件与转换器相连接.检测物质也可以是纯化学物质,识别元件是生物质第一章 绪 论 分析生物技术的一个重要领域便是生物传感器分析生物技术的一个重要领域便是生物传感器( (biosensorbiosensor),),它是一个它是一个典型的多学科交叉产物典型的多学科交叉产物, ,结合了生命科学、分析化学、物理学和信息科学及结合了生命

4、科学、分析化学、物理学和信息科学及其相关技术，能够对所需要检测的物质进行快速分析和追踪。其相关技术，能够对所需要检测的物质进行快速分析和追踪。 生物的基本特征之一，是能够对外界的各种刺激作出反应。其所以能生物的基本特征之一，是能够对外界的各种刺激作出反应。其所以能够如此，首先是由于生物能感受外界的各类刺激信号，并将这些信号转换够如此，首先是由于生物能感受外界的各类刺激信号，并将这些信号转换成体内信息处理系统所能接收并处理的信号。例如，人能通过眼、耳、鼻、成体内信息处理系统所能接收并处理的信号。例如，人能通过眼、耳、鼻、舌、身等感觉器官将外界的光、声、温度及其它各种化学和物理信号转换舌、身等感觉

5、器官将外界的光、声、温度及其它各种化学和物理信号转换成人体内神经系统等信息处理系统能够接收和处理的信号。成人体内神经系统等信息处理系统能够接收和处理的信号。 生物传感器的出现，是科学家的兴趣和科学技术发展及社会发展需求生物传感器的出现，是科学家的兴趣和科学技术发展及社会发展需求多方面双驱动的结果，经过多方面双驱动的结果，经过3030多年的发展，已经成为一个涉及内容广泛、多年的发展，已经成为一个涉及内容广泛、多学科介入和交叉、充满创新活力的领域。多学科介入和交叉、充满创新活力的领域。1.1 生物传感器的发展历程2020世纪世纪6060年代酶法分析：专一性强、灵敏度高、操作简便，但是测定周期长。年

6、代酶法分析：专一性强、灵敏度高、操作简便，但是测定周期长。离子选择电极离子选择电极( ( ion selective electrode, ISE) )：操作简单，无需对样品进行欲处操作简单，无需对样品进行欲处理理无试剂分析无试剂分析( (non-reagental analysis) )，但是只能检测无机离子但是只能检测无机离子1956 1956 Leland C. Clark Jnr 隔离式氧电极隔离式氧电极1962 1962 Leland C. Clark Jnr 酶传感器酶传感器( ( enzyme transducer) )1967 1967 S. J. Updike 葡萄糖酶电极葡

7、萄糖酶电极1975 1975 Yellow Springs Instrument(YSI) 葡萄糖测定仪葡萄糖测定仪1975 1975 C. Divis 用完整活细胞取代纯酶制作传感器用完整活细胞取代纯酶制作传感器1977 1977 GA. Rechnitz 用粪便链球菌完整活细胞与氨敏电极组合成测精氨酸的用粪便链球菌完整活细胞与氨敏电极组合成测精氨酸的微生物电极微生物电极1977 1977 Iso Karube和和J. Janata 测测BODBOD的微生物传感器和测抗原的免疫传感器的微生物传感器和测抗原的免疫传感器l随后出现了细胞器传感器、细胞传感器和组织切片传感器l20世纪70年代中期到

8、80年代，生物技术、生物电子和微电子学不断地渗透、融合，致使生物传感器不再局限于生物反应的电化学过程，而是根据生物学反应中产生的各种信息(如光效应、热效应、场效应和质量变化等)了设计各种精密的探测装置。l1974 K. Mosbach 热生物传感器l1974 Janata 酶场效应晶体管l1980 D. W. Lubbers 和N. Optiz酶光纤传感器l1983 Giulbault 压电晶体酶传感器l1976 A. H. Clemens等报道了以葡萄糖酶电极为基础的第一个人工肾脏，随后被Miles公司开发成生命稳定系统Biostator，用于重症糖尿病人床边监护。l1983 B.Liedb

9、erg利用表面等离子激元共振(Surface Plasmon Resonance)方法，能够适时的对生物亲和反应进行检测，在次基础上，瑞典Pharmacia公司在1990年推出商用仪器BIAcore，成为目前研究生物分子之间互相作用最优秀的实验工具。l1984 A.E.G. Cass 首次建立了介体酶电极方法,利用化学介体戊二醛取代分子氧作为氧化还原酶酶促反应的电子受体,促成了1987年美国MediSene 公司开发成功印刷酶电极.发展迅速 文章方面: web of science 中输入“biosensor”共检索到10035篇文章，约从1993-2006年。 功能方面：活体( in viv

10、o)测定、多指标测定和联机在线(on line)测定。 检测对象：各种常见的生物化学物质，在临床、发酵、食品、化工和环保等方面均显示了广泛的应用前景。1984 华盛顿召开的国际生物工程年会上将生物传感器列为当代生物工程的重要领域之一1985 Elsevier科学出版公司创刊生物传感器国际学术期刊，1990 更名为生物传感器和生物电子学(Biosensors & Bioelectronics).1987 德国Dusseldor 召开以生物传感为4个主题之一的BIOTECH87.表 1-1 历届世界生物传感器学术大会的主题内容及其论文数量年份主题分类入选论文篇数地点1990亲和传感器普通生物传感器

11、葡萄糖生物传感器微型生物传感器流动注射分析法205新加坡1992酶传感器亲和传感器生物传感器与生物电子学环境监测154瑞士日内瓦1994生物传感器的商业发展和应用酶传感器亲和生物传感器全细胞传感器248美国新奥尔良1996催化生物传感器亲和生物传感器生物电子学综合257泰国曼谷2000酶传感器免疫传感器生物电子学受体传感器分子识别商业化问题385美国圣地亚哥2002生物电子学与微分析系统核酸传感器与DNA芯片生物体与全细胞传感器酶传感器免疫传感器商业化与市场组合与分子印迹（专题）414日本京都1998催化生物传感器基于受体的生物传感器核酸传感器免疫传感器生物电子学商业化问题425德国柏林200

12、4核酸生物传感器与DNA芯片生物电子学，生物燃料电池，微分析系统酶传感器器官与全细胞生物传感器系统集成，蛋白质组学和单细胞分析免疫传感器天然与合成受体生物传感器新的信号传导技术商业化与市场560西班牙格拉纳达生物传感器发展阶段20世纪6070年代，起步阶段：传统酶电极20世纪70年代末期到80年代，发展高潮阶段：介体酶电极20世纪90年代以后市场开发获得显著成绩生物亲和传感器的技术突破（SPR）酶的直接电化学1.2 生物传感器的原理和特点待分析物待分析物生生物物敏敏感感膜膜化学量或化学量或物理量变化物理量变化换换能能器器可定量加工可定量加工的电信号的电信号图 1-2 生物传感器传感原理生物敏感

13、膜生物敏感膜(biosensitive membrane)又称分子识别元件又称分子识别元件(molecular recognition element),是生物传感器的关键元是生物传感器的关键元件，直接决定传感器的功能和质量件，直接决定传感器的功能和质量表1-2 生物传感器的分子识别元件分子识别元件（生物敏感膜）生物活性材料酶全细胞组织细胞器免疫物质具有生物亲和能力的物质核酸模拟酶各种酶电极细菌，真菌，动物，植物的细胞动物、植物的组织切片线粒体，叶绿体抗体，抗原，酶标抗原等配体，受体寡聚核苷酸高分子聚合物这里所说的膜是采用固定化技术制作的人工膜而不是天然的生物膜(细胞膜)表 1-3 生物学反应

14、信息和换能器的选择生物学反应信息换能器选择离子变化电阻变化、电导变化质子变化气体分压变化热焓变化光学变化颜色变化（也属于光学范畴）质量变化力变化震动频率变化？-折射率变化离子选择性电极阻抗计，电导仪场效应晶体管气敏电极热敏电阻，热电偶光纤，光敏管，荧光计光纤，光敏管压电晶体管微悬臂梁表面等离子共振换能器的作用是将各种生物的、化学的和物理的信息转化成电信号生物传感器的主要特点1、多样性。根据生物反应的特异性和多样性，理论上可以制成测 定所有生物物质的酶传感器。2、无试剂分析。除了缓冲液以外，大多数酶传感器不需要添加其它分析试剂。3、操作简单，快速、准确，易于联机。4、可以重复使用、连续使用，也可

15、以一次性使用。1.3 生物传感器的基本概念与类型基本概念 生物传感器概念来源于Clark关于酶电极的描述，关键是传感器的构成中分子识别元件为具有生物学活性的材料。 首届世界生物传感器学术大会(Biosensors 90)上将生物传感器定义为由生物活性材料与相应的换能器的结合体，能测定特定的化学物质(主要是生物物质)；而将能用于生物参量测定但构成中不含生物活性材料的装置称为生物敏(biosensing)传感器。 Turner教授定义为：生物传感器是一种精致的分析器件，它结合一种生物的或生物衍生的敏感元件与一只理化换能器，能够产生间断或连续的数字电信号，信号强度与被分析物成比例。图图 1-3 生物

16、传感器分类生物传感器分类类型类型分子识别元件分子识别元件分类法分类法酶传感器酶传感器免疫传感器免疫传感器组织传感器组织传感器细胞传感器细胞传感器核酸传感器核酸传感器微生物传感器微生物传感器分子印迹生物分子印迹生物传感器传感器Enzyme sensorImmunosensorTissue sensorOrganelle sensorDNA/RNA sensorMicrobial sensorMolecular imprinted biosensor图图 1-3 生物传感器分类生物传感器分类类型类型器件分类法器件分类法光生物传感器光生物传感器电导电导/阻抗生物传感器阻抗生物传感器声波生物传感器声波

17、生物传感器热生物传感器热生物传感器电化学生物传感器电化学生物传感器半导体生物传感器半导体生物传感器悬臂梁生物传感器悬臂梁生物传感器Optical biosensorCalorimetric biosensorAcoustic wave biosensorConductive/impedance biosensorElectrochemical biosensorSemiconduct biosensorCantilever biosensor根据生物传感器的特性还有其他的命名或分类尺寸尺寸微型生物传感器微型生物传感器(micro biosensor)纳米生物传感器纳米生物传感器(nano bi

18、osensor)亲和生物传感器亲和生物传感器Affinity biosensor免疫传感器免疫传感器酶酶PZ生物传感器生物传感器SPR生物传感器生物传感器凡以分子间特异识别凡以分子间特异识别并结合的生物传感器并结合的生物传感器滋味传感器滋味传感器能够同时测定两种以能够同时测定两种以上指标的生物传感器上指标的生物传感器多功能传感器多功能传感器Multifunctional biosensor嗅觉传感器嗅觉传感器鲜度传感器鲜度传感器血液成分传感器血液成分传感器两种以上不同的分子识别元两种以上不同的分子识别元件组成的生物传感器或采用件组成的生物传感器或采用两种或多种反应原理构成两种或多种反应原理构成

19、杂合生物传感器杂合生物传感器Hybridized biosensor多酶传感器多酶传感器酶酶-微生物杂合传感器微生物杂合传感器电化学电化学-热生物传感热生物传感器器 对于个别生物传感器的命名对于个别生物传感器的命名,一般采用一般采用“功能功能+构成特征构成特征”的方法，的方法，比如：葡萄糖氧化酶电极，谷氨酸脱氢酶电极，比如：葡萄糖氧化酶电极，谷氨酸脱氢酶电极，BOD微生物电极，葡萄微生物电极，葡萄糖酶光纤传感器等。糖酶光纤传感器等。1.4 生物芯片生物芯片生物芯片biochip芯片实验室芯片实验室分析生物芯片分析生物芯片DNA芯片芯片蛋白质芯片蛋白质芯片多肽芯片多肽芯片其他芯片其他芯片lab

20、on chip生物计算机芯片生物计算机芯片蛋白质计算机芯片蛋白质计算机芯片DNA计算机芯片计算机芯片biocomputeranalytical biochip图图 1- 4 生物芯片基本类型生物芯片基本类型生物计算机芯片的出现源于对传统的硅芯片计算机的发展前景的忧虑。生物计算机20世纪80年代中期开始研制，最大的特点是采用了生物芯片。生物芯片生物芯片由基因技术产生的智能蛋白质分子构成；在这种芯片中信息以波的形式传播；其运算速度比当时最好的计算机快10万倍； 能量消耗仅相当于普通计算机的1/10；拥有巨大的储存能力；能自动修复芯片发生的故障。分析生物芯片伴随人类基因组计划的诞生和发展。解码含大约

21、30亿个核苷酸的人类基因组，需要强大的DNA序列分析能力。DNA序列分析方法迄今都基于英国剑桥大学Sanger教授的酶法。1989 E. Southern 专利：分析多聚核苷酸序列。描述了如何在固相载体（如玻片）上通过DNA杂交来对样品DNA序列进行测定，称为杂交测序( sequencing by hybridization, SBH)。此方法可以用于点突变分析、基因组指纹、连接分析、mRNA表征、 mRNA类群分析和核酸序列分析。1988 Andrei D. Mirzabekov 论文：利用寡核苷酸对DNA测序的新方法；1991 改良杂交测序芯片。这些早期的报道开创了基因芯片研究领域。基因组

22、学、遗传学基因组学、遗传学18%技术方法技术方法28%基因表达基因表达17%疾病诊断疾病诊断9%病原检测病原检测8%8%综述、评论综述、评论13%13%药物筛选和研究药物筛选和研究3%3%序列分析序列分析3%其他其他1%图 1-5 DNA芯片的应用领域( 从SCI-Expanded 和CCR-Expanded数据库统计，截止2004年4月共294篇) 芯片实验室是另一类生物芯片，有时被称为主动式生物芯片。科学家们芯片实验室是另一类生物芯片，有时被称为主动式生物芯片。科学家们试图将生物化学分析的整个过程缩微到芯片上，通过微细加工工艺制作的微试图将生物化学分析的整个过程缩微到芯片上，通过微细加工工

23、艺制作的微滤器、微分离器、微反应器、微泵、微阀门、微电极等，实现对生物样品从滤器、微分离器、微反应器、微泵、微阀门、微电极等，实现对生物样品从制备、分离、生化反应到检测和分析的全过程，从而极大地缩短检测时间和制备、分离、生化反应到检测和分析的全过程，从而极大地缩短检测时间和分析时间，并节省实验材料。分析时间，并节省实验材料。 生物芯片是一类在微小基片上，利用微加工技术、生物技术或化学合生物芯片是一类在微小基片上，利用微加工技术、生物技术或化学合成技术制作的具有一定分析、检测、储存或计算功能的微型生物器件。成技术制作的具有一定分析、检测、储存或计算功能的微型生物器件。1.5 生物传感器的商品开发

24、1.5.1 市场值2001-2003 全球生物传感器销售额50亿美元2003 全球生物传感器销售额73亿美元(应用领域包括医学、生物防范、食品与饮品、环境、生物/药物研究)2007 全球生物传感器的市场总值将达108亿美元商品化的生物传感器主要有5种类型： 酶电极生化分析仪 BOD测定仪 手持式血糖测定仪 SPR分析仪 各类生物芯片1.5.2 酶电极生化分析仪 1972-1975年美国 Yellow Springs 仪器公司在Clark酶电极的基础上研制出第一个商品葡萄糖分析仪(YSI Glucose Analyer Model-23)。 YS2300乳酸分析仪 YS2700 SELECTTM

25、 系列生化分析仪 YS2710 自动分析24份样品 YS2710 在线分析(on line analysis)1.5.3手持式血糖测定仪 1987年英国MediSense公司开发出第一个手掌型和笔型血糖测定仪Exac TechTM 我国有30种手持式血糖测定仪,年销售额已近10亿美元.1.5.4 SPR分析仪 1990年瑞典Pharmacia公司基于 SPR生物传感器原理的生物分子相互作用开发BIACore分析仪.1.6 发展趋势 1) 电化学生物传感器和光生物传感器(荧光,生物发光和化学发光),两类传感器占主流. 2)上升趋势型:生物芯片,分子印迹/模拟传感器,表面等离子体(SPR)生物传感

26、器 稳定发展型:光生物传感器和压电生物传感器. 下降趋势型: 热生物传感器报道很少,电化学生物传感器的比例下降 3)20032004年发表论文数量顺序:电化学生物传感器光生物传感器生物芯片压电生物传感器半导体生物传感器表面等离子体生物传感器热生物传感器 另外,分子生物学和基因工程方法在生物传感器研究中逐步获得应用生物传感器的发展趋势: 1) 更加灵敏、准确、快速和简便是分析科学技术发展趋势的共同特征。 2) 生物芯片使高通量、多参数的同步测定成为可能 3) 挑战性需求包括体内测定、细胞内测定、单分子分析、在线测定等。为了满足这些要求，基因技术，纳米技术，各种单分子荧光技术，仿生技术或生物模拟技

27、术得到发展。 生物体本身就是各种精巧生物传感器的汇集体,其结构的精密程度和完善的功能都是迄今任何人工传感器所不能比拟的.美国Oak Bridge 国家实验室提出感知化学和生物试剂的生物报告(bioreporter)技术. 其基本原理是将能够产生光学信号或其他信号的报告基因与启动子promoter顺序克隆,当细胞环境中有被分析物存在时,细胞启动子受激启动报告基因的转录,然后利用细胞的整套翻译机制译成报告蛋白质,并产生可以检测的信号.启动子启动子转录转录mRNA翻译翻译报告蛋白报告蛋白分析物分析物信号信号图图1-7 完整细胞或生物体传感过程模式图解完整细胞或生物体传感过程模式图解当生物体与特异的分

28、析物接触时当生物体与特异的分析物接触时,启动子启动子/报告基因复合物被转报告基因复合物被转录成信使录成信使RNA(mRNA), 然后翻译成报告蛋白质然后翻译成报告蛋白质,最终形成响应最终形成响应信号信号在生物传感发展进程中，我们只不过刚刚结束在黑暗中摸索，开始在阳光下耕作沃土Clark第二章 分子识别元件及其生物反应基础2.1 概述 生物传感器的分子识别元件又称敏感元件，主要指来源于生物体的生物活性物质，包括酶、抗原、抗体和各种功能蛋白质、核酸、微生物细胞、细胞器、动植物组织等。当它们用作生物传感器的敏感元件时，都无一例外地具有对靶分子（待检测对象）特异的识别功能。本章主要内容酶反应微生物反应

29、免疫学反应核酸反应催化抗体催化核酸生物反应中伴随着发生的物理量变化2.2 酶及酶反应2.2.1 酶反应基本概念一) 酶的定义 酶(enzyme)是细胞产生的、以蛋白质为主要成分、能加快反应速率、并且具有催化专一性的生物催化剂。 酶是活细胞产生的一类具有特殊三维空间构象的功能化蛋白质。生物体内代谢过程中发生的化学反应绝大多数是在酶的催化下进行的，酶的存在是在生物体进行新陈代谢的必要条件。 酶具有催化剂的共性： 可以降低生化反应的活化能，使活化分子数大大增加，故少量的酶即可大大加快反应的速度。 只改变反应速度而不改变反应的平衡点，即酶加速达到平衡而不改变平衡的位置，它不能催化热力学上不能进行的反应

30、。 酶参加生化反应前后无变化，故可重复使用，因而具有化学放大的功能。 二) 酶的蛋白质性质 酶都是蛋白质，或者以蛋白质为主要成分。主要证据：酶都是蛋白质，或者以蛋白质为主要成分。主要证据：1)蛋白质是氨基酸组成的，而酶的水解产物都是氨基酸，酶也是蛋白质是氨基酸组成的，而酶的水解产物都是氨基酸，酶也是由氨基酸组成的。由氨基酸组成的。2)酶具有蛋白质所具有的颜色反应。酶具有蛋白质所具有的颜色反应。3)一切能使蛋白质变性的因素，如热、酸、碱、紫外线等，同样一切能使蛋白质变性的因素，如热、酸、碱、紫外线等，同样可以使酶变性失活。可以使酶变性失活。4)酶同样具有蛋白质所具有的大分子性质，如不能透过半透膜

31、，酶同样具有蛋白质所具有的大分子性质，如不能透过半透膜，可以电泳，并有一定等电点。可以电泳，并有一定等电点。三) 酶的催化性质 酶是生物催化剂，与一般催化剂相比较有如下特点：酶是生物催化剂，与一般催化剂相比较有如下特点： 1) 高度专一性高度专一性( specification)，或称特异性。或称特异性。“一种酶，一种底物一种酶，一种底物” 2) 催化效率高。以分子比为基础，其催化效率是其他催化剂的催化效率高。以分子比为基础，其催化效率是其他催化剂的1071013倍。 3) 酶是蛋白质，遇高温、酸碱容易失活，酶催化一般在温和条件下进行。 4) 有些酶(如脱氢酶)需要辅酶或辅基，若辅助成分除去，

32、则酶不表现催化活性。 5) 酶在体内的活力常常受多种方式调控，包括基因水平调控，反馈调节，激素控制，酶原激活等。 6) 酶促反应产生的信息变化有多种形式，如热、光、电、离子化学等。四) 酶的分类与命名 1955年,国际酶学委员会(International Commission on Enzymes, EnzymeCommission, EC)成立,解决酶的命名问题. 1964年,EC定了酶分类的标准,按照酶的催化反应类型,将酶分为六大类: 1) 氧化还原酶类(oxidoreductases) A2H + B A+B 2H 包括氧化酶,过氧化物酶,脱氢酶等 2) 转移酶类(transferas

33、es):催化某一化学基团从某一分子到另一分子 A B + C A+B C B为被转移的基团,如磷酸基,氨基,酰胺基.包括转氨酶,转甲基酶等 3) 水解酶类(hydrolases):催化水解反应,在底物特定的键上引入水的羟基和氢 A B + H2O AOH+BH 包括肽酶(即蛋白酶,水解肽键),酯酶(水解酯键),糖苷酶(水解糖苷键)等 4) 裂合酶类(lyases):催化C-C, C-O, C-N, 或C=S键裂解或缩合 AB A+B 如脱羧酶,碳酸苷酶 5) 异构酶类(isomerases)使底物分子内发生重排 A A 6) 合成酶类(ligases)或称连接酶类,它催化两个分子的连接,并与腺

34、苷三磷酸(ATP)的裂解偶联,同时产生腺苷单磷酸(AMP)和焦磷酸(PPi) A + B + ATP AB + AMP + Ppi 如氨基酸激活酶类 在每一大类中都有若干亚类,每个亚类可再分成若干亚亚类,每个亚亚类包括若干种具体的酶,每一种酶在国际系统分类中的位置用特定的四个数字组成的编号表示.酶学编号(EC number) 由4个数字构成,如脂肪酶(甘油酯水解酶)的系列编号为“EC 3.1.1.3”,表示第三大酶类(水解酶),第一亚类(水解发生在酯键),第一亚亚类(羟基酯水解),甘油酯水解酶.五) 酶量表示法 酶活力单位用国际单位(International Unit, IU)表示.一个酶活

35、力单位指在特定条件下(如25,pH及底物等其他条件采用最佳条件),在1min能转化1mol底物分子的酶量,单位为IU. 酶比活力(specific activity)指1mg酶所具有的酶活力,一般用IU/mg表示.比活性高,说明酶的纯度高. 酶含量指每克或每毫升酶制剂含有的活力单位数,即IU/g或IU/ml.2.2.2 酶的作用机理一) 降低反应活化能 酶的构象对底物分子显示分子识别能力，可作为一种催化剂，加速反应的进程，这样的反应称为酶促反应。酶可以使反应至少加速100万倍。酶对应的加速是通过酶与底物结合形成复合物以降低反应的活化自由能实现的。这种复合物的形成为反应提供了一条新的途径，它的过

36、度态能量要比没有酶条件下相应所需要的能量低的多。 反反应应活活化化能能AA*G2G1GB时间时间图2-1 酶对反应活化能的影响无酶掺入是活化能为G1,酶催化时降为G2,但反应的自由能变化G保持不变,B为反应生成产物分子的能量状态A 初态( initial)A*活化态,过度态 (transition state)G1活化能(energy of activation)活化能:在一定温度下,1 mol底物全部进入活化态所需要的自由能F (free energy),单位是 J/mol.酶的高效催化活性来源于以下几个方面： 1)张变、扭曲效应。进行酶反应时，底物先与酶形成酶-底物复合物，由于互补不甚精确

37、，从而导致底物产生某种张变、扭曲，使基态底物转变为过度态构象，降低活化能，加快反应速度。 2)酸碱催化。酶分子中具有各种酸性或碱性氨基酸侧链，酸碱催化通过瞬时向反应物提供质子或从反应物中汲取质子，以稳定过渡态，加速反应。 3)亲核、亲电子催化。在催化时，亲核催化剂或亲电子催化剂能分别放出电子或汲取电子并作用底物的缺电子中心或负电中心，迅速形成不稳定的共价复合物，降低反应自由能，加速反应。 4)多元催化和协同效应。酶分子是一个拥有多种不同侧链基团组成活性中心的大分子，这些基团在催化过程中根据各自的特点发挥不同的作用。而酶的催化作用则是一个综合结果，是通过这些侧链基团的协同作用共同完成的。二)结构

38、专一性 酶催化的专一性是由酶蛋白分子(尤其是分子中的活性部分)结构特性决定的对底物专一性程度的不同专一性较低族专一性键专一性对底物的化学键及一端有要求对底物的化学键有要求仅对一种物质催化对底物的化学键及两端有要求立体专一性对底物的化学结构和立体有要求三)酶的辅助因子(co-factor) 酶需要辅助因子才能行使催化功能.辅助因子包括金属离子和有机化合物,它们构成酶的辅酶(co-enzyme)或辅基(prosthetic group),与酶蛋白共同组成全酶(holoenzyme)。脱去辅基的酶蛋白不含有催化活性，称为脱辅基酶蛋白(apoenzyme)，有时又称为酶原(proenzyme, zym

39、ogen). 辅酶与酶蛋白松弛结合，可以通过透析法除去：辅酶A辅基与酶蛋白牢固结合：金属离子铁卟啉(亚铁血红素，heme) 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NADH四）酶的活性中心(active center) 酶的特殊催化能力只局限在它的大分子的一定区域,这个区域就是酶的活性中心,它往往位于分子表面的凹穴中。 酶酶不需要辅酶需要辅酶活性中心是酶分子中在三维结构上活性中心是酶分子中在三维结构上比较靠近的几个氨基酸残基组成比较靠近的几个氨基酸残基组成辅酶分子或辅酶分子上的某一部分结构辅酶分子或辅酶分子上的某一部分结构往往就是活性中心的组成部分往往就是活性中心的组成部分 活性中心的各基团与附近的其他残基有序

40、的排列,使得这个部位的空间结构恰好适合与底物分子直接紧密接触,并具有适宜的非极性微环境,以利于基团间发生静电作用. 一般认为活性中心有两个功能部分: 结合域(binding domain):参与同底物结合,决定酶促反应的专一性 催化域(catalytic domain):直接进行催化,决定酶的催化效率五)“邻近”效应、“定向”效应 “邻近”(Vicinity)效应指两个反应分子的反应基团需要互相靠近才能反应。 但是，仅仅“邻近”还不够，还需要两个将要反应的基团分子轨道交叉，而交叉的方向性极强，称为“定向”(orientation)。这样就使得两个分子间的反应变为分子内的反应，提高了反应速率。

41、生物体系中的许多反应属于双分子反应，在酶的作用下，原游离存在的反应物分子被结合在活性中心，彼此靠得很近，并且分子轨道也按确定的方向发生一定的偏转，使得反应易于进行。有人估计， “邻近”效应及“定向”效应可能使反应速度增长上亿倍。 六）诱导契合假说 活性中心通常为一个口袋或裂缝，由周围的氨基酸链帮助结合底物，而其他的氨基酸直接参与催化反应。 1894年，德国生物化学家E. Fishcher提出“锁-钥假说” (lock-and-key hypothesis)，即酶与其特异性底物在空间结构上互为琐-钥关系。 1958年,D.Koshland提出诱导契合假说(induced fit hypothes

42、is):底物底物酶酶酶酶-底物复合物底物复合物底物底物酶酶底物变形底物变形酶分子变形酶分子变形七）酶催化的化学形式 酶催化的化学形式主要包括共价催化和酸碱催化。 在共价催化中，酶与底物形成反应活性很高的共价中间物，这个中间物很易变成过渡态(transition state),故反应的活化能大大降低，底物可以越过较低的能阈而形成产物。 酸碱催化广义的指质子供体及质子受体的催化。酶反应中的酸碱催化十分重要，发生在细胞内的许多反应都是受酸碱催化的。 酶蛋白中可以起酸碱催化作用的功能团有氨基、羧基、巯基、酚羟基及咪唑基等。2.2.3 酶促反应的米氏动力学 底物浓度对酶促反应速度的影响比较复杂，将反应初

43、速度对底物浓度S作图：Vm 1/2VmKMS图2-4 酶反应速度与底物浓度的关系1 1、底物浓度低时，反应速度随底物浓度的、底物浓度低时，反应速度随底物浓度的增加呈线性增长，表现为一级反应。增加呈线性增长，表现为一级反应。2 2、随着底物浓度的增加，反应速度增高趋、随着底物浓度的增加，反应速度增高趋缓，表现为混合反应。缓，表现为混合反应。3 3、再继续加大底物浓度，反应速度趋向一、再继续加大底物浓度，反应速度趋向一个极限，近似零级反应，说明酶已被饱和，个极限，近似零级反应，说明酶已被饱和，这是酶促反应特有的现象。这是酶促反应特有的现象。 Michaelis和和Menten首先提出酶促反应中存在

44、着酶首先提出酶促反应中存在着酶- -底物中间底物中间复合物，并将酶促反应过程表示为：复合物，并将酶促反应过程表示为： E + S ES E + P (2-7) 从这一理论出发，根据化学平衡原理，推导出表示底物与反从这一理论出发，根据化学平衡原理，推导出表示底物与反应浓度与反应速度之间的关系方程式：应浓度与反应速度之间的关系方程式： 这就是米氏方程这就是米氏方程( Michaelis equation ).式中，式中，Vm为最大反应速度，为最大反应速度， KM为米氏常数为米氏常数(Michaelis constant ).根据规定，米氏常数是根据规定，米氏常数是(2-7)中三个解离常数的复合函数

45、：中三个解离常数的复合函数： KM=(k1+k2)/Kcatk1k2K Kcatcat = VmS/(KM+S) 米氏常数在数值上等于酶促反应速度达到最大速度一半(1/2VM)时的底物浓度，单位为mol/L或mg/L，是酶的重要特征常数，它可以通过将米氏方程变换成双倒数方程实验求得。 对于KM，还可以作如下分析： 1)一定条件下，酶的KM是常数。对不同来源的酶，比较其KM，可确定哪些酶是同种酶，哪些酶是同工酶(催化作用相同，但性质或构造不同的酶)。 2)KM受pH与温度等环境因素的影响，在不同环境条件下求出KM，可探索环境对KM乃至对酶活性的影响。 3)如果酶作用底物有几种，则最小KM(也有用

46、最小Vm/KM比值)表示底物与酶的最适底物或天然底物。 4)从酶的KM可粗略估计细胞内底物浓度变动范围，一般来说，底物浓度不会比KM高出太多。 5)从KM与米氏方程式，可以求出达到规定反应速度的适当的底物浓度，或已知底物浓度下相应的反应速度。理论上，若是达到最大反应速度，底物浓度至少要20 KM。浓浓度度0SPEtESE反应时间反应时间稳态前(ES形成)稳态期(ES几乎稳定)图2-5 酶动力学温态期反应物质浓度变化稳态假说The Steady-State Assumption 催化常数Kcat(catalytic constant)是酶动力学的第二个重要常数,用来直接描述酶分子活力:在最适合的

47、底物浓度下,每摩尔酶每分钟将底物浓度转变为产物的底物的摩尔数(或有关基因的当量数). Kcat越大,在酶分子表面的催化事件发生越快,即催化效率高. Kcat的单位是s-1,因此, Kcat的倒数可以被看作是时间(s),即一个酶分子转换一个底物分子所需要的时间,故Kcat有时被称为转化数(turnover number).影响酶促反应的因素 影响酶促反应的因素很多，除了酶和底物的性质，还有酶的抑制剂、温度、pH值、酶的活性和底物浓度等。 1)抑制剂 永久性(不可逆):不可逆抑制剂的结合位点通常与底物的结合位点不同，它是通过分解酶与底物的复合物来抑制反应物的生成，因此这种抑制不能通过加过量的底物来

48、消除。可用化学方法除去抑制剂，使酶复活。 暂时性(可逆)：是抑制剂和酶很快达成平衡。由于酶和抑制剂的结合是可逆的，所以可逆抑制剂可以被大浓度的正常底物所取代。 2)温度 温度主要影响酶的稳定性。它导致酶的构象变化而影响酶和底物的结合，而降低酶促反应的最大反应速度。通常在4下保存。 3)3)pHpH pH对酶促反应的影响：使酶的空间结构破坏，引起酶的失活；影响酶活性部位催化基团的解离状态，使底物不能分解为产物；影响酶活性部位结合基团的解离状态，使其不能与底物结合；影响底物的解离状态，使底物不能和酶结合，或结合后不能生成产物。2.3微生物反应2.3.1微生物反应的特点 微生物反应过程是利用微生物进

49、行生物化学反应的过程,就是将微生物作为生物催化剂进行的反应.酶在微生物反应中起最基本的催化作用. 微生物反应与酶促反应的共同点: 1)同属生化反应,都在温和条件下进行; 2)凡是酶可以催化的反应,微生物也可以催化; 3)催化速度接近,反应动力学模式近似. 微生物反应的特殊性: 1)微生物细胞的膜系统为酶反应提供了天然的适宜环境,细胞可以在相当长的时 间内保持一定的催化活性; 2)在多底物反应时,微生物显然比单纯酶更适宜作催化剂; 3)细胞本身能提供酶促反应所需要的各种辅助因子和能量; 4)微生物细胞比酶的来源更方便、更便宜. 微生物作为传感器分子识别元件时不利因素： 1)微生物反应通常伴随细胞

50、的生长和调亡，不易建立分析标准； 2)细胞是多酶系统，许多代谢途径并存，难以排除不必要的反应； 3)环境变化会引起微生物生理状态的复杂化,不适当的操作会导致代谢转换现象, 出现不期望有的反应.2.3.2微生物反应类型1)同化与异化 (根据微生物代谢流向) 同化作用(assimilation)或组成代谢: 细胞将底物摄入并通过一系列生化反映转变成自身的组成物质,并储存能量. 异化作用(disassimilation)或分解代谢:细胞将自身的组成物质分解以释放能量或排出体外. 2)自养与异养 (根据微生物对营养的要求) 自养(autotrophic):自养微生物的CO2作为主要碳源,无机氮化物作为

51、氮源,通过细菌的光合作用或化能合成作用获得能量. 异样(heterotrophic):异养微生物以有机物做碳源,无机物或有机物作氮源,通过氧化有机物获得能量. 绝大多数微生物种类都属于异养型.3) 好气性与厌气性 (根据微生物反应对氧的需求与否) 好氧(aerobic)性微生物:在有空气的环境中才易生长繁殖的微生物. 厌氧(anaerobic)性微生物:必须在无分子氧的环境中生长繁殖的微生物.4)细胞能量的产生与转移 微生物反应所产生的能量大部分转移为高能化合物. 高能化合物是指含转移势高的基团的化合物,其中以ATP最为重要,它不仅潜能高,而且是生物体能量转移的关键物质,直接参与各种代谢反应的

52、能量转移. 有两类反应可以产生ATP.2.3.3分析微生物学 分析微生物学(analytical microbiology)是利用微生物完成定量分析任务的学科.有些情况下,微生物测定法比化学方法更专一和灵敏,效率亦更高. 细胞增殖和呼吸法最常用. b2.4 免疫学反应 免疫指机体对病原生物感染的抵抗能力. 自然免疫是非特异性的,即能抵抗多种病原微生物的损害. 获得性免疫是特异性的,在微生物等抗原物质刺激后才形成(免疫球蛋白等),并能与该抗原起特异性反应.2.4.1抗原1)抗原的定义:抗原(antigen)是能够刺激动物机体产生免疫反应的物质,但从广义的生物学观点看,凡是具有引起免疫反应性能的物

53、质,都可称为抗原. 抗原有两种性能:刺激机体产生免疫应答反应 免疫原性(immunogenicity) 完全抗原(complete antigen,Ag)与相应免疫反应产物发生特异性结合反应 反应原性(reactionogenicity)半抗原(hapten)2)抗原的种类 按抗原物质的来源,抗原分为三类: (1) 天然抗原 (2) 人工抗原 (3) 合成抗原3)抗原的理化性质(1)物理性状 分子质量对免疫原性的影响: 分子质量越大抗原性越强,原因在于复杂的大分子物质表面抗原决定族较多,化学性质相对稳定,在体内存留时间长,降解和排除速率较慢,有利于持续刺激肌体免疫系统,产生免疫应答. 抗原构型

54、对免疫原性的影响:环壮构型直线构型 聚合态分子单体分子(2)化学组成 绝大多数为蛋白质,可为纯蛋白质,也可为结合蛋白质4)抗原决定簇(antigen determinant) 抗原决定簇是抗原分子表面的特殊化学基团，抗原的特异性取决于抗原决定簇的性质、数目和空间排列。.4.2抗体抗体(antibody)是由抗原刺激机体产生的具有特异性免疫功能的球蛋白，又称免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)。人类免疫球蛋白有五类，即IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。图-免疫球蛋白(Ig)结构模式图重链(heavy chain,H链): 分子质量较大,420-460个氨基酸组成轻链(ligh

55、t chain,L链): 分子质量较小,213-216个氨基酸组成SSSSSSC 端N端L链H链C区区抗原结合区抗原结合区V区区2.4.3抗原-抗体反应 抗原抗体的相互作用是所有免疫化学技术的基础.它们之间的反应是指抗原与抗体之间发生的特异性结合反应.这种反应可发生于体内(in vivo),也可发生在体外(in vitro).体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用;体外反应则根据抗原的物质性状、抗体的类型及反应的特点而分为凝聚、沉淀、溶解反应等不同的类型。 抗体与抗原的特异性结合点位于Fab L链及H链的高变区(抗体活性中心),其构型取决于抗原决定簇的空间位置,两者可形成互补性构型.

56、抗原、抗体结合时准确对位的两个条件： 结合部位的形成要互补于抗原的形状 抗体活性中心带有与抗原决定簇相反的电荷 抗体的特异性是相对的，表现在： 部分抗体不完全与抗原决定簇相对应 即便是针对某一种半抗原的抗体，其化学结构也可能不一样 抗原抗体结合在一定pH或离子强度下也是可逆的。基于抗原-抗体反应的检测技术主要应于以下几个方面：1)用已知抗原检测未知抗体2)用已知抗体检测未知抗原3)定性或定量检测体内各种大分子物质4)用已知抗体检测某些药物、激素等各种半抗原物质影响抗原-抗体结合反应的因素1)抗原抗体的性质:抗原-抗体反应的整体强度受3个因素控制:抗体对表位的内在亲和力,抗原抗体的结合价以及参与

57、反应成分的立体结构.2)电解质:抗原抗体发生特异性结合后,由亲水性胶体变为疏水性胶体,电极质的存在会使抗原-抗体复合物失去电荷而沉淀或凝集,出现可见反应.3)酸碱度:蛋白质具有两性电离的性质,抗原抗体的反应必须在合适的pH环境中进行.4)温度:一般在37,高温抗原抗体变性,低温反应太慢.2.4.4免疫学分析 免疫分析是利用抗体与抗原的特异性结合作用来选择性识别和测定可以作为抗体或抗原的待测物.抗原-抗体反应的特异性和专一性决定了免疫反应具有很高的选择性. 1)沉淀法 可溶性抗体与其相应的抗原在液相中相互接触,可形成不溶性抗原-抗体复合物而发生沉淀,包括扩散实验和电泳试验,此为经典的免疫学实验,

58、灵敏度水平为g/ml. 2)放射免疫测定法(radiation immunoassay, RIA) 利用放射性同位素示踪技术和免疫化学技术结合起来的方法,灵敏度高,特异性强,准确度高,重复性好;同位素危害 3)免疫荧光测定法(immuno fluorescent assay) 高度的特异性和敏感性,可定位serum carcinoembryonic antigen (CEA)4)酶联免疫测定法(enzyme linked immunoassay, ELISA) 用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应. 灵敏度不高,但是特异性,重现性和准确性很好,成本低,稳定性好和操作安全等,应用最广. 酶免

59、疫分析主要有两种:夹心法和竞争法. 夹心法要求抗原至少有两个结合点,不能用于检测半抗原,多用于测定大分子物质.产生的信号强度与结合在固相上的抗原量成比例关系.EEE固体抗原固体抗原待检抗原待检抗原酶标记抗体酶标记抗体底物底物酶促反应酶促反应检检测测夹心法测抗原示意图夹心法测抗原示意图 竞争法产生的信号强度与结合在固相上的酶标抗体量成正比例关系,与样品中的抗原量成反比关系.主要用于测定小分子抗原.EEEE+EEE检检测测竞争法测抗原示意图 5)电化学免疫分析(electrochemistry immunoassay, ECIA) 电化学免疫分析是将免疫技术和电化学检测相结合的一种标记免疫分析方法

60、. 用作电化学免疫分析的生物酶及反应体系须满足以下条件: 酶具有高或性,可在短时间内将大量底物分子转化为产物;产物具有电化学或性;酶底物和酶在缓冲溶液中稳定;酶产物的副反应很少;容易与抗体或抗原结合,且不降低活性;在测定条件下体系底物非活性.2.5核酸与核酸反应2.5.1核酸组成与结构 1)核酸的组成成分 核酸是所有生命体的遗传信息分子,包括脱氧核糖核酸(DNA, deoxyribonucleic acid)和核糖核酸(RNA, ribonucleic acid). 两类核酸都是由单核苷酸(nucleotide)组成的多聚物.核酸分子中的核苷序列组成密码,其功能是储存和传输遗传信息,指导各类型

61、蛋白质的合成. 单核苷酸的组成: 碱基,脱氧核糖或是核糖,磷酸基团 腺嘌呤腺嘌呤(adenine,A),鸟嘌呤鸟嘌呤(guanine,G)胞嘧啶胞嘧啶(cytosine,C), 胸腺嘧啶胸腺嘧啶(thymine,T)DNADNA的碱基组成的碱基组成 ChargaffChargaff规则的内容规则的内容. 所有所有DNADNA：A=TA=T、G=CG=C，即，即A+G=T+CA+G=T+C. DNA DNA的碱基组成具有种的特异性，的碱基组成具有种的特异性，即不同种的即不同种的DNADNA碱基组成不一样碱基组成不一样. 对同一生物物种，对同一生物物种，DNADNA的碱基组成的碱基组成没有组织和器

62、官的特异性没有组织和器官的特异性. DNADNA的碱基组成不随年龄、营养状况及的碱基组成不随年龄、营养状况及环境的改变而改变环境的改变而改变 ChargaffChargaff规则的意义规则的意义该规则为后来建立该规则为后来建立DNADNA双螺旋结构模型奠定的基础，并为双螺旋结构模型奠定的基础，并为阐明阐明DNADNA的生物学功能提供了重要依据。的生物学功能提供了重要依据。2) DNA结构 一级结构: 脱氧核苷酸在长链上的排列顺序 二级结构: 双螺旋链(碱基配对规则) 氢键(最主要的力) 维持双螺旋链稳定因素: 碱基堆积力(van der Waals) 分子内部碱基对间的疏水键Watson和和C

63、rick于于1953年根据年根据DNA晶体的晶体的X-射线衍射射线衍射图谱和图谱和Chargaff规则等数据提出规则等数据提出双螺旋结构双螺旋结构。一级结构一级结构二级结构:B型A型C型Z型:左旋不同构象只是螺距、直径、每圈含碱基数目不同3) RNA 结构 RNA在细胞中主要以单链形式存在,可暂时形成双螺旋,或自折叠成双螺旋区域.尿嘧啶尿嘧啶(uracil,U)2.5.2 DNA变性(denature) 核酸的紫外吸收特性核酸的紫外吸收特性 DNADNA在在260260nmnm处有最大的紫外吸收值处有最大的紫外吸收值因嘌呤碱和嘧啶碱对因嘌呤碱和嘧啶碱对250250280280nmnm的光波有强

64、的吸收作用，对的光波有强的吸收作用，对260260nmnm光波的光波的吸收能力最大。吸收能力最大。当核苷酸摩尔数相同时，当核苷酸摩尔数相同时，A260A260的大小有如下关系：的大小有如下关系：单核苷酸单核苷酸 单链单链DNA DNA 双链双链DNA DNA 从从左到右称为左到右称为减色效应减色效应(hypochromism), 从右到左称为从右到左称为增色效应增色效应(hyperchromic effect)。 DNADNA的双螺旋结构比双螺旋松驰结构对紫外的双螺旋结构比双螺旋松驰结构对紫外(260(260nm)nm)的吸收要小，最大可的吸收要小，最大可降低约降低约34%34%。因为。因为D

65、NADNA双螺旋结构中的碱基对彼此之间又形成了碱基堆积力，双螺旋结构中的碱基对彼此之间又形成了碱基堆积力，影响了碱基对影响了碱基对260260nmnm光的吸收。当光的吸收。当DNADNA双螺旋松散后，所得的光吸收值几乎是双螺旋松散后，所得的光吸收值几乎是其组成中所有碱基光吸收值的总和。其组成中所有碱基光吸收值的总和。 DNA的紫外吸收特性的应用 估计核酸样品的纯度 一般：A260/A2801.82.0，DNA纯度符合要求 A260/A2802.0,提示DNA样品中含有RNA 实质破坏了核酸的空间结构，但不涉及一级结构(共价键）的断裂。 引起变性的因素加热（热变性）、介质中的pH过低或过高、加入

66、有机溶剂、加入尿素等介质中的pH过酸或过碱对DNA双螺旋结构的影响：过量酸使A、G、C上的氮原子质子化，不利于氢键形成；过量碱使G、T上的氮原子去质子化，亦不利于氢键形成。高温时DNA双链会分离,称为解链(melting).当温度返回常温时,DNA或RNA能够重新回到天然结构,称为复性(annealing).当光吸收强度增加到最大值的一半时,所对应的温度称为解链温度(melting temperature), Tm.2.5.3核酸分子杂交 定义定义应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的DNA（或（或RNA）片断按碱基互补关系形成杂交双链分子，这

67、一过程片断按碱基互补关系形成杂交双链分子，这一过程称为称为核酸的分子杂交核酸的分子杂交。杂交的两条链杂交的两条链一条是待测的单链的核酸分子，如克隆的基因片断、一条是待测的单链的核酸分子，如克隆的基因片断、PCR产物、产物、基因组基因组DNA或细胞总或细胞总RNA等。等。另一条可以是探针另一条可以是探针 核酸探针核酸探针是指特定的已知碱基序列的核酸片断，可以是是指特定的已知碱基序列的核酸片断，可以是DNA、cDNA、mRNA及及RNA等。在现代分子生物学实验中，探针的制等。在现代分子生物学实验中，探针的制备和使用是与分子杂交相辅相成的技术手段。备和使用是与分子杂交相辅相成的技术手段。意义意义 核

68、酸杂交是核酸研究中一项最基本的实验技术。该技术在分子核酸杂交是核酸研究中一项最基本的实验技术。该技术在分子生物学研究领域中被广泛应用，如用于基因组中特定基因序列的生物学研究领域中被广泛应用，如用于基因组中特定基因序列的定性和定量检测、基因突变分析以及某些遗传性疾病（如地中海定性和定量检测、基因突变分析以及某些遗传性疾病（如地中海贫血、血友病、苯丙酮酸尿症等）的诊断。贫血、血友病、苯丙酮酸尿症等）的诊断。2.5.4核酸功能 一、 DNA功能:DNA是遗传信息的载体,其所携带的信息不仅是安全可靠的,还可以读取和利用,并代代稳定相传.DNA通过三个反应实现上述功能: 自我复制(self applic

69、ation)、自我修复(sefl- repair)和转录(transcription) 成mRNA并随后被翻译(translation)成蛋白质。 DNA 自我复制发生在细胞分裂之前,分三个步骤: 1)在螺旋酶(helicase)的作用下,一部分双链被打开; 2) DNA聚合酶与DNA的一条链结合,并沿3端到5端移动,利用该链为模板,合成一段核酸引链(leading strand),该链重新形成双螺旋链. 3)由于DNA合成只能按5端至3端方向进行,另一个DNA聚合酶也同时与另一条单链结合并进行DNA片段的合成,并有连接酶将这些片段连接起来,形成滞后链(lagging strand). 上面的

70、过程形成两个完全一样的DNA分子，称为复制(replication).复制的DNA分子被均等的分配到两个子细胞，使它们具有完全相同的遗传学信息。 DNA分子的每一条链都是一个模板，所合成的链称为互补(complementary)链。 如果复制过程中发生碱基错配(mismatch)，将发生基因点突变。细胞主要有两道防线防止突变的发生，一个是DNA聚合酶的校正(proof reading)功能，当发生一个碱基错配后， DNA聚合酶的一个亚基将识别并将以切除，以重新进行正确合成；另一个是DNA错配修复系统，有多种模式。它们在DNA复制完成以后，能够对DNA继续进行检查，识别出错配碱基，并将之切除修复

71、。这样就保证了生物遗传的稳定性。 转录过程是将DNA所携带的遗传信息拷贝到短寿命的信使RNA (mRNA)上。步骤如下： 1)DNA被转录部分解螺旋,RNA聚合酶与一条DNA的一条单链结合,该结合部位称为启动子区域(promoter region). 2)RNA聚合酶以所结合的DNA链为模板,合成延伸一段序列互补的RNA链. 3)完全合成的RNA脱离RNA聚合酶/ DNA复合物,并进入细胞质开始参与翻译.2) RNA功能 RNA有信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)三类，以及新近发现的小分子核内RNA(snRNA).分别有自己的功能。nmRNA将DNA所含有

72、的信息转录下来并来到蛋白质翻译机器(核糖体),在此它将直接指导蛋白质的合成.nrRNA是蛋白质合成机器核糖体结构的一部分.真核生物含有4种rRNA,在蛋白质合成中有几种作用:28s rRNA具有催化作用,它构成核糖体60s亚基胎基转移酶活性; 18s rRNA通过识别作用,校正mRNA和肽基化rRNA的位置; rRNA的三维空间结构形成装配整个核糖体的骨架.ntRNA直接将mRNA所转录的DNA信息解码成蛋白质的氨基酸序列.2.6催化抗体( catalytic antibody) 催化抗体也称抗体酶(abzymes),是抗体(antibody)和酶(enzyme)的复合词,是具有催化活性的单克

73、隆抗体.它通常是人工合成物,但也存在于正常人体内和病患者体内.2.7催化性核酸2.7.1 催化性RNA类型与结构催化性RNA具有较弱的裂解和连接酶活性,其催化具有RNA序列选择性顺式剪切(cis-cleaving)反式剪切(trans-cleaving).超二级结构(motif)锤头RNA(hammerhead RNA)发夹RNA(hairpin RNA)组I内含子(group I intron)组II内含子(group II intron)RNA酶P中的RNA组分肝炎-RNA都能切断磷酸二酯键2.7.2催化性DNA(catalytic DNA) 催化性RNA的主要缺点是比较脆弱,容易受核酸酶

74、的攻击而水解.如在双螺旋形成超二级结构域和催化域的某些特殊部位用DNA取代后能改善生物学稳定性. 为了获得能够剪切RNA的DNA序列,一般用体外筛选方法. 无天然存在的催化性DNA,人工合成的催化性DNA是潜在的生物传感器的分子识别元件.2.82.8生物学反应中的物理量变化生物学反应中的物理量变化 1)1)生物反应的热力学：生物反应的热力学：自发反应总伴随着自由能(free energy)的降低,生物学反应过程都伴随热力学变化:分子相转换、分子间相互作用、酶催化反应、微生物细胞反应。2)生物发光(bioluminescence):是由于某些生物体内一些特殊物质(如荧光素)的氧化而产生的现象.3)颜色反应和光吸收:生物反应中的颜色变化包括生物体内产生色素和生物体或酶与底物作用后产生颜色物质两个方面.4)阻抗变化:微生物反应可使培养基中的电惰性物质代谢为电活性产物.当微生物生长和代谢旺盛时,培养基中生成的电活性分子和离子增多,使培养液的导电性增大,阻抗降低;反之,则阻抗升高.