现代生物制药技术.ppt

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1、 生生 物物 制制 药药 技技 术术第二章第二章 基因工程制药基因工程制药第三章第三章 细胞工程制药细胞工程制药第四章第四章 酶工程制药酶工程制药第五章第五章 动植物细胞培养技术制药动植物细胞培养技术制药第六章第六章 生物药物的提取纯化技术生物药物的提取纯化技术第一章第一章 绪论绪论 第一章第一章 绪论绪论第一节第一节 生物制药的概念和内容生物制药的概念和内容生物制药生物制药是指利用生物体或生物过程是指利用生物体或生物过程生产药物的技术。生产药物的技术。分类：分类： 发酵工程制药发酵工程制药 基因工程制药基因工程制药 细胞工程制药细胞工程制药 酶工程制药酶工程制药第二节第二节 生物药物的性质与

2、分类生物药物的性质与分类一一生物药物的性质生物药物的性质 二二优点优点：毒性低、副作用小、疗效可靠。特：毒性低、副作用小、疗效可靠。特异性异性三三 特别要提到的是利用重组特别要提到的是利用重组DNA 技术技术生产生产 的药品，即新生物技术药品，或简的药品，即新生物技术药品，或简称生物新药。称生物新药。四四劣点劣点： 1 成分复杂成分复杂五五 2 不稳定、易变性、易失活不稳定、易变性、易失活六六 3 易为微生物污染、破坏易为微生物污染、破坏七七 4 生产条件的变化对产品质量影响较生产条件的变化对产品质量影响较大大 二二 生物新药的质量保证生物新药的质量保证要点要点：产品的鉴别、纯度、活性、安全性

3、、稳：产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和抑制性。定性和抑制性。鉴定方法鉴定方法电泳方法、免疫学分析方法、受体结合实验、电泳方法、免疫学分析方法、受体结合实验、各种高效液相色谱分析法、肽图分析法、各种高效液相色谱分析法、肽图分析法、Edman N-末端序列分析法、圆二色谱法、核磁末端序列分析法、圆二色谱法、核磁共振法共振法安全性评价安全性评价无病毒、无菌、无热源、无致敏源无病毒、无菌、无热源、无致敏源致突变、致癌和致畸致突变、致癌和致畸 三三 生物药物的分类生物药物的分类1 氨基酸类氨基酸类2 有机酸、醇酮类有机酸、醇酮类3 维生素维生素4 酶及辅酶类酶及辅酶类（1）酶类药物）酶类药物 ：

4、助消化酶类；消炎酶类；：助消化酶类；消炎酶类； 心血管疾病治疗酶；心血管疾病治疗酶； 抗肿瘤酶；抗肿瘤酶； 其他酶类：超氧化物歧化酶其他酶类：超氧化物歧化酶 （SOD） PEG-腺苷脱氨酶腺苷脱氨酶 RNA酶酶（2）辅酶类药物：）辅酶类药物：ATP NAD CoA FAD5 脂类脂类 （1）磷脂类）磷脂类（2）多价不饱和脂肪酸（）多价不饱和脂肪酸（PUFA）和前列腺素和前列腺素（3）胆酸类）胆酸类 （4）固醇类）固醇类 （5）卟啉类）卟啉类6 多肽和蛋白质类多肽和蛋白质类 人体内的生物活性因子，如激素、免疫球蛋白和细人体内的生物活性因子，如激素、免疫球蛋白和细 胞生长因子。胞生长因子。 红细胞

5、生成素（红细胞生成素（EPO） 白细胞介素白细胞介素-2（IL-2） 粒细胞集落刺激因子（粒细胞集落刺激因子（G-CSF） 粒粒/巨噬细胞集落刺激因子（巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF） 肿瘤坏死因子（肿瘤坏死因子（TNF） 表皮生长因子（表皮生长因子（EGF）（）（用于伤口愈合）用于伤口愈合）7 核酸类及其衍生物核酸类及其衍生物（1）核酸类）核酸类 （2）多聚核苷酸）多聚核苷酸 （3）核苷、核苷酸及其衍生物）核苷、核苷酸及其衍生物 8 多糖多糖升白：增加白细胞升白：增加白细胞（1）抗生素）抗生素 （2）酶抑制剂）酶抑制剂 （3）免疫调节物质）免疫调节物质 （4）其他生物活性物质）其他生物活

6、性物质第三节第三节 新型生物药物研制的理论和方法新型生物药物研制的理论和方法新的化学实体（新的化学实体（New chemical entity，简称简称NCE）根据根据NCE来源将生物药物大致分为两类：来源将生物药物大致分为两类：一类是利用重组一类是利用重组DNA技术技术二类是利用微生物、动植物或酶生产的非上述药品，通过二类是利用微生物、动植物或酶生产的非上述药品，通过筛远可获得这类新药的筛远可获得这类新药的NCE的先导物。的先导物。新药研究和开发的主要过程：新药研究和开发的主要过程：1 确定研究计划确定研究计划 2 准备化合物准备化合物 3 药理筛选药理筛选4 化学试验化学试验 5 临床前临

7、床前I期期 6 临床前临床前II期期7 I期临床期临床 8 II期临床期临床 9 III期临床期临床10注册申请上市注册申请上市 11售后监测售后监测提供提供6000-8000个化合物个化合物 9-13年年 耗资约耗资约2.3亿美元亿美元先导化合物的寻找先导化合物的寻找1 筛选模型的确定筛选模型的确定筛选模型的核心是药物作用靶筛选模型的核心是药物作用靶大规模筛选（大规模筛选（High-throughput screening，简称简称HTS）（1）用动物细胞和组织建立的筛选模型用动物细胞和组织建立的筛选模型 LC50（2）酶抑制剂的筛选酶抑制剂的筛选（3）受体拮抗剂的筛选）受体拮抗剂的筛选基因

8、复制、转录因子为对象的治疗基因复制、转录因子为对象的治疗（1）转录因子的多样性）转录因子的多样性 （2）转录因子具有特异性）转录因子具有特异性（3）基因特异性转录因子与人类疾病有关）基因特异性转录因子与人类疾病有关开始考虑以凋亡为靶治疗开始考虑以凋亡为靶治疗2 先导化合物来源先导化合物来源一是从化学库或天然产物中筛选一是从化学库或天然产物中筛选二是与受体结合的结构设计（合理新药设计）二是与受体结合的结构设计（合理新药设计）合理药物设计（合理药物设计（Rational drug design）则是基于则是基于受体三维立体结构的认识，通过计算机辅助分受体三维立体结构的认识，通过计算机辅助分子设计全

9、程合成新分子。子设计全程合成新分子。现今从生物中筛选新药重点放在微生物现今从生物中筛选新药重点放在微生物人们也开始关注植物、动物人们也开始关注植物、动物人类和动物方面，则关注自身免疫系统人类和动物方面，则关注自身免疫系统新药的研究与开发是一个将化学结构研究与生物活新药的研究与开发是一个将化学结构研究与生物活性研究连接起来的创造性过程。性研究连接起来的创造性过程。第四节第四节 生物药物的发展历史和概况生物药物的发展历史和概况一一生物制药的发展历史生物制药的发展历史二二李时珍本草纲目李时珍本草纲目三三医生琴纳（医生琴纳（Jenner ）发明了用牛痘疫苗治疗天花发明了用牛痘疫苗治疗天花四四1860年

10、，巴斯德发现细菌，开创了第一次药学革命年，巴斯德发现细菌，开创了第一次药学革命五五1928年英国弗莱明发明青霉素至年英国弗莱明发明青霉素至1941年在美国开发成年在美国开发成功。功。六六从生物体内分离纯化酶制剂的技术日趋成熟，酶类药从生物体内分离纯化酶制剂的技术日趋成熟，酶类药物得物得七七到广泛应用。到广泛应用。八八70年代年代Zenk 应用植物细胞培养生产植物药物应用植物细胞培养生产植物药物九九50年代提出的年代提出的DNA 双螺旋理论及双螺旋理论及70年代发展的重组年代发展的重组DNA技术、单克隆抗体技术使生物制药进入一崭新的时代技术、单克隆抗体技术使生物制药进入一崭新的时代1982年，第

11、一个基因工程药物人胰岛素上市年，第一个基因工程药物人胰岛素上市另一重大认识就是认识到生物多样性对生物制药的决定性另一重大认识就是认识到生物多样性对生物制药的决定性在基因工程和细胞工程技术方面的研究水平与国外水在基因工程和细胞工程技术方面的研究水平与国外水平相比差距已不大，国内已建立了平相比差距已不大，国内已建立了40多个临床药理试多个临床药理试验基地。验基地。 二二 生物制药的发展概况生物制药的发展概况1 基因工程基因工程 所依托的基础理论为所依托的基础理论为Watson-Crick的的DNA 模板学说模板学说、Monod和和Jacob的操纵子学说。的操纵子学说。（1）基因工程药物品种的开发）

12、基因工程药物品种的开发（2）应用基因工程技术建立新药的筛选模型）应用基因工程技术建立新药的筛选模型（3）应用基因工程技术改良菌种）应用基因工程技术改良菌种（4）基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用）基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用（5）利用转基因动、植物生产蛋白质类药物）利用转基因动、植物生产蛋白质类药物（6）基因工程抗体在医药工业中的应用）基因工程抗体在医药工业中的应用 抗体工程抗体工程2细胞工程细胞工程3 奠定了细胞培养和细胞融合技术的理论基础奠定了细胞培养和细胞融合技术的理论基础4（1）单克隆抗体技术）单克隆抗体技术 生物导弹生物导弹（2）通过植物细胞培养生产次生代谢产物）通过植

13、物细胞培养生产次生代谢产物（3）动物细胞培养）动物细胞培养 三三 微生物工程微生物工程微生物工程也称发酵工程微生物工程也称发酵工程所采用的新技术主要应用于所采用的新技术主要应用于3个方面：个方面： 工艺改进、新药研制和菌种改造。工艺改进、新药研制和菌种改造。微生物药物：微生物药物： 即在微生物生命活动过程中产生的具有生理活性即在微生物生命活动过程中产生的具有生理活性（或称药理活性）的次级代谢产物及其衍生物。（或称药理活性）的次级代谢产物及其衍生物。 有酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂、抗氧化剂。有酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂、抗氧化剂。 四四 酶工程酶工程 酶工程是酶学与化工技术二者结合的

14、产物酶工程是酶学与化工技术二者结合的产物 第五节第五节 生物制药的发展趋势生物制药的发展趋势 一一 生物制药中的新技术生物制药中的新技术1 大规模筛选的采用与创新大规模筛选的采用与创新 大规模筛选是大规模测试化合物的方法，采用机大规模筛选是大规模测试化合物的方法，采用机器人自动寻找特殊生物靶，如某个细胞表面受体或器人自动寻找特殊生物靶，如某个细胞表面受体或一个代谢有关酶的抑制剂（拮抗剂）或激动剂（兴一个代谢有关酶的抑制剂（拮抗剂）或激动剂（兴奋剂）的技术。奋剂）的技术。2 高效分离纯化系统的采用高效分离纯化系统的采用（1）固相化金属亲和层析）固相化金属亲和层析 （2）超扩散层析）超扩散层析（3

15、）灌注层析）灌注层析 BioCADworkstation（4）其他快速分离纯化系统其他快速分离纯化系统AKTA explorer快速化工工艺开拓系统快速化工工艺开拓系统Streamline扩张柱床吸附技术扩张柱床吸附技术快速蛋白液相色谱（快速蛋白液相色谱（FPLC ）The biological system 高分辨生物分子纯化而设计的层高分辨生物分子纯化而设计的层析系统析系统 二二 Human genome project，简称简称 HGP约约10万个万个gene30亿对碱基亿对碱基 三三 基因治疗基因治疗基因治疗基因治疗从基因角度可以理解为将外来的基因从基因角度可以理解为将外来的基因导入细

16、胞，用正常的基因置换病源基因或补充缺导入细胞，用正常的基因置换病源基因或补充缺失的基因，从而达到治疗的效果。失的基因，从而达到治疗的效果。基因治疗的疾病有三类：基因治疗的疾病有三类： 致死性遗传性疾病致死性遗传性疾病 用过去的治疗法很难根治的癌症用过去的治疗法很难根治的癌症 爱滋病等后天性疾病爱滋病等后天性疾病RNA 病毒可望用病毒可望用RNA 酶消灭酶消灭图图1-4为用核酸酶（为用核酸酶（RNA 酶）酶）解决的问题：提供更多可供利用的基因解决的问题：提供更多可供利用的基因设计定向整合的载体：反转录病毒和腺病毒设计定向整合的载体：反转录病毒和腺病毒人类将逐渐具备在原子水平解决问题和在基因水人类

17、将逐渐具备在原子水平解决问题和在基因水平上治疗疾病的能力。平上治疗疾病的能力。 四四 糖链工程糖链工程糖科学（糖科学（Glycoscience）和糖链工程和糖链工程 即糖生物学即糖生物学蛋白或糖脂类蛋白或糖脂类 对生态信息的传递起着重要的作用对生态信息的传递起着重要的作用糖类药物糖类药物 五五 细胞因子类药物细胞因子类药物 细胞因子细胞因子是淋巴细胞来源的淋巴因子或巨噬细胞、单是淋巴细胞来源的淋巴因子或巨噬细胞、单核细胞来源的单核因子、免疫系统中具有各种生物活核细胞来源的单核因子、免疫系统中具有各种生物活性的一类因子的总称。性的一类因子的总称。对细胞因子的受体结构以及细胞因子糖链部分的结构对细

18、胞因子的受体结构以及细胞因子糖链部分的结构和功能也做了大量研究。和功能也做了大量研究。第二章第二章 基因工程制药基因工程制药 第一节第一节 基因工程制药概述基因工程制药概述 基因工程（基因工程（Gene engineering），又称又称重组重组DNA 技术。技术。它能使带有支配各种各样遗传信息基因的它能使带有支配各种各样遗传信息基因的DNA 片段越过不片段越过不同生物间特异的细胞壁而组入到完全不同的生物体内，定同生物间特异的细胞壁而组入到完全不同的生物体内，定向的控制、修饰和改变生物体的遗传和变异。向的控制、修饰和改变生物体的遗传和变异。1人胰岛素（人胰岛素（Insulin）具有多种生物功能

19、，维持血糖恒定，增加糖原、脂肪、某具有多种生物功能，维持血糖恒定，增加糖原、脂肪、某些氨基酸和蛋白质的合成。些氨基酸和蛋白质的合成。生产方式：一是分别在大肠杆菌中合成生产方式：一是分别在大肠杆菌中合成A 链和链和B 链，再在链，再在体外用化学方法连接两条肽链组成胰岛素。体外用化学方法连接两条肽链组成胰岛素。 另一种是用分泌型载体表达胰岛素原。另一种是用分泌型载体表达胰岛素原。2 人生长激素人生长激素人生长激素是人的垂体腺前叶嗜酸细胞分泌的一种非糖人生长激素是人的垂体腺前叶嗜酸细胞分泌的一种非糖基化多肽激素。基化多肽激素。刺激身体生长刺激身体生长hGH 对对一些细胞的增殖和分化以及一些细胞的增殖

20、和分化以及DNA 合成有直接效应。合成有直接效应。3干扰素（干扰素（Interferon，IFN ）同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，其活性的发同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，其活性的发挥又受细胞基因组的调节和控制，涉及挥又受细胞基因组的调节和控制，涉及RNA 和蛋白质的和蛋白质的合成。合成。 本身不能直接灭活病毒，而是细胞在干扰素作用后产生本身不能直接灭活病毒，而是细胞在干扰素作用后产生出多种抗病毒蛋白，从而阻断病毒的繁殖。出多种抗病毒蛋白，从而阻断病毒的繁殖。分为分为a b tb t三型三型基本特性包括种属特异性、作用广谱性和选择基本特性包括种属特异性、作用广谱性和选择性、相对无

21、害性和特殊稳定性。性、相对无害性和特殊稳定性。抗细胞内侵害微生物活性；抗细胞分裂活性；抗细胞内侵害微生物活性；抗细胞分裂活性；调节免疫功能活性。调节免疫功能活性。用于治疗恶性肿瘤和病毒性疾病用于治疗恶性肿瘤和病毒性疾病4 白细胞介素白细胞介素白细胞介素是由白细胞或其他体细胞产生的又白细胞介素是由白细胞或其他体细胞产生的又在白细胞间起调节作用和介导作用的因子，是在白细胞间起调节作用和介导作用的因子，是一类重要的免疫调节剂。一类重要的免疫调节剂。激活并刺激激活并刺激T、B淋巴细胞的增殖和分化淋巴细胞的增殖和分化 刺激巨噬细胞和粒细胞的活性刺激巨噬细胞和粒细胞的活性 各种细胞的丝裂原各种细胞的丝裂原

22、 治疗恶性肿瘤和病毒性疾病治疗恶性肿瘤和病毒性疾病5 集落刺激因子集落刺激因子是一类能参与造血调节过程的糖蛋白分子，是一类能参与造血调节过程的糖蛋白分子，又称造血刺激因子或造血生长因子。又称造血刺激因子或造血生长因子。分类：分类：粒细胞集落刺激因子粒细胞集落刺激因子 巨噬细胞集落刺激因子巨噬细胞集落刺激因子 粒细胞粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子巨噬细胞集落刺激因子 多能集落刺激因子多能集落刺激因子功能：功能：刺激造血细胞增殖、维系细胞存活、分化刺激造血细胞增殖、维系细胞存活、分化 定型、刺激终末细胞的功能活性定型、刺激终末细胞的功能活性临床多用作癌化疗的辅助药物临床多用作癌化疗的辅助药物6 促红

23、细胞生成素促红细胞生成素肾脏分泌的重要激素肾脏分泌的重要激素与多种贫血尤其与终末期肾脏疾病贫血密切相关与多种贫血尤其与终末期肾脏疾病贫血密切相关能促进红细胞系列的增殖、分化及成熟能促进红细胞系列的增殖、分化及成熟治疗慢性肾功能衰竭引起的贫血和治疗肿瘤化疗后贫血治疗慢性肾功能衰竭引起的贫血和治疗肿瘤化疗后贫血7 肿瘤坏死因子肿瘤坏死因子除具有抗肿瘤外，还有抗炎活性，促凝血活性，促进细胞因除具有抗肿瘤外，还有抗炎活性，促凝血活性，促进细胞因子分泌，免疫调节作用，抗病毒、细菌和真菌作用，热原质子分泌，免疫调节作用，抗病毒、细菌和真菌作用，热原质以及参与骨质重吸收以及参与骨质重吸收淋巴细胞毒素淋巴细胞

24、毒素8 组织型纤溶酶原激活剂组织型纤溶酶原激活剂tPA是一种丝氨酸蛋白酶，能激活纤溶酶原生成纤熔酶，纤溶是一种丝氨酸蛋白酶，能激活纤溶酶原生成纤熔酶，纤溶 酶水解血凝块中的纤维蛋白网，导致血栓溶解。酶水解血凝块中的纤维蛋白网，导致血栓溶解。主要用于治疗血栓性疾病主要用于治疗血栓性疾病9 心钠素心钠素较强的利钠、利尿、扩张血管和降低血压较强的利钠、利尿、扩张血管和降低血压治疗充血性心脏衰竭、高血压、肾功能衰竭、水肿、气喘治疗充血性心脏衰竭、高血压、肾功能衰竭、水肿、气喘10 重组乙肝疫苗重组乙肝疫苗美、法和德国都已研制出人工合成的前美、法和德国都已研制出人工合成的前S多肽疫苗，具有很多肽疫苗，具

25、有很强的免疫原性强的免疫原性由化学合成的由化学合成的H BsAg多肽与破伤风类毒素偶联形成复合蛋多肽与破伤风类毒素偶联形成复合蛋白分子制成的疫苗白分子制成的疫苗第二节第二节 基因工程制药中常用的基因工程制药中常用的 工具酶和克隆载体工具酶和克隆载体 一一 常用工具酶常用工具酶1 限制酶限制酶它们对碱基作用的专一性上及对磷酸二酯键的断裂方式它们对碱基作用的专一性上及对磷酸二酯键的断裂方式上具有一些独特的性质上具有一些独特的性质种类：种类：I型酶型酶 II型酶：简单的单功能酶，作用时无需辅助因子或型酶：简单的单功能酶，作用时无需辅助因子或只需只需Mg2+ ，能识别双链能识别双链DNA 上特异的核苷

26、酸序列，底上特异的核苷酸序列，底物作用的专一性强，而且其识别序列与切断序列相一致。物作用的专一性强，而且其识别序列与切断序列相一致。限制酶的命名限制酶的命名以寄主微生物属名的第一个字母（大写）和种名的前两以寄主微生物属名的第一个字母（大写）和种名的前两个字母（小写）写成斜体字的个字母（小写）写成斜体字的3 个字母个字母 缩写，菌株名以非斜体符号加在这三个字母的后面。若同缩写，菌株名以非斜体符号加在这三个字母的后面。若同 一菌株中有几种不同的限制酶时，则以罗马数字加以区分。一菌株中有几种不同的限制酶时，则以罗马数字加以区分。例如例如 HindIII限制酶的特性限制酶的特性（1）不同限制酶能专一地

27、识别不同的特异核苷酸序列）不同限制酶能专一地识别不同的特异核苷酸序列（2）各种限制酶的识别序列都具有回文结构）各种限制酶的识别序列都具有回文结构 双重旋转对称排列双重旋转对称排列 回文结构回文结构 即正读与反读都相同即正读与反读都相同（3）各种限制酶的切割类型是各式各样的，切后形成各种各种限制酶的切割类型是各式各样的，切后形成各种 粘性末端或平整末端粘性末端或平整末端 错位切断错位切断DNA -Cohesive ends Flush ends识别序列不同的限制酶，切割后有可能产生相同的粘性末端。识别序列不同的限制酶，切割后有可能产生相同的粘性末端。 同切口限制酶或同裂酶同切口限制酶或同裂酶 在

28、连接酶的作用下，可以得到嵌合在连接酶的作用下，可以得到嵌合DNA ，称为异源二聚体。称为异源二聚体。来源不同的限制酶，其识别序列可以相同，但其切点位置可不来源不同的限制酶，其识别序列可以相同，但其切点位置可不 同或相同。同或相同。（4）某些限制酶在非标准反应条件下，可能导致酶的识某些限制酶在非标准反应条件下，可能导致酶的识别序列特异性发生改变别序列特异性发生改变在非标准条件下，每种限制酶都有上述严格的识别序列在非标准条件下，每种限制酶都有上述严格的识别序列导致限制酶的识别序列特异性发生改变，在导致限制酶的识别序列特异性发生改变，在DNA 内产生附加切内产生附加切割。称为限制酶的第割。称为限制酶

29、的第2活性，又称为星活性。活性，又称为星活性。 2 DNA 聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌DNA 聚合酶聚合酶I（1）5-3DNA 聚合酶活力聚合酶活力（2）5-3外切核酸酶活力外切核酸酶活力 降解降解RNA ：DNA 杂交体的杂交体的RNA 部分部分（3）3-5外切核酸酶活力外切核酸酶活力主要功能是校对所合成的链是否能与模板精确无误地配对在一起。主要功能是校对所合成的链是否能与模板精确无误地配对在一起。 切口平移反应：当双链切口平移反应：当双链DNA 的一条链产生缺口时，的一条链产生缺口时，DNA 聚合聚合酶酶I将脱氧核苷酸添加到将脱氧核苷酸添加到3羟基末端上，与此同时，其羟基末端上，与此同时

30、，其5-3外切酶外切酶从切口的从切口的5磷酸末端切除原有核苷酸磷酸末端切除原有核苷酸,使切口沿着使切口沿着DNA 平移平移,称为称为切口平移反应切口平移反应,又称为又称为缺口翻译缺口翻译。 以放射性脱氧核苷酸置换原来的脱氧核苷酸标记以放射性脱氧核苷酸置换原来的脱氧核苷酸标记DNA ，从而从而制作制作DNA 探针。探针。大片段即大片段即Klenow 片段片段是用枯草芽孢杆菌蛋白酶裂解完整的是用枯草芽孢杆菌蛋白酶裂解完整的DNA 聚聚合酶合酶I而产生或者通过克隆技术而得到的单一多肽链。而产生或者通过克隆技术而得到的单一多肽链。全酶中去除了全酶中去除了5-3外切核酸酶活力，而聚合酶活力及外切核酸酶活

31、力，而聚合酶活力及3-5外切核酸外切核酸酶活力均不受影响。酶活力均不受影响。补平限制酶切割补平限制酶切割DNA 后产生的后产生的3凹端凹端 用用32PdNTP 补补平平3凹端，对凹端，对DNA 片段进行末端标记片段进行末端标记 在在cDNA 克克隆中，用于合成隆中，用于合成cDNA 第二链第二链 应用应用Sanger双脱氧链末端终止法进行双脱氧链末端终止法进行DNA 测序测序 T4 噬菌体噬菌体DNA 聚合酶聚合酶 与与Klenow 片段相似的是都具有片段相似的是都具有5-3聚合酶活力及聚合酶活力及3-5外切核酸酶外切核酸酶活力，而且活力，而且3-5外切酶活力对单链外切酶活力对单链DNA 的作

32、用比对双链的作用比对双链DNA 更强。更强。 经修饰的经修饰的T7 噬菌体噬菌体DNA 聚合酶聚合酶 更强的更强的3-5外切核酸酶活力外切核酸酶活力 DNA 平均长度比其他聚合酶大得多平均长度比其他聚合酶大得多 拷贝长段模板拷贝长段模板 测序酶，测序酶（测序酶，测序酶（2.0版）完全丧失了核酸外切酶活力版）完全丧失了核酸外切酶活力 Taq DNA 聚合酶及聚合酶及AmpliTaqTM DNA 聚合酶聚合酶 水生栖热菌水生栖热菌 具有具有5-3聚合酶活力和依赖于聚合作用的聚合酶活力和依赖于聚合作用的5-3外切核酸酶活力。外切核酸酶活力。 最佳作用温度为最佳作用温度为75-80。C，为避免引物自模

33、板上解离往往需在为避免引物自模板上解离往往需在低于最适温度条件下起始聚合反应。低于最适温度条件下起始聚合反应。 聚合酶链式反应聚合酶链式反应 反转录酶反转录酶鼠或禽反转录病毒鼠或禽反转录病毒 H活力活力主要用于将主要用于将 mRNA 转录成双链转录成双链cDNA ，也可用于制备也可用于制备杂交用探针和标记带杂交用探针和标记带5突出端的突出端的DNA 片段。片段。3DNA 连接酶连接酶4 能将两段能将两段DNA 拼接起来的酶叫拼接起来的酶叫DNA 连接酶。连接酶。T4噬菌体噬菌体DNA 聚合酶聚合酶连接带有匹配粘性末端的双链连接带有匹配粘性末端的双链DNA连接平整末端的双链连接平整末端的双链DN

34、A 大肠杆菌大肠杆菌DNA 连接酶连接酶 需需NAD 辅助因子辅助因子4基因工程中常用的其他酶基因工程中常用的其他酶末端脱氧核苷酸转移酶（简称末端转移酶或末端脱氧核苷酸转移酶（简称末端转移酶或TDT酶）酶）作用底物是带作用底物是带3羟基端的单链羟基端的单链DNA 或带或带3羟基突出端的双链羟基突出端的双链DNA 。主要用于给载体或主要用于给载体或cDNA 加上互补的同聚尾以及用加上互补的同聚尾以及用32P 标记的一种标记的一种d NTP 来来标记标记DNA 片段的片段的3端。端。T4噬菌体多核苷酸激酶噬菌体多核苷酸激酶它能催化它能催化ATP 的的-磷酸基转移至去磷酸化的磷酸基转移至去磷酸化的D

35、NA 或或RNA 的的5末端末端该酶可用于标记该酶可用于标记DNA 5末端末端 核酸酶核酸酶 BLA31核酸酶核酸酶 主要活力是主要活力是3外切核酸酶活力，外切核酸酶活力，DNA 内切酶活力内切酶活力 反应绝对依赖于钙离子反应绝对依赖于钙离子（1）通过可控方式去除双链）通过可控方式去除双链DNA 的末端核苷酸从而缩短的末端核苷酸从而缩短DNA 分子分子（2）用于确定）用于确定DNA 小片段的限制酶切图小片段的限制酶切图 S1核酸酶核酸酶 单链特异性的内切酶单链特异性的内切酶 可降解单链可降解单链DNA 或或RNA（1）去除去除DNA 片段中突出的单链尾部片段中突出的单链尾部（2）打开从）打开从

36、 mRNA 合成双链合成双链cDNA 时时产生的产生的发夹环发夹环 碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶 细菌碱性磷酸酯酶（细菌碱性磷酸酯酶（BAP ）和牛小肠碱性磷酸酯酶（和牛小肠碱性磷酸酯酶（CIP ）两种两种 催化去除单链或双链催化去除单链或双链DNA 和和RNA 分子中的分子中的5-磷酸基（脱磷酸作用）磷酸基（脱磷酸作用） 去除切割载体去除切割载体DNA 两端的两端的5-磷酸基，防止自身环化磷酸基，防止自身环化 二二 常用的克隆载体常用的克隆载体 具有在细胞内进行自我复制的具有在细胞内进行自我复制的DNA 子就是外源子就是外源DNA 片段（基因）的片段（基因）的运载体，又可称为分子载体或无性繁殖载

37、体。运载体，又可称为分子载体或无性繁殖载体。 有了复制子作为外源有了复制子作为外源DNA 的载体的载体1质粒质粒2 质粒质粒（Plasmid ）是一些存在于微生物细胞内染色体外的闭合环状是一些存在于微生物细胞内染色体外的闭合环状3双链的小型双链的小型DNA 分子。分子。 质粒载体的改造和构建质粒载体的改造和构建 特性特性 （1）要有复制子）要有复制子 （2）要有能促进外源）要有能促进外源DNA 高水平表达的调控区，如含有强启动子高水平表达的调控区，如含有强启动子 （3）要有多种限制酶的单一切点）要有多种限制酶的单一切点 （4）具有两种以上易被检测的选择性遗传标记，作为对重组与非重组转化）具有两

38、种以上易被检测的选择性遗传标记，作为对重组与非重组转化体的选择标记（最好有一个具有插入性失活功能）。体的选择标记（最好有一个具有插入性失活功能）。 （5）质粒载体）质粒载体DNA 的分子量要尽可能小，以利于载体容纳较长区段外源的分子量要尽可能小，以利于载体容纳较长区段外源DNA 片段。片段。 （6）应属于松弛型复制）应属于松弛型复制 （7）质粒载体应为非传递性，有较小的宿主范围，不为传递性载体所诱导。）质粒载体应为非传递性，有较小的宿主范围，不为传递性载体所诱导。 阶段阶段 （1）将选择标记引入含有）将选择标记引入含有pMB I或或ColE1复制子的质粒中复制子的质粒中 pBR322 仅仅4.

39、36kb （2）调整质粒载体的结构，提高质粒载体的效率调整质粒载体的结构，提高质粒载体的效率 新型载体都引入一个人工合成的由多种常用限制酶单一识别序列组新型载体都引入一个人工合成的由多种常用限制酶单一识别序列组成的多克隆位点或多聚接头。成的多克隆位点或多聚接头。 （3）引入多种用途的辅助序列，构建具有某些特化功能的质粒载体）引入多种用途的辅助序列，构建具有某些特化功能的质粒载体 构建可用组织化学方法鉴定重组克隆的质粒载体构建可用组织化学方法鉴定重组克隆的质粒载体 如如pUC 载体带有一个载体带有一个Lac操纵子的操纵子的DNA 片段，该区段编码片段，该区段编码bb- -半乳糖半乳糖苷酶氨基端的

40、一个片段，该片段能与宿主细胞所编码的缺陷型苷酶氨基端的一个片段，该片段能与宿主细胞所编码的缺陷型bb- -半乳半乳糖苷酶实现基因内互补。外源糖苷酶实现基因内互补。外源DNADNA插入载体的多克隆位点后，可使酶的氨插入载体的多克隆位点后，可使酶的氨基端片段失活而破坏这种互补作用，导致带有重组质粒的细菌在含有诱基端片段失活而破坏这种互补作用，导致带有重组质粒的细菌在含有诱导物导物IPTGIPTG和生色底物和生色底物X-galX-gal培养基上产生白色菌落，从而可用肉眼鉴定重培养基上产生白色菌落，从而可用肉眼鉴定重组克隆。组克隆。 构建带有单链噬菌体复制起点的质粒载体构建带有单链噬菌体复制起点的质粒

41、载体 可大量获得载体可大量获得载体DNA 双链中的一条链双链中的一条链 构建带有噬菌体启动子的质粒载体构建带有噬菌体启动子的质粒载体 体外得以转录体外得以转录RNA 而翻译而翻译 构建可对重组克隆进行正选择的质粒载体构建可对重组克隆进行正选择的质粒载体 某些宿主菌致死的基因产物某些宿主菌致死的基因产物 构建含有强启动子的质粒载体构建含有强启动子的质粒载体 常用的几种质粒载体常用的几种质粒载体（1）pBR322 及其衍生载体及其衍生载体 非必需区域，分子量相对较大，能被非必需区域，分子量相对较大，能被Colk 带动转移带动转移 有关转移的有关转移的mob 区段刚好在非必需区域内区段刚好在非必需区

42、域内 pAT153载体载体 之间缺失之间缺失2个片段个片段 包含结合转移的有关序列包含结合转移的有关序列 pBR327载体载体 （2）pUC系列载体系列载体 pUC18、 pUC19质粒载体质粒载体 pUC质粒缺乏与控制拷贝数有关的质粒缺乏与控制拷贝数有关的rop 基因，故这些质粒复制的拷贝基因，故这些质粒复制的拷贝数要比带有数要比带有pMB1或或ColE1复制起点的质粒高得多。复制起点的质粒高得多。 PUC118 、pUC119质粒载体质粒载体 带有带有M13 丝状噬菌体丝状噬菌体DNA 合成的起始、终止及合成的起始、终止及DNA 包装进入噬菌包装进入噬菌体颗粒所必需的序列。体颗粒所必需的序

43、列。 这些质粒的宿主细胞被适当的丝状噬菌体感染时，可合成质粒这些质粒的宿主细胞被适当的丝状噬菌体感染时，可合成质粒DNA 中一条链，并能将此单链中一条链，并能将此单链DNA 包装进入子代噬菌体。包装进入子代噬菌体。 pUC 的的衍生质粒载体衍生质粒载体 噬菌体编码的依赖于噬菌体编码的依赖于DNA 的的RNA 聚合酶转录单位的启动子聚合酶转录单位的启动子2 2噬菌体噬菌体噬菌体载体的构建噬菌体载体的构建 噬菌体基因组为双链线状噬菌体基因组为双链线状DNA 感染时，感染时，DNA 的两末端配对并由连接酶的作用闭合成环状的两末端配对并由连接酶的作用闭合成环状（1）A至至J区段：分布在基因组左臂，约占

44、区段：分布在基因组左臂，约占1/3基因组。基因组。 噬菌体头部（噬菌体头部（A-F ）、）、尾部（尾部（Z-J ）（2）J至至N之间非必需区段：约占之间非必需区段：约占1/3基因组基因组 控制重组及溶源性的基因，可被消除和取代控制重组及溶源性的基因，可被消除和取代（3）N 至至R 区段：分布在基因组右臂，与噬菌斑的形成有关。区段：分布在基因组右臂，与噬菌斑的形成有关。 包括调控及免疫性基因、包括调控及免疫性基因、DNA 复制基因、转录和裂解基因等。复制基因、转录和裂解基因等。 消除多余限制性内切酶位点消除多余限制性内切酶位点 消除基因组必需区内的酶切位点，保留非必需区内消除基因组必需区内的酶切

45、位点，保留非必需区内1-2个位点个位点 方法：点突变、基因组的置换和缺失方法：点突变、基因组的置换和缺失 去除去除DNA 中一些非必需区段中一些非必需区段 有有75 %-105 % 38-52 kb DNA 才能被包装成噬菌体颗粒才能被包装成噬菌体颗粒 插入型载体插入型载体 DNA 基因组中缺失部分非必需基因，只含有一个可供外源基因组中缺失部分非必需基因，只含有一个可供外源DNA 插入插入的限制性内切酶位点的的限制性内切酶位点的DNA 载体。载体。 替换型载体替换型载体 在在DNA 的可替换片段两端具有两个限制性内切酶位点，酶切后替换的可替换片段两端具有两个限制性内切酶位点，酶切后替换片段与带

46、有所有必需基因的左右双臂分开，有外源片段与带有所有必需基因的左右双臂分开，有外源DNA 代之。代之。 携带外源携带外源DNA 的重组体的正选择标记。的重组体的正选择标记。 提高载体在生物学防护上的安全性，引入了提高载体在生物学防护上的安全性，引入了WES三个基因的琥珀三个基因的琥珀突变，这些特性使从实验室环境中逃逸出重组噬菌体的可能性大大降突变，这些特性使从实验室环境中逃逸出重组噬菌体的可能性大大降低。低。 Charon16A 载体的基因载体的基因A 和和B 上诱变产生了琥珀突变。上诱变产生了琥珀突变。 结果在含有色原底物结果在含有色原底物Xgal和和Lac-指示菌的平板培养基上形成无色的指示

47、菌的平板培养基上形成无色的噬菌斑。噬菌斑。 常用载体常用载体（1）Charon系列载体系列载体 Charon40 载体是专门设计用来容纳大片段载体是专门设计用来容纳大片段（2）EMBL系列载体系列载体 EMBL3 、EMBL4 对称的两个多酶位点聚合接头序列对称的两个多酶位点聚合接头序列 EMBL3A 带有两个琥珀突变，可筛选出带有两个琥珀突变，可筛选出SUPF（琥珀抑制基因）相联琥珀抑制基因）相联的的DNA 序列。序列。 构建基因文库构建基因文库（3）gt系列载体系列载体 为插入型系列载体，包括为插入型系列载体，包括gt10、pgt11、gt18-23等等 gt10：专门为在其免疫区（专门为

48、在其免疫区（imm434 ？）内单一的内单一的EcoR I位点上克位点上克隆小的隆小的cDNA 片段（约片段（约6kb）而设计的。而设计的。 阻遏子基因阻遏子基因CI，CI基因失活形成了重组的基因失活形成了重组的CI-噬菌体，噬菌斑为噬菌体，噬菌斑为清亮斑，可与非重组的清亮斑，可与非重组的CI-噬菌体所产生的阴暗噬菌斑相区别。噬菌体所产生的阴暗噬菌斑相区别。 gt11：是一个常用的，可用于免疫学筛选的载体。是一个常用的，可用于免疫学筛选的载体。 如果插入的如果插入的DNA 片段方向正确且转译读框与片段方向正确且转译读框与LacZ基因一致，基因一致，则重组噬菌体能在宿主菌内指导则重组噬菌体能在宿

49、主菌内指导bb- -半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。 含有对温度敏感的阻遏子（含有对温度敏感的阻遏子（4343。失活），可作为抗溶源性生长的选失活），可作为抗溶源性生长的选择性。择性。3M13 噬菌体噬菌体M13 噬菌体的基本特性噬菌体的基本特性 基因组为环状单链基因组为环状单链DNA 分子分子 雄性专一性，即只吸附于带有雄性专一性，即只吸附于带有F质粒的雄性大肠杆菌（质粒的雄性大肠杆菌（F+）的性纤毛的性纤毛 上而引起感染。上而引起感染。 转换成双链复制型（转换成双链复制型（RF ） 在基因在基因3产物的作用下，以单链产物的作用下，以单链DNA 为模板，先从一个为模板，先从一个RNA 引物开始，引物

50、开始， 通过宿主通过宿主DNA 聚合酶聚合酶III延伸，合成双链延伸，合成双链DNA（RFDNA ）。）。 然后在基因然后在基因2 产物作用下产物作用下RFDNA 进行复制，每个细胞可产生进行复制，每个细胞可产生50-100 RFDNA 拷贝。拷贝。由基因由基因5产生的产生的M13 单链结合蛋白与通过滚环复制合成的单链结合蛋白与通过滚环复制合成的DNA 单链结合单链结合并进行包装形成子代噬菌体。并进行包装形成子代噬菌体。 通过细胞壁挤出，并不杀死细胞通过细胞壁挤出，并不杀死细胞 细胞生长速率降低，并不断释放子代噬菌体继续感染周围细胞细胞生长速率降低，并不断释放子代噬菌体继续感染周围细胞 在平板

51、上不形成空斑，形成缓慢生长的慢性感染细胞圈在平板上不形成空斑，形成缓慢生长的慢性感染细胞圈 M13丝状噬菌体载体的构建丝状噬菌体载体的构建 将含有大肠杆菌乳糖操纵子调节区段和编码将含有大肠杆菌乳糖操纵子调节区段和编码bb- -半乳糖苷酶基因的半乳糖苷酶基因的头头145145个密码插入这个区的酶切位点，得个密码插入这个区的酶切位点，得M13 mp1M13 mp1，可被转译为多肽。可被转译为多肽。 多肽虽然没有酶活力，但当多肽虽然没有酶活力，但当M13 mp1M13 mp1感染特殊的宿主菌感染特殊的宿主菌JM103JM103时，会时，会导致导致多多互补而产生有活性的互补而产生有活性的b-b-半乳糖

52、苷酶，在含有诱导物的培养基上半乳糖苷酶，在含有诱导物的培养基上形成蓝色噬菌斑。形成蓝色噬菌斑。 这两个载体对于具有两个不同酶切位点末端的外源这两个载体对于具有两个不同酶切位点末端的外源DNADNA片段，可通片段，可通过强制克隆而定向连接。过强制克隆而定向连接。 常用的常用的M13 噬菌体载体噬菌体载体 M13 mp18、M13 mp19 LacZ区内的多克隆位点中都含有区内的多克隆位点中都含有13个不同的酶切位点个不同的酶切位点 两个载体不会轻易自身再环化两个载体不会轻易自身再环化 外源外源DNA 在在M13 mp18、M13 mp19中以两个互为相反的方向插入中以两个互为相反的方向插入 pB

53、R322质粒载体的复制起点（质粒载体的复制起点（Ori）和氨苄青霉素抗性基因（和氨苄青霉素抗性基因（Ampr）4粘粒粘粒5 粘粒是一种有噬菌体粘性末端的杂种质粒，由粘粒是一种有噬菌体粘性末端的杂种质粒，由DNAcos区与质粒区与质粒DNA 重重6组构建而成。组构建而成。7 是为克隆和增殖基因组是为克隆和增殖基因组DNA 的大片段而设计的和组建真核生物基因的大片段而设计的和组建真核生物基因文库文库8 最大最大DNA 可达可达52kb，粘粒大小为粘粒大小为4-7kb，适宜适宜35-45kb9 cosDNA 序列（将序列（将DNA 包装到噬菌体颗粒中所必需的序列），携有一包装到噬菌体颗粒中所必需的序

54、列），携有一个复个复制起点（通常是制起点（通常是ColE1复制起点）和一个抗药性标记（通常是复制起点）和一个抗药性标记（通常是Ampr ）。）。 将两个将两个cos位点组合到同一个粘粒载体中，从而大大简化在粘粒载体位点组合到同一个粘粒载体中，从而大大简化在粘粒载体中的定向克隆。中的定向克隆。5哺乳动物细胞载体系统哺乳动物细胞载体系统6 一类是不带真核复制子的质粒型载体，是在原核质粒中插入一个一类是不带真核复制子的质粒型载体，是在原核质粒中插入一个完整完整7的哺乳动物细胞转录单位和一个选择标记基因而组成的简单载体的哺乳动物细胞转录单位和一个选择标记基因而组成的简单载体系统。系统。8如如 pTK2

55、、pHyg、pRSVneo9 另一类是带有真核病毒调控序列元件的质粒表达载体。另一类是带有真核病毒调控序列元件的质粒表达载体。10 第三节第三节 基因工程药物无性繁殖系的组建基因工程药物无性繁殖系的组建一一目的基因的制取目的基因的制取构建基因文库法构建基因文库法分离目的基因分离目的基因1 用一种或两种限制酶消化噬菌体替换型载体，选用适当方法将载体左、用一种或两种限制酶消化噬菌体替换型载体，选用适当方法将载体左、 右臂与中间部位的填充片段分离开。右臂与中间部位的填充片段分离开。2 用一种或几种限制酶部分消化高分子量的真核基因组用一种或几种限制酶部分消化高分子量的真核基因组DNA ，再用凝胶电再用

56、凝胶电 泳或密度梯度离心法分离出适宜长度的泳或密度梯度离心法分离出适宜长度的DNA 。3 噬菌体载体臂与真核噬菌体载体臂与真核DNA 片段连接成较长的多联体，再利用体外包装系片段连接成较长的多联体，再利用体外包装系 统装入噬菌体头部，成为有感染力的噬菌体。统装入噬菌体头部，成为有感染力的噬菌体。4 重组噬菌体通过在大肠杆菌中生长而得以繁殖，所获得的基因组重组噬菌体通过在大肠杆菌中生长而得以繁殖，所获得的基因组DNA 文文 库可被长时间利用和贮存库可被长时间利用和贮存酶促合成法制取目的基因酶促合成法制取目的基因平均每个细胞约含平均每个细胞约含10-5 g总总RNA Mrna 总总RNA 的的1

57、%-5 % 从某些特定型别的分化细胞细胞质中，编码某特种蛋白质的目从某些特定型别的分化细胞细胞质中，编码某特种蛋白质的目 mRNA 占占总总 mRNA 的的50 %-90 %，称为高丰度，称为高丰度 mRNA 。 低丰度低丰度 mRNA 或或稀有稀有 mRNA 真核细胞的真核细胞的 mRNA 分子在其分子在其3端均有一多聚腺苷酸端均有一多聚腺苷酸poly（A），），20-250个个残基组成的尾，可吸附于寡脱氧胸苷酸残基组成的尾，可吸附于寡脱氧胸苷酸-Oligo（dT ）纤维素。纤维素。 构建构建cDNA 文库文库 P T-PCR 法法1从构建的从构建的cDNA 文库中筛选目的文库中筛选目的cD

58、NA2（1）真核细胞总真核细胞总RNA 的分离的分离3 释放的内源性释放的内源性RNA 酶（酶（Rnase）的活力的活力4 外源性外源性Rnase对对RNA 制品的污染制品的污染硫氰酸胍提取和氯化铯离心法硫氰酸胍提取和氯化铯离心法盐酸胍和有机溶剂提取法盐酸胍和有机溶剂提取法（2）带）带poly（A ）的的RNA- mRNA 的的分离纯化与分析分离纯化与分析常用常用Northern杂交（杂交（RNA 印迹法）测定总印迹法）测定总RNA 或或poly（A ）RNA 样品中特样品中特定定 mRNA 分子的大小和丰度。分子的大小和丰度。（3）cDNA 文库的构建文库的构建cDNA 第一链的酶促合成第一

59、链的酶促合成 禽源和鼠源反转录酶禽源和鼠源反转录酶cDNA 第二链的合成第二链的合成a.自身引导法：杂交体变性而分开后，单链自身引导法：杂交体变性而分开后，单链cDNA 端端能够形成发夹结构能够形成发夹结构而引导而引导E.coliDNA 聚合聚合酶酶I Klenow 片段酶促合成片段酶促合成cDNA 第一链。第一链。b.置换合成法：利用置换合成法：利用cDNA：mRNA 杂交体为切口平移的模板，由杂交体为切口平移的模板，由RNA 酶酶 H在在 mRNA 链上造成切口和缺口而产生一系列链上造成切口和缺口而产生一系列RNA 引物，引物，再由再由DNA 聚聚 合酶合酶I 用这些引物以切口平移反应合成

60、用这些引物以切口平移反应合成cDNA 第二链。第二链。c.双链双链cDNA 载体载体DNA 的连接的连接d.噬菌体体外包装及感染构建噬菌体体外包装及感染构建cDNA 文库文库e.目的目的cDNA 克克隆的筛选隆的筛选I.核酸杂交法核酸杂交法II.特异性抗原的免疫学检测法特异性抗原的免疫学检测法III.cDNA 克克隆的同胞选择法隆的同胞选择法2R T-PCR 法合成目的法合成目的cDNA3 反转录反转录-聚合酶链式反应聚合酶链式反应a.从真核生物细胞中提取纯化总从真核生物细胞中提取纯化总RNAb.在在Oligo(dT )的的引导下引导下,以总以总RNA 中的总中的总 mRNA 为模板为模板,在

61、反转录在反转录酶的作用下酶的作用下,合成总合成总cDNA 的的第一链第一链c.以两个引物所结合的单链以两个引物所结合的单链cDNA (靶序列靶序列)为模板为模板,在在Taq 聚合酶的作聚合酶的作用下进行用下进行PCR 扩增扩增,合成双链目的合成双链目的cDNAd.(1)聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR ）体外扩增体外扩增DNA 技术技术e. Polymerase chain reactionf. 应用该技术可在很短的时间内得到数百万个特异应用该技术可在很短的时间内得到数百万个特异DNA 序列的拷贝序列的拷贝g. 宏观与微观的联系宏观与微观的联系PCR 技术的基本原理：首先使双链技术的基本

62、原理：首先使双链DNA 在反应液中热变性而分开成在反应液中热变性而分开成单单 链，然后在低温下与两个引物进行退火，使引物与单链链，然后在低温下与两个引物进行退火，使引物与单链DNA 配对配对结合结合 ，再在中温下利用，再在中温下利用Taq DNA 聚合酶的聚合活性及热稳定性进行聚聚合酶的聚合活性及热稳定性进行聚合（合（ 延伸）反应。每经过一次变性、退火、延伸三个步骤为一个循环，延伸）反应。每经过一次变性、退火、延伸三个步骤为一个循环，通通 过三个温度的不同循环。过三个温度的不同循环。 PCR 反应体系的组成反应体系的组成a. 含靶序列的含靶序列的DNA 需用需用0.2-2g 基因组基因组DNA

63、b. 寡核苷酸（引物）寡核苷酸（引物） 20-24个核苷酸个核苷酸 1 mol/ L 尽量选择碱基随机分布的序列尽量选择碱基随机分布的序列 GC含量尽可能接近含量尽可能接近50 % 避免因较长的互补序列而形成引物二聚体或发夹结构避免因较长的互补序列而形成引物二聚体或发夹结构 使其使其5端带一罕有的限制酶序列，使扩增产物既含有目标序列，两侧端带一罕有的限制酶序列，使扩增产物既含有目标序列，两侧又带有限制酶切位点。又带有限制酶切位点。c.Taq DNA 聚合酶聚合酶d. 工程酶（工程酶（AmpliTaqTM ）e. 酶量为酶量为1-5ud. 四种四种d NTP 50-200 mol/ Le.PCR

64、缓冲液缓冲液f. 10 mmol/ L Tris HCl（pH 8.3 ，于室温）于室温） g. 1.5 mmol/ L MgCl2 Mg2+ 为为1.5 mmol/ LPCR 体外扩增体外扩增DNA 操作过程操作过程 PCR 自动扩增仪自动扩增仪（2）PCR 扩增由扩增由 mRNA 反转录而成的反转录而成的cDNA 上游上游寡核苷酸引物寡核苷酸引物 下游下游寡核苷酸引物寡核苷酸引物 DNA 体外重组是将目的基因（外源体外重组是将目的基因（外源DNA 片段）用片段）用DNA 连接酶在体连接酶在体外连接到合适的载体外连接到合适的载体DNA 上，这种重新组合的上，这种重新组合的DNA 称为重组称为

65、重组DNA ，简简称称重组体。重组体。目的基因目的基因DNA 与质粒载体与质粒载体DNA 的连接的连接1定向克隆法定向克隆法2 当用两种不同的限制酶（如用当用两种不同的限制酶（如用BamH I和和Hind III）消化外源消化外源DNA 3时，可以产生带有非互补突出末端的外源时，可以产生带有非互补突出末端的外源DNA 片段。片段。4 排阻凝胶层析排阻凝胶层析 以便与切下来的小片段分开以便与切下来的小片段分开5 避免使用在多克隆位点上彼此直接相邻的限制酶切位点避免使用在多克隆位点上彼此直接相邻的限制酶切位点2粘性末端连接法粘性末端连接法3 质粒载体和外源质粒载体和外源DNA 都可能发生自身环化或

66、形成串联寡聚物都可能发生自身环化或形成串联寡聚物4 用碱性磷酸酶去除线状载体用碱性磷酸酶去除线状载体DNA 两端的两端的5磷酸基团以尽量减少磷酸基团以尽量减少载载二二目的基因与克隆载体的体外重组目的基因与克隆载体的体外重组体体DNA 的自身环化或连接。的自身环化或连接。 经去磷酸化的载体经去磷酸化的载体DNA 仍然可有效的与具有仍然可有效的与具有5末端磷酸的外源末端磷酸的外源DNA相连接，产生含有两个切口的环状重组相连接，产生含有两个切口的环状重组DNA 分子，可直接转化并由宿主分子，可直接转化并由宿主菌菌修复切口。修复切口。 这种带切口的环状这种带切口的环状DNA 的转化效率比线状的转化效率

67、比线状DNA 高得多高得多 应含有足量的载体应含有足量的载体DNA3平端连接法平端连接法4 平整末端连接属于低效反应平整末端连接属于低效反应极高浓度的极高浓度的T4 噬菌体噬菌体DNA 连接酶连接酶高浓度的平整末端外源高浓度的平整末端外源DNA 和质粒和质粒DNA低浓度（低浓度（0.5 mmol/ L）的的ATP不存在亚精胺一类的多胺不存在亚精胺一类的多胺 适量的凝聚剂适量的凝聚剂4快速克隆法快速克隆法5 需从纯化的凝胶中回收含目的条带的琼脂糖块，熔化后直接进行需从纯化的凝胶中回收含目的条带的琼脂糖块，熔化后直接进行6质粒载体和外源质粒载体和外源DNA 的连接。的连接。5同聚物加尾法同聚物加尾

68、法6 末端转移酶可催化末端转移酶可催化dNTP 加加到单链或双链到单链或双链DNA 3羟基端的能力，在羟基端的能力，在7目的目的DNA 和质粒载体上加入互补同聚物，两者在通过互补同聚物之间和质粒载体上加入互补同聚物，两者在通过互补同聚物之间氢氢8键形成可转化大肠杆菌的开环重组分子。键形成可转化大肠杆菌的开环重组分子。9 采用采用GC加尾，即将加尾，即将dC残基加到双链残基加到双链cDNA 上上，而将互补的，而将互补的dG残基加残基加到到10用用Pst I消化的质粒载体上。消化的质粒载体上。6加合成接头或衔接头法加合成接头或衔接头法 合成接头是化学合成的两个自相互补的核苷酸寡聚体（合成接头是化学

69、合成的两个自相互补的核苷酸寡聚体（8-12bp ）而而两个寡聚体可形成带一个或一个以上限制酶切位点的平整末端双链体。两个寡聚体可形成带一个或一个以上限制酶切位点的平整末端双链体。 第一次反应是使平整末端的双链接头与平整末端的目的第一次反应是使平整末端的双链接头与平整末端的目的DNA 相连相连 第二次连接反应则是将加上接头的目的第二次连接反应则是将加上接头的目的DNA 片段与带有匹配粘性末片段与带有匹配粘性末端端的载体的载体DNA 相连接。相连接。 衔接头与接头不同，它是一小段带有一个平整末端（与双链衔接头与接头不同，它是一小段带有一个平整末端（与双链DNA 连连接接）和一个粘性末端（与载体的相

70、应末端连接）的双链寡核苷酸。）和一个粘性末端（与载体的相应末端连接）的双链寡核苷酸。7 其他转换末端形式连接法其他转换末端形式连接法8（1）部分补平）部分补平3凹端凹端9（2）完全补平）完全补平3凹端凹端10（3）除）除3突出端突出端 目的基因目的基因DNA 与噬菌体载体与噬菌体载体DNA 的连接的连接（1）用于构建真核基因组）用于构建真核基因组DNA 文库文库（2）用于构建复杂的）用于构建复杂的cDNA 文库文库（3）用于亚克隆在粘性载体中增殖的外源目的）用于亚克隆在粘性载体中增殖的外源目的DNA 序列序列1噬菌体载体臂噬菌体载体臂DNA 的制备的制备1)酶切后将填充片段从载体臂中除去酶切后

71、将填充片段从载体臂中除去2)用碱性磷酸酶处理酶切载体片段用碱性磷酸酶处理酶切载体片段3)用双酶切割载体用双酶切割载体4)（1）常用蔗糖或氯化钠密度梯度离心法，也有用）常用蔗糖或氯化钠密度梯度离心法，也有用0.5 % 琼脂糖凝琼脂糖凝胶制胶制5)备电泳纯化载体臂。备电泳纯化载体臂。6)（2）用碱性磷酸酶处理噬菌体臂）用碱性磷酸酶处理噬菌体臂 末端的末端的5磷酸基团磷酸基团 这样能够有效的防止自身环化。并降低载体左右臂连接以后所形成这样能够有效的防止自身环化。并降低载体左右臂连接以后所形成的非重组载体的数目。的非重组载体的数目。 用碱性磷酸酶处理之前一定要使噬菌体臂的粘性末端退火并连接，用碱性磷酸

72、酶处理之前一定要使噬菌体臂的粘性末端退火并连接，否则将抑制噬菌体多联体的形成，使下一步的包装效率大大降低。否则将抑制噬菌体多联体的形成，使下一步的包装效率大大降低。（3）用双酶消化噬菌体载体）用双酶消化噬菌体载体2噬菌体载体臂与外源目的噬菌体载体臂与外源目的DNA 片段的连接片段的连接3 一个是载体臂与外源一个是载体臂与外源DNA 片段的比例片段的比例4 另一个是这两种另一个是这两种DNA 片段在连接反应混合液中的浓度片段在连接反应混合液中的浓度5 一般都必须进行连接预试验，以检查其效率一般都必须进行连接预试验，以检查其效率以微生物（主要有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌）以微生物（主要有大肠杆

73、菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌）受体细胞是指在转化和转导（感染）中接受外源基因的宿主细胞受体细胞是指在转化和转导（感染）中接受外源基因的宿主细胞（1）成感受态细胞）成感受态细胞（2）应为限制酶缺陷型）应为限制酶缺陷型（3）一般应为）一般应为DNA 重组缺陷型重组缺陷型（4）不适于在人体内或在非培养条件下生存）不适于在人体内或在非培养条件下生存（5）它的）它的DNA 不易转移，重组载体不易转移，重组载体DNA 只在宿主中复制只在宿主中复制大肠杆菌大肠杆菌K12的突变型的突变型H B101和和C600等作为当前重组等作为当前重组DNA 的主的主要受要受体菌。体菌。把带有目的基因的重组质粒把带有目的基因的

74、重组质粒DNA 引入受体细胞的过程称为转化。引入受体细胞的过程称为转化。将重组噬菌体将重组噬菌体DNA 直接引入受体细胞的过程称为转染。直接引入受体细胞的过程称为转染。三三重组克隆载体引入宿主细胞的转化与感染重组克隆载体引入宿主细胞的转化与感染 重组噬菌体重组噬菌体DNA 被包装到噬菌体头部成为有感染力的噬菌体颗粒，被包装到噬菌体头部成为有感染力的噬菌体颗粒，再以此噬菌体为运载体，这一过程称为转导，通常称为感染。再以此噬菌体为运载体，这一过程称为转导，通常称为感染。 重组质粒重组质粒DNA 引入大肠杆菌细胞的转化引入大肠杆菌细胞的转化 感受态：细菌吸收转化因子（感受态：细菌吸收转化因子（DNA

75、 ）的生理状态，细菌在体温下的生理状态，细菌在体温下经经CaCl2 溶液处理，再做短暂加热后，会使受体细菌中诱导产生出一种溶液处理，再做短暂加热后，会使受体细菌中诱导产生出一种短短暂的感受态。暂的感受态。 在此期间他们能够摄取各种不同来源的在此期间他们能够摄取各种不同来源的DNA 原生质体化假说和酶受体假说原生质体化假说和酶受体假说1用氯化钙制备新鲜感受态细胞及重组质粒用氯化钙制备新鲜感受态细胞及重组质粒DNA 的转化的转化2 存于存于-70C， 贮存时间过长会在一定程度上影响转化效率贮存时间过长会在一定程度上影响转化效率2用复合剂制备新鲜或冷冻的感受态细胞及重组质粒用复合剂制备新鲜或冷冻的感

76、受态细胞及重组质粒DNA 的转化的转化3 二价阳离子（二价阳离子（MnCl2 和和CaCl2 ）中更长时间，并且用氯化六氨合高钴、中更长时间，并且用氯化六氨合高钴、4D M S O 、DTT（二硫苏糖醇）等试剂复合处理细菌可提高转化效率。二硫苏糖醇）等试剂复合处理细菌可提高转化效率。3高压电穿孔转化法（电转化法）高压电穿孔转化法（电转化法）重组噬菌体重组噬菌体DNA 的体外包装与感染的体外包装与感染 用噬菌体突变株（参与包装的基因发生突变）感染适当细菌，再从感用噬菌体突变株（参与包装的基因发生突变）感染适当细菌，再从感染细菌中制备包装提取物。用此提取物对完整的噬菌体染细菌中制备包装提取物。用此

77、提取物对完整的噬菌体DNA 进行体外包装。进行体外包装。1包装提取物的制备包装提取物的制备2（1）用两个不同的溶源性菌株制备包装提取物）用两个不同的溶源性菌株制备包装提取物3 BHB2690菌株，用超声破碎法处理制备含前头部的包装提取物菌株，用超声破碎法处理制备含前头部的包装提取物4 BHB2668菌株，用冻融裂菌法处理，制备含菌株，用冻融裂菌法处理，制备含D蛋白和其他必需成分的蛋白和其他必需成分的包包5装提取物。装提取物。 大肠杆菌大肠杆菌C菌株的非抑制性溶源菌菌株的非抑制性溶源菌SMR10 内源性噬菌体内源性噬菌体DNA 的的COS 位点缺失，不能被位点缺失，不能被A蛋白识别因而不能插入前

78、蛋白识别因而不能插入前头部内，而带有头部内，而带有COS 位点的外源位点的外源DNA 则可被则可被A蛋白识别并被插入前头部，蛋白识别并被插入前头部，包包装过程可继续进行，产生感染性噬菌体颗粒。装过程可继续进行，产生感染性噬菌体颗粒。 大肠杆菌大肠杆菌C菌株缺少菌株缺少EcoK 限制系统，在包装过程中使含有未经修饰的限制系统，在包装过程中使含有未经修饰的EcoK 识别位点的外源识别位点的外源DNA 免受限制系统作用。免受限制系统作用。2重组噬菌体重组噬菌体DNA 的体外包装与感染的体外包装与感染3（1）用两种不同的提取物进行体外包装和感染）用两种不同的提取物进行体外包装和感染4（2）用一种提取物

79、进行体外包装和感染）用一种提取物进行体外包装和感染重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染磷酸钙共沉淀转染磷酸钙共沉淀转染 DEAE-葡聚糖介导的转染葡聚糖介导的转染 利用利用Polybrene的的DNA 转染转染 利用原生质体融合的利用原生质体融合的DNA 转染转染（2）只用一个溶源性菌株制备包装提取物）只用一个溶源性菌株制备包装提取物 电穿孔法电穿孔法DNA 转染转染 受体细胞的型别、不同的培养细胞系、其摄取和表达外源受体细胞的型别、不同的培养细胞系、其摄取和表达外源DNA 的能力的能力相差达几个数量级。相差达几个数量级。（1）磷酸钙和）磷酸钙和DNA 共沉淀物

80、转染法共沉淀物转染法 重组载体以磷酸钙重组载体以磷酸钙-DNA 共沉淀物形式出现，培养细胞摄取共沉淀物形式出现，培养细胞摄取DNA 的能的能力将显著提高。力将显著提高。 最佳钙离子浓度为最佳钙离子浓度为125 mmol/L，最佳最佳DNA 浓度为浓度为5-30g/ ml 沉淀反应最佳时间为沉淀反应最佳时间为20-30 min 细胞在沉淀物中的最佳暴露时间为细胞在沉淀物中的最佳暴露时间为5-42h（2）DEAE- 葡聚糖介导转染法葡聚糖介导转染法 这一聚合物这一聚合物 可能与可能与DNA 结合从而抑制核酸酶的作用，结合从而抑制核酸酶的作用， 或者与细胞结或者与细胞结合从而促进合从而促进DNA 的

81、内吞作用的内吞作用 DEAE-葡聚糖的浓度及细胞暴露于葡聚糖的浓度及细胞暴露于DNA / DEAE-葡聚糖混合液的时间是葡聚糖混合液的时间是两个大大影响本法效率的重要参数。两个大大影响本法效率的重要参数。（3）利用）利用Polybrene的的DNA 转染法转染法（4）利用原生质体融合的）利用原生质体融合的DNA 转染法转染法 用于克隆化目的基因的瞬时表达用于克隆化目的基因的瞬时表达 用于建立稳定转化的哺乳动物细胞系用于建立稳定转化的哺乳动物细胞系 转染效率较高转染效率较高（5）电穿孔法）电穿孔法DNA 转染转染 受外加电场强度、电泳冲长度、温度、受外加电场强度、电泳冲长度、温度、DNA的构象和

82、浓度、培养液的离的构象和浓度、培养液的离子成分的影响。子成分的影响。四四含目的基因重组的筛选、鉴定与分析含目的基因重组的筛选、鉴定与分析 重组体（菌）的筛选重组体（菌）的筛选1抗生素抗性基因插入失活法抗生素抗性基因插入失活法2 用某种限制酶消化并在此位点插入外源目的用某种限制酶消化并在此位点插入外源目的DNA 时，抗药性基因不时，抗药性基因不在在3被表达，称为基因插入失活。被表达，称为基因插入失活。2 2bb- -半乳糖苷酶基因插入失活法半乳糖苷酶基因插入失活法3放射性标记核酸探针杂交筛选法放射性标记核酸探针杂交筛选法4优点：具有高度的特异性和敏感性优点：具有高度的特异性和敏感性 它不要求插入

83、的外源基因表达它不要求插入的外源基因表达先在一种固体支持膜（如硝酸纤维素滤膜、尼龙膜和先在一种固体支持膜（如硝酸纤维素滤膜、尼龙膜和Whatman541滤滤纸）纸）上原位裂解待筛选的细菌菌落并使释放出的上原位裂解待筛选的细菌菌落并使释放出的DNA 固定于膜上，然后在溶液固定于膜上，然后在溶液中与放射性标记的核酸探针杂交，从而很容易的同时筛选大量菌落，从中中与放射性标记的核酸探针杂交，从而很容易的同时筛选大量菌落，从中找出带有含目的基因重组质粒的菌落。找出带有含目的基因重组质粒的菌落。（1）切口平移法）切口平移法（2）引物延伸法）引物延伸法 纯化的纯化的DNA 与过量的随机引物相混合，煮沸变性，

84、然后用与过量的随机引物相混合，煮沸变性，然后用E。coliDNA聚合酶聚合酶I的的Klenow 片段进行合成片段进行合成（3）体外转录合成）体外转录合成RNA 探针探针 一种是合成可与克隆于一种是合成可与克隆于M13 噬菌体载体上的序列互补的单链噬菌体载体上的序列互补的单链DNA探针探针 另一种是将克隆于特定载体的靶序列转录成另一种是将克隆于特定载体的靶序列转录成RNA 探针探针 只需要不含只需要不含RNA 酶的酶的DNA 酶酶I便可容易的除去便可容易的除去DNA 模板模板 RNA 探针与探针与DNA 和和RNA 形成的杂交体更稳定也不会被形成的杂交体更稳定也不会被Rnase消化，消化，可用可

85、用该酶除去非特异结合的探针。该酶除去非特异结合的探针。（4）cDNA 探探针的合成针的合成 一种是用一种是用Oligo（dT）做引物做引物 另一种则采用随机引物另一种则采用随机引物某一特定序列的浓度得以提高。某一特定序列的浓度得以提高。（5）合成寡核苷酸探针）合成寡核苷酸探针1)将菌落或噬菌斑原位转移或影印到硝酸纤维素滤膜上将菌落或噬菌斑原位转移或影印到硝酸纤维素滤膜上2)裂解菌落或噬菌体并使释放的裂解菌落或噬菌体并使释放的DNA 原位结合与滤膜上原位结合与滤膜上 扣除杂交的方法，制取单链标记扣除杂交的方法，制取单链标记cDNA 吸收探针，使吸收探针，使cDNA 探探针中针中1)固定于滤膜上的

86、细菌固定于滤膜上的细菌DNA 或噬菌体或噬菌体DNA 与标记探针进行杂交与标记探针进行杂交4免疫化学筛选法免疫化学筛选法该法的特点是直接检测克隆基因所表达的蛋白质产物，故应用该法时该法的特点是直接检测克隆基因所表达的蛋白质产物，故应用该法时必须事先制备针对该蛋白质或多肽的抗血清或单克隆抗体，而最佳抗体应必须事先制备针对该蛋白质或多肽的抗血清或单克隆抗体，而最佳抗体应当是与目的蛋白（抗原）不同表位反应的一组单克隆抗体混合物，或者是当是与目的蛋白（抗原）不同表位反应的一组单克隆抗体混合物，或者是不与宿主成分反应的高滴度多克隆抗体。不与宿主成分反应的高滴度多克隆抗体。 放射化学检测制剂可用抗第一抗体

87、种特异性决定簇的放射化学检测制剂可用抗第一抗体种特异性决定簇的125I标记抗抗体标记抗抗体或或125I标记金黄色葡萄球菌标记金黄色葡萄球菌A 蛋白。蛋白。 酶法检测制剂可用与辣根过氧化物酶（酶法检测制剂可用与辣根过氧化物酶（H R P ）缀合的第二抗体或缀合的第二抗体或与碱性磷酸酶（与碱性磷酸酶（AP ）缀合的第二抗体形成不溶性有色沉淀。缀合的第二抗体形成不溶性有色沉淀。 重组体的鉴定重组体的鉴定1凝胶电泳鉴定法凝胶电泳鉴定法标准方法标准方法直接用溴化乙锭进行染色以确定直接用溴化乙锭进行染色以确定DNA 在凝胶中的位置，并直接与紫外在凝胶中的位置，并直接与紫外 灯下观察灯下观察DNA 条带。条

88、带。应有两条带：一条是泳动速度较慢分子量较大的带（相当于质粒载体应有两条带：一条是泳动速度较慢分子量较大的带（相当于质粒载体DNA ） 另一条是泳动速度较快分子量较小的带（相当于目的另一条是泳动速度较快分子量较小的带（相当于目的 基因基因DNA 片段）片段） 平板裂解物法和液体培养法平板裂解物法和液体培养法2Southern转移杂交法转移杂交法3（1）琼脂糖凝胶电泳分离重组）琼脂糖凝胶电泳分离重组DNA 的限制酶切片段的限制酶切片段4（2）将）将DNA 从琼脂糖凝胶转移到固相支持体上从琼脂糖凝胶转移到固相支持体上5 硝酸纤维素滤膜或尼龙膜硝酸纤维素滤膜或尼龙膜6 毛细管转移法毛细管转移法 真空

89、转移法真空转移法7（3）放射性标记探针与固着于膜上的）放射性标记探针与固着于膜上的DNA 杂交杂交3基因产物鉴定法基因产物鉴定法4 常用体外转译法对基因产物进行鉴定。从细胞中提取的天然常用体外转译法对基因产物进行鉴定。从细胞中提取的天然mRNA 或或通通5 过克隆化的过克隆化的DNA在体外转录产生的在体外转录产生的mRNA，在无细胞提取液中在无细胞提取液中能被翻译而合成能被翻译而合成6 蛋白质，这些体外翻译反应产物可通过免疫沉淀或蛋白质，这些体外翻译反应产物可通过免疫沉淀或SDS聚丙烯聚丙烯酰胺凝胶电泳酰胺凝胶电泳7 加以分析鉴定，对原核生物的基因产物进行鉴定，常用大肠杆加以分析鉴定，对原核生

90、物的基因产物进行鉴定，常用大肠杆菌或枯草芽菌或枯草芽 胞苷菌无细胞系统，而对真核生物基因产物常用兔网织红细胞裂解胞苷菌无细胞系统，而对真核生物基因产物常用兔网织红细胞裂解液或麦胚液或麦胚提取物提取物 重组重组DNA 的序列分析的序列分析 一种是一种是Sanger双脱氧链终止法（酶法）测序双脱氧链终止法（酶法）测序 另一种是另一种是Maxam-Gilbert DNA 化学降解法测序化学降解法测序 1 Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法DNA 测序的主要试剂测序的主要试剂 （1）模板）模板 （2）通用引物）通用引物 （3）DNA 聚合酶聚合酶I的的Klenow 段段、反转录酶、反转录酶、Ta

91、q DNA 聚合酶、测序聚合酶、测序酶、酶、 测序酶测序酶2.0版版 （4）采用）采用32SdATP （5）采用诸如采用诸如dITP或或7-脱氮脱氮-dGTP2Sanger双脱氧链终止法测序过程双脱氧链终止法测序过程一是退火反应，即寡核苷酸引物与模板一是退火反应，即寡核苷酸引物与模板DNA 杂交杂交 二是二是4组链延伸组链延伸-链终止反应链终止反应96孔孔U形孔微量滴定板中进行形孔微量滴定板中进行测序仪：测序仪：P E公司推出的公司推出的ABI PRISM310型全自动型全自动DNA 测序仪测序仪 310型测序仪采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺凝胶平板型测序仪采用毛细管电泳技术取代传统的

92、聚丙烯酰胺凝胶平板电泳进行电泳进行DNA 测序分析，不仅具有测序分析，不仅具有DNA 测序、测序、PCR 片段大小分析和片段大小分析和定量分析功能，而且实现了全部操作自动化，包括自动灌胶、自定量分析功能，而且实现了全部操作自动化，包括自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析。动进样、自动数据收集分析。 377型测序仪采用四种荧光染料标记、激光检测的方法。型测序仪采用四种荧光染料标记、激光检测的方法。 五五 目的基因在宿主细胞中的表达目的基因在宿主细胞中的表达 基因表达在原核生物和真核生物中是有区别的，在原核生物中基因表基因表达在原核生物和真核生物中是有区别的，在原核生物中基因表达是以操纵子形式进行

93、，砖录是在核内进行，先生成达是以操纵子形式进行，砖录是在核内进行，先生成hnRNA ，再加工去掉再加工去掉内含子，修饰内含子，修饰5和和3末端才形成末端才形成mRNA 。而而mRNA 只能在细胞浆的核糖体只能在细胞浆的核糖体中转译成多肽或蛋白质，再经加工、糖化、形成高级结构。中转译成多肽或蛋白质，再经加工、糖化、形成高级结构。 原核细胞（主要是大肠杆菌）原核细胞（主要是大肠杆菌） 真核细胞表达体系，如酵母与哺乳动物细胞系真核细胞表达体系，如酵母与哺乳动物细胞系目的基因在原核细胞中的表达目的基因在原核细胞中的表达1在大肠杆菌中表达合成完整天然蛋白在大肠杆菌中表达合成完整天然蛋白在细菌中表达原核蛋

94、白时，首先必须选择带有可调控的强原核启动子在细菌中表达原核蛋白时，首先必须选择带有可调控的强原核启动子的表达载体。的表达载体。噬菌体噬菌体PL启动子、启动子、tac启动子和启动子和T7噬菌体噬菌体10启动子启动子从外部同时提供启动子和有效的核糖体结合位点从外部同时提供启动子和有效的核糖体结合位点 起始密码子（起始密码子（ATG）和和Shine-D-algarno序列，后者简称序列，后者简称SD序列序列 mRNA 上的上的SD序列与序列与16SrRNA上的上的3端序列之间形成碱基配对，由端序列之间形成碱基配对，由此此带动核糖体与带动核糖体与mRNA 的的结合。结合。 一种是可使克隆化目的基因表达

95、为一种是可使克隆化目的基因表达为融合蛋白融合蛋白的一部分的一部分 融合蛋白由位于其氨基端的原核蛋白、能被蛋白酶或溴化氰裂解的序融合蛋白由位于其氨基端的原核蛋白、能被蛋白酶或溴化氰裂解的序列以及目的蛋白三部分组成。列以及目的蛋白三部分组成。 融合蛋白通常较稳定，易于鉴定并可用作抗原，也可产生不含氨基端融合蛋白通常较稳定，易于鉴定并可用作抗原，也可产生不含氨基端甲硫氨酸的蛋白甲硫氨酸的蛋白 高效表达高效表达 由双分子胰岛素原组成由双分子胰岛素原组成 另一种是外源蛋白的分泌型表达系统另一种是外源蛋白的分泌型表达系统 融合到编码信号肽的融合到编码信号肽的DNA 中而实现的中而实现的 可使蛋白质按适当方

96、式折叠可使蛋白质按适当方式折叠 通常产量不高通常产量不高2克隆化目的基因表达水平的提高与检测克隆化目的基因表达水平的提高与检测3 RNA 不稳定、过早终止、无效翻译及蛋白质不稳定不稳定、过早终止、无效翻译及蛋白质不稳定1)蛋白质缺陷型菌株蛋白质缺陷型菌株2)在培养和收获细胞期间使用蛋白酶抑制剂在培养和收获细胞期间使用蛋白酶抑制剂3)通过提高目的蛋白的合成量加以克服通过提高目的蛋白的合成量加以克服4)（1）运用定点诱变技术使核糖体结合位点（）运用定点诱变技术使核糖体结合位点（SD 序列和起始密码子序列和起始密码子ATG ）5)周围的碱基对发生突变。周围的碱基对发生突变。6)（2）试用不同表达水平

97、的大肠杆菌宿主菌株，如利用转录终止缺陷型）试用不同表达水平的大肠杆菌宿主菌株，如利用转录终止缺陷型菌株菌株7)或或RNA 代谢突变株，可提高功能性代谢突变株，可提高功能性RNA 的合成量。的合成量。8)（3）在目的基因）在目的基因DNA 的下游装置一段的下游装置一段DNA 序列序列9)（4）通过改变温度、核糖体结合位点、启动子强度、质粒拷贝数或诱）通过改变温度、核糖体结合位点、启动子强度、质粒拷贝数或诱导物导物10) 的量。的量。 目的基因在真核细胞中的表达目的基因在真核细胞中的表达 原核细胞对真核生物活性蛋白不能进行有效的翻译后加工原核细胞对真核生物活性蛋白不能进行有效的翻译后加工 包括二硫

98、键形成、糖基化、磷酸化、寡聚体形成、特异性蛋白裂解包括二硫键形成、糖基化、磷酸化、寡聚体形成、特异性蛋白裂解 真核蛋白比活力都很低，与蛋白质的折叠方式不正确或折叠效率低有关真核蛋白比活力都很低，与蛋白质的折叠方式不正确或折叠效率低有关 真核细胞（如哺乳动物细胞）表达系统可以分为两类：真核细胞（如哺乳动物细胞）表达系统可以分为两类： 一类是采用病毒载体的表达系统一类是采用病毒载体的表达系统 另一类是转染另一类是转染DNA 的表达系统的表达系统 克隆化的目的基因必须插入适当的表达载体并在细菌中克隆和复制扩克隆化的目的基因必须插入适当的表达载体并在细菌中克隆和复制扩增后才转染哺乳动物细胞。增后才转染

99、哺乳动物细胞。 用于在哺乳动物细胞中导入和表达克隆化目的基因的质粒载体经过改用于在哺乳动物细胞中导入和表达克隆化目的基因的质粒载体经过改造后既带有与待表达基因序列造后既带有与待表达基因序列5端和端和3端相匹配的限制酶切位点，又带端相匹配的限制酶切位点，又带有具备所需特异性的调控序列有具备所需特异性的调控序列元件元件。 复制子、抗生素抗性基因、单一限制酶切位点复制子、抗生素抗性基因、单一限制酶切位点（1）启动子与增强子）启动子与增强子 根据用于表达重组基因的细胞型别来决定根据用于表达重组基因的细胞型别来决定 TATA 25-30bp 引导引导RNA 聚合酶聚合酶II在正确位点上起始在正确位点上起

100、始RNA 的合成的合成 100-200bp 决定转录起始的速率决定转录起始的速率 SV40早期基因增强子早期基因增强子（2）加）加poly（A）信号信号 一种是位于一种是位于poly（A）位点下游的位点下游的GU 丰富区或丰富区或U丰富区丰富区 另一种是位于另一种是位于poly（A）位点上游位点上游11-30个核苷酸的一段高度保守的六个核苷酸的一段高度保守的六核苷酸序列核苷酸序列A A U A A A。（3）剪接信号剪接信号 在一级转录物上加上在一级转录物上加上poly（A）后通过剪接除去内含子并产生成熟的后通过剪接除去内含子并产生成熟的mRNA ，然后在从细胞核转运到细胞质。然后在从细胞核转

101、运到细胞质。 内含子最前面（内含子最前面（G U）和最后面（和最后面（A G）的两个核苷酸总是保持不变的两个核苷酸总是保持不变 剪接点之间的距离和周围的剪接点之间的距离和周围的DNA 序列，包括剪接点侧翼的外显子序列的序列，包括剪接点侧翼的外显子序列的改变，显著影响改变，显著影响 mRNA 前前体的剪接历程和剪接点的使用效率。体的剪接历程和剪接点的使用效率。（4）用于复制和选择的元件）用于复制和选择的元件 病毒复制子病毒复制子 表达转染目的基因的重组细胞必须通过在同一细胞中引入另一种选择标表达转染目的基因的重组细胞必须通过在同一细胞中引入另一种选择标记基因才能得以识别分离。记基因才能得以识别分

102、离。 将编码目的蛋白的目的基因（在一个质粒上）和编码选择标记蛋白的基将编码目的蛋白的目的基因（在一个质粒上）和编码选择标记蛋白的基因用共转染方法同时导入哺乳动物细胞。因用共转染方法同时导入哺乳动物细胞。 六六 基因工程药物无性繁殖系的组建实例基因工程药物无性繁殖系的组建实例人胰岛素原融合蛋白重组菌株的组建人胰岛素原融合蛋白重组菌株的组建1重组表达质粒重组表达质粒pJG202的构建与鉴定的构建与鉴定2重组质粒重组质粒pJG202在大肠杆菌中的表达在大肠杆菌中的表达人人a2b型干扰素（型干扰素（hIFN-a a2b）工程菌株的组建工程菌株的组建 双双SD 顺序顺序hIFN-a a2b基因的获得基因

103、的获得重组表达质粒重组表达质粒pMZI2 B的构建的构建人人a a2 2b b型干扰素工程菌株的形成与基因的表达型干扰素工程菌株的形成与基因的表达粒细胞巨噬细胞集落刺激因子工程菌株的组建粒细胞巨噬细胞集落刺激因子工程菌株的组建1R T-PCR 法制备法制备GM-CSF cDNA2GM-CSF重组表达载体与工程菌株的组建重组表达载体与工程菌株的组建乙型肝炎表面抗原重组酵母的组建乙型肝炎表面抗原重组酵母的组建1H BsAg基因重组表达质粒基因重组表达质粒pLS1和和pLS2的构建的构建2 这个质粒在乳酸克鲁维酵母及大肠杆菌中都能复制这个质粒在乳酸克鲁维酵母及大肠杆菌中都能复制3 Xba I Sal

104、 I4 插入片段的方向通过电泳检查插入片段的方向通过电泳检查Xba I和和Sal I双酶切片段的大小来确定双酶切片段的大小来确定52 重组表达质粒的转化及重组表达质粒的转化及H BsAg的表达的表达人组织型纤溶酶原激活剂组合突变株人组织型纤溶酶原激活剂组合突变株CHO 细胞株的组建细胞株的组建1真核表达质粒真核表达质粒pLFrGGI的构建的构建2 FrGGI SV40E Ad M LP SV40P3 采用二氢叶酸还原酶的竞争性抑制剂氨甲喋呤采用二氢叶酸还原酶的竞争性抑制剂氨甲喋呤(M T X)选择加压共扩选择加压共扩增增4外源基因。外源基因。52 高效表达高效表达FrGGI（t P A突变体）

105、的突变体）的C H O 细胞株的获得细胞株的获得 红细胞生成素中国仓鼠卵巢细胞株的组建红细胞生成素中国仓鼠卵巢细胞株的组建1质粒与细胞株质粒与细胞株2EPO 真核重组表达质粒真核重组表达质粒p M G L4的构建的构建3重组表达质粒转染重组表达质粒转染COS-7细胞及产物表达细胞及产物表达4重组表达质粒转染重组表达质粒转染C H O-dhfr-细胞及细胞及EPO 表达表达5 氨甲喋呤（氨甲喋呤（M T X） 可以可以 控制控制人肿瘤坏死因子昆虫细胞株的组建人肿瘤坏死因子昆虫细胞株的组建1含含h T N F-aa基因的重组质粒的构建基因的重组质粒的构建2共转染与重组病毒的获得共转染与重组病毒的获

106、得3重组病毒感染重组病毒感染Sf21细胞及细胞及h T N F-aa的表达的表达 第四节第四节 基因工程药物的生产基因工程药物的生产一一基因工程菌株（细胞）的培养与发酵基因工程菌株（细胞）的培养与发酵二二 宿主、载体和克隆基因宿主、载体和克隆基因三三 环境条件环境条件工程细菌的培养与发酵工程细菌的培养与发酵（1）发酵用工程菌株的筛选）发酵用工程菌株的筛选（2）发酵培养基的选用）发酵培养基的选用（3）接种量对发酵的影响）接种量对发酵的影响（4）溶解氧（）溶解氧（DO ）水平对发酵的影响水平对发酵的影响（5）pH对工程菌株生长和表达的影响对工程菌株生长和表达的影响 前期培养阶段着重于优化工程菌株的

107、最佳生长条件前期培养阶段着重于优化工程菌株的最佳生长条件 后期培养阶段着重于优化外源蛋白的表达条件后期培养阶段着重于优化外源蛋白的表达条件（6）热诱导时机对产物表达量的影响）热诱导时机对产物表达量的影响 一般在菌体对数生长期或对数生长后期进行生温诱导表达一般在菌体对数生长期或对数生长后期进行生温诱导表达 分批发酵培养分批发酵培养（7）热诱导的升温时间对发酵的影响）热诱导的升温时间对发酵的影响（8）高密度对发酵的影响）高密度对发酵的影响 单纯追求高密度发酵的结果是徒然的单纯追求高密度发酵的结果是徒然的 没有明显的蛋白产物条带，发酵产物没有生产应用价值没有明显的蛋白产物条带，发酵产物没有生产应用价

108、值 工程酵母的培养与发酵工程酵母的培养与发酵 基因工程乙肝疫苗通常可使用三种表达系统，即酵母系统、哺乳动物基因工程乙肝疫苗通常可使用三种表达系统，即酵母系统、哺乳动物细胞系统及疫苗病毒载体系统。细胞系统及疫苗病毒载体系统。（1）乙肝基因工程酵母细胞）乙肝基因工程酵母细胞 重组质粒由三部分组成穿梭质粒重组质粒由三部分组成穿梭质粒（2）工程酵母菌株的制备与培养）工程酵母菌株的制备与培养（3）工程酵母的发酵）工程酵母的发酵 工程细胞的培养与发酵工程细胞的培养与发酵（1）工程细胞株）工程细胞株（2）工程细胞的扩增培养）工程细胞的扩增培养（3）生物反应器的细胞培养与）生物反应器的细胞培养与rhEPO的生

109、产的生产 填充床生物反应器填充床生物反应器二二基因工程药物的分离纯化基因工程药物的分离纯化三三基因工程药物分离纯化的费用占整个生产费用的基因工程药物分离纯化的费用占整个生产费用的80%-90%四四特点：特点：（1）产物大多数处于细胞内，提取前需将细胞破碎）产物大多数处于细胞内，提取前需将细胞破碎五五 （2）产物浓度较低、杂质多，而最后成品要求达到的纯度高）产物浓度较低、杂质多，而最后成品要求达到的纯度高六六 （3）产物都是大分子蛋白质，通常不稳定，遇热、极端）产物都是大分子蛋白质，通常不稳定，遇热、极端pH、有有机机溶剂和剪切力等易引起失活。溶剂和剪切力等易引起失活。影响基因工程产物分离纯化工

110、艺设计的主要因素影响基因工程产物分离纯化工艺设计的主要因素1产物活性、纯度和杂质产物活性、纯度和杂质2 首先应建立基因工程产物活性、纯度及可能含有杂质的有效检测首先应建立基因工程产物活性、纯度及可能含有杂质的有效检测方法方法3 SDS-PAGE、HPLC、毛细管电泳、等电点聚焦、肽谱分析和氨毛细管电泳、等电点聚焦、肽谱分析和氨基酸分析基酸分析2产物表达形式和表达水平产物表达形式和表达水平3 真菌和动植物细胞一般以分泌的形式表达真菌和动植物细胞一般以分泌的形式表达4 特点：其表达基因产物的形式有胞内不溶性表达（包涵体）、胞特点：其表达基因产物的形式有胞内不溶性表达（包涵体）、胞内可内可5溶性表达

111、、细胞周质表达等多种溶性表达、细胞周质表达等多种3产物本身的分子特性产物本身的分子特性4产物的用途和需求量产物的用途和需求量5 体外诊断试剂纯度在体外诊断试剂纯度在80%以上，体内治疗产品应达到以上，体内治疗产品应达到98%以上以上各种产物表达形式采用的分离纯化方法各种产物表达形式采用的分离纯化方法1细胞内不溶性表达产物细胞内不溶性表达产物-包涵体包涵体2 高产量使某些目的蛋白质以不溶性形式产生并聚集形成蛋白质聚高产量使某些目的蛋白质以不溶性形式产生并聚集形成蛋白质聚合物合物3-包涵体。包涵体。4（1）菌体细胞的收集与破碎）菌体细胞的收集与破碎5 物理、化学和酶学三种方法物理、化学和酶学三种方

112、法6 超声波破碎、高压匀浆和加沙研磨超声波破碎、高压匀浆和加沙研磨7 碱和表面活性剂碱和表面活性剂8（2）包涵体的分离、洗涤与溶解）包涵体的分离、洗涤与溶解9 离心法离心法10 低浓度弱变性剂（如尿素）低浓度弱变性剂（如尿素） 表面活性剂（如表面活性剂（如Triton X-100）11 硫酸链霉素沉淀和酚抽提硫酸链霉素沉淀和酚抽提 溶解包涵体打断蛋白质分子内和分子间的非共价键、离子键和疏水作用溶解包涵体打断蛋白质分子内和分子间的非共价键、离子键和疏水作用 溶解包涵体的试剂包括尿素、烟酸胍、溶解包涵体的试剂包括尿素、烟酸胍、SDS 、碱性溶剂和有机溶剂碱性溶剂和有机溶剂 还有一种用离子交换树脂溶

113、解包涵体的方法还有一种用离子交换树脂溶解包涵体的方法（3）变性蛋白质的纯化）变性蛋白质的纯化 柱层析、凝胶过滤、离子交换层析和高效液相色谱（柱层析、凝胶过滤、离子交换层析和高效液相色谱（H P L C）（4）重组蛋白质的复性重组蛋白质的复性2分泌型表达产物分泌型表达产物 3 浓缩的方法包括沉淀和超滤浓缩的方法包括沉淀和超滤4 沉淀包括中性盐、有机溶剂和高分子聚合物等方法沉淀包括中性盐、有机溶剂和高分子聚合物等方法5 截留不同分子量的膜供应截留不同分子量的膜供应63 大肠杆菌细胞内可溶性表达产物大肠杆菌细胞内可溶性表达产物7 亲和层析分离法亲和层析分离法4大肠杆菌细胞周质表达蛋白大肠杆菌细胞周质

114、表达蛋白5 渗透压休克的方法渗透压休克的方法6 回收到高质量的蛋白产物回收到高质量的蛋白产物三三基因工程药物的质量控制基因工程药物的质量控制四四 产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性 第三章第三章 细细 胞胞 工工 程程 制制 药药Question one：1 什么叫细胞工程？它有哪几大核心技术什么叫细胞工程？它有哪几大核心技术 2 举例说明细胞工程的应用举例说明细胞工程的应用 3 什么叫细胞融合？有哪些主要类型？哪些方法？什么叫细胞融合？有哪些主要类型？哪些方法？ 第一节第一节细胞工程概细胞工程概 述述 它是应用细胞生物学和分子生物学等

115、学科的理论和技术，按照人们的它是应用细胞生物学和分子生物学等学科的理论和技术，按照人们的需要，有计划、大规模地培养生物组织和细胞以获得生物及其产品，或者需要，有计划、大规模地培养生物组织和细胞以获得生物及其产品，或者通过改变细胞的遗传组成以产生新的种或品种。通过改变细胞的遗传组成以产生新的种或品种。 动植物细胞和组织培养技术动植物细胞和组织培养技术 细胞融合和细胞器操作技术细胞融合和细胞器操作技术 染色体工程技术、染色体工程技术、DNA 重组技术重组技术 菌苗、疫苗、抗生素、生物活性物质、抗体等五大类菌苗、疫苗、抗生素、生物活性物质、抗体等五大类 把淋巴细胞杂交瘤技术与把淋巴细胞杂交瘤技术与D

116、NA 重组技术结合起来使用重组技术结合起来使用细胞工程与基因工程的差异除被转移的遗传物质的水平以及方法细胞工程与基因工程的差异除被转移的遗传物质的水平以及方法完全不同外，在选择、纯化、鉴定等步骤与方法等方面基本类似。完全不同外，在选择、纯化、鉴定等步骤与方法等方面基本类似。细菌添加剂细菌添加剂甾体激素可以采用微生物反应与化学反应相结合的方式来生产甾体激素可以采用微生物反应与化学反应相结合的方式来生产 1111aa位羟化反应、位羟化反应、1111bb位羟化反应、氧化反应和脱氢反应位羟化反应、氧化反应和脱氢反应 第二节第二节 细细 胞胞 融融 合合一一细胞融合技术细胞融合技术的发展的发展细胞融合是

117、指人为的使两种不同的生物细胞在同一培养器中，用细胞融合是指人为的使两种不同的生物细胞在同一培养器中，用无性的人工方法进行直接接触，产生能同时表达两个亲本细胞有无性的人工方法进行直接接触，产生能同时表达两个亲本细胞有益性状的细胞杂交技术。益性状的细胞杂交技术。 植物或微生物原生质体植物或微生物原生质体 原生质体融合原生质体融合 细胞融合可发生于同种生物之间，如卵子与精子相融合形成受精卵，细胞融合可发生于同种生物之间，如卵子与精子相融合形成受精卵，然后再繁殖成个体，这是一种有性过程。然后再繁殖成个体，这是一种有性过程。 1838年年Miller 多核细胞多核细胞 1875年年 蛙的血细胞中也存在多

118、核细胞蛙的血细胞中也存在多核细胞 人们发现麻疹病毒和腮腺炎病毒能引起细胞融合人们发现麻疹病毒和腮腺炎病毒能引起细胞融合 冈田善雄用高浓度仙台病毒在体外使小鼠艾氏腹水瘤细胞得以融合冈田善雄用高浓度仙台病毒在体外使小鼠艾氏腹水瘤细胞得以融合 1975年年Milstein和和Kohlor两人首先将骨髓瘤细胞和脾细胞进行融合，两人首先将骨髓瘤细胞和脾细胞进行融合，创建了杂交瘤技术。创建了杂交瘤技术。 1972年卡尔逊揭开了植物细胞杂交的序幕年卡尔逊揭开了植物细胞杂交的序幕 马铃薯和番茄的原生质体进行融合马铃薯和番茄的原生质体进行融合 溶菌酶溶菌酶 蜗牛酶蜗牛酶 化学融合方法化学融合方法 聚乙二醇（聚乙

119、二醇（PEG）鸡红细胞与酵母细胞的融合鸡红细胞与酵母细胞的融合 HeLa细胞与烟草细胞的融合细胞与烟草细胞的融合同时也正朝着将抗药性和胞质雄性不育等细胞质基因导入另一个体同时也正朝着将抗药性和胞质雄性不育等细胞质基因导入另一个体细胞的方向发展，有可能形成新的核质杂种。细胞的方向发展，有可能形成新的核质杂种。二二细胞工程中遗传物质的转移途径细胞工程中遗传物质的转移途径三三 细胞遗传物质是指细胞遗传物质是指DNA ，包括细胞核包括细胞核DNA 、细胞质叶绿体细胞质叶绿体DNA 、线粒体线粒体DNA 和质粒和质粒DNA 等。等。四四 遗传物质转移技术是指转移核或含有遗传物质转移技术是指转移核或含有D

120、NA的细胞器的技术的细胞器的技术1 完整细胞之间的融合作用完整细胞之间的融合作用 首先要制备出强选择性的两种亲本细胞首先要制备出强选择性的两种亲本细胞 一般取对数生长期细胞为融合材料一般取对数生长期细胞为融合材料 常常发生染色体丢失常常发生染色体丢失2核体与完整细胞或胞质体的融合作用核体与完整细胞或胞质体的融合作用3 细胞松弛素细胞松弛素B 松胞素松胞素B （C B ）作用下细胞核能从细胞质中分离出来作用下细胞核能从细胞质中分离出来4 细胞核连同其外面薄层细胞质构成的颗粒称为核体细胞核连同其外面薄层细胞质构成的颗粒称为核体5 不具有细胞核而仅有细胞质的细胞称为胞质体不具有细胞核而仅有细胞质的细

121、胞称为胞质体3胞质体与完整细胞的融合作用胞质体与完整细胞的融合作用4脂质体介导的细胞融合脂质体介导的细胞融合将重组将重组DNA 分子包埋于脂质体微囊内，通过脂质体微囊与宿主细胞融分子包埋于脂质体微囊内，通过脂质体微囊与宿主细胞融合作用，将外源性目的基因转移至宿主体内的过程。合作用，将外源性目的基因转移至宿主体内的过程。脂质体的制备过程是在含重组脂质体的制备过程是在含重组DNA 分子的水溶液中加入磷脂及吐温分子的水溶液中加入磷脂及吐温80等乳化剂，通过激烈搅拌或超声波处理，将磷脂分散于水溶液中，静置后，等乳化剂，通过激烈搅拌或超声波处理，将磷脂分散于水溶液中，静置后，磷脂分子则群集成液晶态脂质双

122、层薄膜，将含重组磷脂分子则群集成液晶态脂质双层薄膜，将含重组DNA 分子的水滴包裹于分子的水滴包裹于微囊内，构成一个人工原生质体及脂质体。微囊内，构成一个人工原生质体及脂质体。抗药性受细胞质控制，主要受细胞质中的线粒体、叶绿体控制。抗药性受细胞质控制，主要受细胞质中的线粒体、叶绿体控制。5微细胞与完整细胞的融合微细胞与完整细胞的融合6 一个或几个染色体外包裹一薄层细胞质的小体称为微细胞一个或几个染色体外包裹一薄层细胞质的小体称为微细胞7 对数生长期的动物细胞用秋水仙素处理对数生长期的动物细胞用秋水仙素处理8 微细胞杂种细胞微细胞杂种细胞6生物大分子引入完整细胞生物大分子引入完整细胞三三细胞融合

123、的方法细胞融合的方法P E G ，它具有强烈的吸水性以及凝聚、沉淀蛋白质的作用它具有强烈的吸水性以及凝聚、沉淀蛋白质的作用 1000-6000的的P E G 均可用作促溶剂均可用作促溶剂 P E G 对细胞有一定毒性作用，相对分子质量越大，其毒性作用越强对细胞有一定毒性作用，相对分子质量越大，其毒性作用越强 应预先测试应预先测试P E G 对细胞的毒性作用及使用条件，包括融合时对细胞的毒性作用及使用条件，包括融合时PEG的的实际浓度、作用时间及反应温度。实际浓度、作用时间及反应温度。 可通过电脉冲作用促进细胞融合，这种方法叫电融合。可通过电脉冲作用促进细胞融合，这种方法叫电融合。 最低电场强度

124、，使排成单行的细胞既不形成珠链，又使不同类型的最低电场强度，使排成单行的细胞既不形成珠链，又使不同类型的两个两个细胞具有一定的吸引力，进而能互相配对，形成融合细胞。细胞具有一定的吸引力，进而能互相配对，形成融合细胞。四四影响细胞融合的因素影响细胞融合的因素五五 在细胞融合过程中，除促溶剂外，温度、在细胞融合过程中，除促溶剂外，温度、pH、离子强度及离子种离子强度及离子种类等均类等均六六影响细胞融合率。影响细胞融合率。七七 通常耗氧量较大通常耗氧量较大八八 融合时最适离子浓度一般为融合时最适离子浓度一般为0.10mol/L，最适最适pH值为值为7.4-7.8九九五五 细胞融合操作中的技术问题细胞

125、融合操作中的技术问题亲本细胞的选择亲本细胞的选择 细胞具有全能性细胞具有全能性 体细胞发育成植株的可能性也有极大差异体细胞发育成植株的可能性也有极大差异 选择酶缺陷型、营养缺陷型、对药物敏感的细胞；或者设法在体外培养选择酶缺陷型、营养缺陷型、对药物敏感的细胞；或者设法在体外培养过程中使细胞产生变异而获得某些新的有用性状。过程中使细胞产生变异而获得某些新的有用性状。变异细胞的筛选方法变异细胞的筛选方法 利用微环境的变化在细胞水平上诱发变异和进行选择利用微环境的变化在细胞水平上诱发变异和进行选择 变异细胞可供三方面应用，一是大量培养细胞，获得有用代谢产物；二变异细胞可供三方面应用，一是大量培养细胞

126、，获得有用代谢产物；二是形成植株，培育农作物新品种；三是用作细胞杂交的亲本细胞。是形成植株，培育农作物新品种；三是用作细胞杂交的亲本细胞。1 正选择系统正选择系统2负选择系统负选择系统35-溴脱氧尿苷（溴脱氧尿苷（B U d B）系统和高氯酸系统系统和高氯酸系统提高杂种细胞形成率的措施提高杂种细胞形成率的措施 部分异核体因核部分异核体因核DNA 复制与核分裂不协调而死亡复制与核分裂不协调而死亡 通常把杂种细胞占原亲本细胞的百分率称为杂种细胞形成率通常把杂种细胞占原亲本细胞的百分率称为杂种细胞形成率Question two：1 细胞融合操作中应注意哪些问题？细胞融合操作中应注意哪些问题？ 2 杂

127、种细胞的筛选是什么？有哪些主要筛选系统？杂种细胞的筛选是什么？有哪些主要筛选系统？1原生质体与杂种细胞形成率的关系原生质体与杂种细胞形成率的关系2 原生质球之间也有融合现象的出现，而且杂种细胞形成率高于原生原生质球之间也有融合现象的出现，而且杂种细胞形成率高于原生质质3体融合的对照组。体融合的对照组。4 原生质体受到酶的损伤，不容易使细胞壁再生原生质体受到酶的损伤，不容易使细胞壁再生2影响多核体核影响多核体核DNA 复制的因素复制的因素3 通常将一个细胞内含有多个细胞核的细胞称为多核体通常将一个细胞内含有多个细胞核的细胞称为多核体4 同型多核体同型多核体5 异型多核体（异核体）异型多核体（异核

128、体）6 异核体内几个细胞核异核体内几个细胞核DNA 的合成以及细胞分裂能否趋于同步，是的合成以及细胞分裂能否趋于同步，是决定决定7 异核体能否生长与繁殖的关键，它和融合时亲本细胞的生理状态、异核体能否生长与繁殖的关键，它和融合时亲本细胞的生理状态、亲本细胞所处的生理周期以及亲本细胞的种类等因素有关。亲本细胞所处的生理周期以及亲本细胞的种类等因素有关。8 细胞周期可分为细胞周期可分为G1期、期、S期、期、G2期与期与M 期四个时期期四个时期 间期间期 有丝分裂期有丝分裂期 只要在只要在G1期早期合成了一定量的蛋白质，细胞就能无阻碍的进入期早期合成了一定量的蛋白质，细胞就能无阻碍的进入S期期 早熟

129、染色体凝集早熟染色体凝集 可能会逐渐死亡或发生染色体丢失可能会逐渐死亡或发生染色体丢失 选用选用S期细胞作为融合亲本比较合适期细胞作为融合亲本比较合适3营养缺陷型亲本细胞的生理效应对杂种细胞形成率的影响营养缺陷型亲本细胞的生理效应对杂种细胞形成率的影响稳定杂种细胞的遗传性稳定杂种细胞的遗传性 细胞融合形成的杂种细胞，经常会发生染色体丢失细胞融合形成的杂种细胞，经常会发生染色体丢失稳定它的遗传性稳定它的遗传性 一一 在融合后要尽可能多的筛选出显示有用性状的杂种细胞在融合后要尽可能多的筛选出显示有用性状的杂种细胞 只有从大量有用性状尚不稳定的杂种细胞筛选只有从大量有用性状尚不稳定的杂种细胞筛选 二

130、二 杂种细胞传代过程中，要尽量稳定培养条件杂种细胞传代过程中，要尽量稳定培养条件在融合前把一个亲本细胞也培养在有用性状亲本细胞的环境中在融合前把一个亲本细胞也培养在有用性状亲本细胞的环境中六六杂种细胞的筛选原理及筛选系统杂种细胞的筛选原理及筛选系统筛选原理筛选原理 异型融合细胞、两种同型融合细胞（双核或多核）、未发生融合异型融合细胞、两种同型融合细胞（双核或多核）、未发生融合的两的两 种亲本细胞。种亲本细胞。 在培养过程中利用选择性培养基，终止同型多核、异型多核以及在培养过程中利用选择性培养基，终止同型多核、异型多核以及未融未融 合亲本细胞的繁殖，仅允许异型多核细胞繁殖。合亲本细胞的繁殖，仅允

131、许异型多核细胞繁殖。筛选系统筛选系统抗药性筛选系统抗药性筛选系统 细胞的生长受到药物细胞的生长受到药物A抑制对药物抑制对药物B不敏感；不敏感； 另一种亲本细胞的生长受到药物另一种亲本细胞的生长受到药物B的抑制对药物的抑制对药物A不敏感。不敏感。 将两种亲本细胞的融合混合物置于同时含有药物将两种亲本细胞的融合混合物置于同时含有药物A和药物和药物B的培养基中的培养基中 培养，两种亲本细胞的生长均受到抑制而死亡，唯有融合子可以存活。培养，两种亲本细胞的生长均受到抑制而死亡，唯有融合子可以存活。3营养互补选择系统营养互补选择系统4 营养缺陷型细胞营养缺陷型细胞 利用两种亲本细胞营养互补作用原理筛选杂利

132、用两种亲本细胞营养互补作用原理筛选杂种细胞的方法称营养互补种细胞的方法称营养互补 选择法。选择法。七七杂种细胞有用性状的检测系统杂种细胞有用性状的检测系统八八 杂种细胞能产生一些对人类有用物质的性状或对人类生活有利的杂种细胞能产生一些对人类有用物质的性状或对人类生活有利的性状，性状，九九 统称为有用性状。统称为有用性状。十十 杂种细胞早期存在的一些性状在传代过程中也会消失杂种细胞早期存在的一些性状在传代过程中也会消失十一十一 一方面要稳定培养条件，同时也要定期检测杂种细胞的有用性状一方面要稳定培养条件，同时也要定期检测杂种细胞的有用性状十二十二 免疫学反应、遗传标记、核酸分子杂交免疫学反应、遗

133、传标记、核酸分子杂交Question three：1 如何检测杂种细胞的有用性状如何检测杂种细胞的有用性状 2 有几种主要的杂种细胞表型改变？其本质是什么有几种主要的杂种细胞表型改变？其本质是什么？ 免疫学反应主要是检测杂种细胞表面或基因表达产物如蛋白质、酶免疫学反应主要是检测杂种细胞表面或基因表达产物如蛋白质、酶和多肽和多肽 荧光素、辣根过氧化物酶或放射性同位素结合在一起荧光素、辣根过氧化物酶或放射性同位素结合在一起 免疫免疫荧光、免疫酶标与放射免疫测定荧光、免疫酶标与放射免疫测定 细胞原位杂交或分子杂交的方法细胞原位杂交或分子杂交的方法八八控制杂种细胞遗传表现型的机制控制杂种细胞遗传表现型

134、的机制九九1 互补作用互补作用十十 是指两种亲本细胞的某些生物学特性在杂种细胞中共同表达的现象是指两种亲本细胞的某些生物学特性在杂种细胞中共同表达的现象十一十一2 激活作用激活作用十二十二 是指某一亲本细胞的不活动基因在杂种细胞中被激活而得到表达的是指某一亲本细胞的不活动基因在杂种细胞中被激活而得到表达的现象现象十三十三3 消失作用消失作用十四十四 是指亲本细胞的某一（或某些）性状在杂种细胞中消失的现象是指亲本细胞的某一（或某些）性状在杂种细胞中消失的现象十五十五4 激活与消失作用激活与消失作用 是指在杂种细胞中原来亲本非活动基因被激活而同一亲本某些遗传性状同是指在杂种细胞中原来亲本非活动基因

135、被激活而同一亲本某些遗传性状同时消失的现象。时消失的现象。表现其生物学特性的实质，就是基因的重组、调控与表达的问题表现其生物学特性的实质，就是基因的重组、调控与表达的问题可能是细胞质中的某种活性物质对某一基因组起了激活或抑制作用的可能是细胞质中的某种活性物质对某一基因组起了激活或抑制作用的结果结果前者叫基因重组，或者叫基因调控前者叫基因重组，或者叫基因调控九九微生物原生质体融合技术微生物原生质体融合技术十十 微生物原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以微生物原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以去除去除十一十一，使其在高渗环境中释放出只有原生质膜包裹着的球状原生

136、质体，然，使其在高渗环境中释放出只有原生质膜包裹着的球状原生质体，然后将两后将两十二十二个亲株的原生质体在高渗条件下混合，在外力作用下（如采用个亲株的原生质体在高渗条件下混合，在外力作用下（如采用 PEG 或或加压）加压）十三十三助融，使它们相互凝集进行细胞质融合，接着发生两套或多套基因组助融，使它们相互凝集进行细胞质融合，接着发生两套或多套基因组之间的之间的十四十四接触，交换和重组，在再生细胞中获得异核体或重组体。接触，交换和重组，在再生细胞中获得异核体或重组体。Question four：1 微生物原生质体融合育种有什么优点？微生物原生质体融合育种有什么优点？ 2 微生物原生质体融合育种的

137、主要步骤是什么？微生物原生质体融合育种的主要步骤是什么？ 微生物原生质体融合育种微生物原生质体融合育种的特点的特点（1）杂交频率较高）杂交频率较高（2）受接合型或致育型的限制较小）受接合型或致育型的限制较小（3）重组体种类较多）重组体种类较多（4）遗传物质的传递更为完善）遗传物质的传递更为完善（5）可以获得性能优良的重组体）可以获得性能优良的重组体（6）可提高育种效率）可提高育种效率（7）可采用产量较高的菌株作为融合亲株）可采用产量较高的菌株作为融合亲株（8）有助于建立工业微生物的转化体系）有助于建立工业微生物的转化体系 微生物原生质体融合育种步骤微生物原生质体融合育种步骤1标记菌株筛选标记菌

138、株筛选2 所需的目的基因并不一定与标记基因连锁，但可大大减少筛选所需的目的基因并不一定与标记基因连锁，但可大大减少筛选 自发回复突变率过高的亲本细胞最好不使用自发回复突变率过高的亲本细胞最好不使用 最好选择对菌株生产性能没有影响的标记最好选择对菌株生产性能没有影响的标记2原生质体制备原生质体制备3 酶法和机械法酶法和机械法4（1）菌体的预处理）菌体的预处理5 先用某些化合物对菌体进行预处理先用某些化合物对菌体进行预处理6 EDTA 、甘甘氨酸、青霉素或氨酸、青霉素或D-环丝氨酸环丝氨酸7 在放线菌培养液中加入在放线菌培养液中加入1 % -4 % 甘氨酸甘氨酸8 在酵母菌中加入在酵母菌中加入ED

139、TA和巯基乙醇和巯基乙醇9（2）菌体的培养时间）菌体的培养时间10 对数生长期后期的菌体进行酶解对数生长期后期的菌体进行酶解（3）酶种类）酶种类 有溶菌酶、纤维素酶和蜗牛酶、壳多糖酶、酵母细胞壁裂解酶、溶解酶及有溶菌酶、纤维素酶和蜗牛酶、壳多糖酶、酵母细胞壁裂解酶、溶解酶及溶葡球菌素。溶葡球菌素。（4）酶浓度）酶浓度 为了兼顾原生质体形成率和再生率为了兼顾原生质体形成率和再生率（5）酶解温度）酶解温度（6）酶解时间）酶解时间 原生质体再生率随酶解时间的延长而显著降低原生质体再生率随酶解时间的延长而显著降低（7）渗透压稳定剂）渗透压稳定剂 高渗透压或等渗透压溶液或培养基中才能存活高渗透压或等渗透

140、压溶液或培养基中才能存活 蔗糖、葡萄糖、甘露醇、琥珀酸、氯化钠、氯化钾蔗糖、葡萄糖、甘露醇、琥珀酸、氯化钠、氯化钾（8）原生质体形成率）原生质体形成率 以高渗液稀释原生质体悬浮液生成的菌落数（等于原生质体再生细胞臂以高渗液稀释原生质体悬浮液生成的菌落数（等于原生质体再生细胞臂后形成的菌落数）与未完全破壁细胞所形成菌落数之和作为后形成的菌落数）与未完全破壁细胞所形成菌落数之和作为A ；而以低渗而以低渗溶液稀释原生质体悬浮液形成的菌落数（等于未完全破壁细胞形成的菌落溶液稀释原生质体悬浮液形成的菌落数（等于未完全破壁细胞形成的菌落数）作为数）作为B ，故故A-B即为取样中原生质体数。即为取样中原生质

141、体数。 原生质体形成率（原生质体形成率（% ）=（A-B）/细胞总数细胞总数*100%3 原生质体融合原生质体融合 取一定浓度的两种不同微生物的原生质体悬浮液等量混合，在促融剂取一定浓度的两种不同微生物的原生质体悬浮液等量混合，在促融剂PEG和和Ca2+的作用下，二者相互凝聚，首先发生细胞膜融合。的作用下，二者相互凝聚，首先发生细胞膜融合。 出现细胞凝聚现象出现细胞凝聚现象 膜发生粘连膜发生粘连 多核细胞多核细胞 进行核的融合成为单核进行核的融合成为单核的杂种细胞的杂种细胞 ，不能形成单核的融合细胞在培养过程中逐渐死亡。，不能形成单核的融合细胞在培养过程中逐渐死亡。 4000-6000 30%

142、-40% 0.05 mol/L 只作用只作用1min即进行稀释，以解除即进行稀释，以解除PEG毒性毒性4 原生质体再生原生质体再生 原生质体经培养后恢复原细胞形态的过程称为原生质体再生。原生质体经培养后恢复原细胞形态的过程称为原生质体再生。 主要有菌种特性、原生质体制备条件、再生培养基成分和再生培养条件主要有菌种特性、原生质体制备条件、再生培养基成分和再生培养条件 原生质体再生率原生质体再生率=（A-B）/原生质体总数（血球计数法）原生质体总数（血球计数法）*100%5 融合子选择融合子选择 直接法和间接法两种：直接法是将融合混合物涂布于不加二亲株生长所直接法和间接法两种：直接法是将融合混合物

143、涂布于不加二亲株生长所需营养物或同时补充两种药物的高渗再生培养基平板上。需营养物或同时补充两种药物的高渗再生培养基平板上。 间接法则是先把融合液涂布于高渗再生培养基平板上，使亲株及重组子都间接法则是先把融合液涂布于高渗再生培养基平板上，使亲株及重组子都能生长，然后在影印复制到选择性培养基上。能生长，然后在影印复制到选择性培养基上。 原生质体融合率原生质体融合率=单位体积融合重组子数单位体积融合重组子数/单位体积二亲株原生质体再生单位体积二亲株原生质体再生总数总数*100% 。 其中能产生杂和双倍体或单倍体重组体者，其特性较为稳其中能产生杂和双倍体或单倍体重组体者，其特性较为稳定，属真正的融定，

144、属真正的融合。凡不稳定而易分离为亲本类型的融合作用，称为暂时的融合，形成合。凡不稳定而易分离为亲本类型的融合作用，称为暂时的融合，形成异异核体核体。融合子中。融合子中产物基因产物基因及及芽孢和色素形成芽孢和色素形成的特性均可转移。的特性均可转移。 灭活原生质体融合技术在育种中的应用灭活原生质体融合技术在育种中的应用 灭活原生质体融合技术是指采用热、紫外线、电离辐射及某些生化试剂、灭活原生质体融合技术是指采用热、紫外线、电离辐射及某些生化试剂、抗生素等作为灭活剂，处理单一亲株或双亲株的原生质体，使之失去再生抗生素等作为灭活剂，处理单一亲株或双亲株的原生质体，使之失去再生能力，再进行细胞融合，由于

145、损伤部位的互补作用可以形成能再生的融合能力，再进行细胞融合，由于损伤部位的互补作用可以形成能再生的融合体。体。（1）单一亲株灭活）单一亲株灭活（2）双亲株或多亲株灭活）双亲株或多亲株灭活 只要其致死损伤不一致，就有可能通过融合互补作用产生活的重组体只要其致死损伤不一致，就有可能通过融合互补作用产生活的重组体 核融合缺陷原生质体融合技术在育种中的应用核融合缺陷原生质体融合技术在育种中的应用 可以采用嗜杀酵母杀死野生酵母的特性来净化发酵体系，实现纯种发酵可以采用嗜杀酵母杀死野生酵母的特性来净化发酵体系，实现纯种发酵 通常把这种只发生细胞质融合的细胞称为异质体通常把这种只发生细胞质融合的细胞称为异质

146、体 在异质体中含有在异质体中含有两个两个亲本的细胞质成分和一个亲本的核染色体基因亲本的细胞质成分和一个亲本的核染色体基因 采用含有嗜杀质粒的核融合缺陷突变株进行嗜杀质粒的转移是目前嗜杀采用含有嗜杀质粒的核融合缺陷突变株进行嗜杀质粒的转移是目前嗜杀酵母育种的最佳方法。酵母育种的最佳方法。十十植物原生质体制备、培养与融合技术植物原生质体制备、培养与融合技术植物原生质体的基本特点植物原生质体的基本特点1)游离的原生质体是真正的单细胞游离的原生质体是真正的单细胞2)为较远源的植物细胞杂交提供了融合的亲本为较远源的植物细胞杂交提供了融合的亲本3)植物原生质体具有遗传全能性植物原生质体具有遗传全能性 植物

147、原生质体的材料来源及预处理植物原生质体的材料来源及预处理 研究表明，研究表明，A 植物体各植物体各组织与器官组织与器官均可以作为制取原生质体的材料均可以作为制取原生质体的材料 B 植物的叶片、愈伤组织及悬浮培养细胞，次之为茎尖、植物的叶片、愈伤组织及悬浮培养细胞，次之为茎尖、 根尖、根尖、 子叶及胚性组织细胞。子叶及胚性组织细胞。 C 花粉花粉是单倍体细胞是单倍体细胞 目前培育成功的大多数植物所使用的是叶肉细胞或悬浮细胞的原生质体目前培育成功的大多数植物所使用的是叶肉细胞或悬浮细胞的原生质体（1）预质壁分离）预质壁分离 （2）预处理）预处理 （3）暗处理）暗处理（4）光处理）光处理 （5）体温

148、处理）体温处理 预处理无特定规律可循，需根据具体材料和经验进行摸索预处理无特定规律可循，需根据具体材料和经验进行摸索 无菌条件下进行无菌条件下进行植物原生质体的制备和纯化植物原生质体的制备和纯化1植物原生质体的制备植物原生质体的制备2 机械法和酶消化法机械法和酶消化法3 该方法又分为一步法及二步法。该方法又分为一步法及二步法。4 一步法是将材料在一步法是将材料在21-28C用纤维素酶和果胶酶混合液一次性处理用纤维素酶和果胶酶混合液一次性处理2-24h5 二步法是将材料先用果胶酶降解胞间胶层得到单细胞，再用纤维素二步法是将材料先用果胶酶降解胞间胶层得到单细胞，再用纤维素酶脱酶脱6 壁而释放原生质

149、体。壁而释放原生质体。7 高等植物细胞壁主要成分为高等植物细胞壁主要成分为a-a-纤维素，其次为半纤维素、纤维素，其次为半纤维素、8 8 果胶质和蛋白质果胶质和蛋白质9 9 木质化及次生加厚的细胞壁不容易被酶消化木质化及次生加厚的细胞壁不容易被酶消化10（1）纤维素酶）纤维素酶 （2）果胶酶）果胶酶 又叫离析酶又叫离析酶 （3）崩溃酶）崩溃酶 Driselase11（4）半纤维素酶半纤维素酶 （5）蜗牛酶）蜗牛酶 酶液配置后需以酶液配置后需以0.2-0.45m无菌微孔过无菌微孔过滤滤12器过滤除菌。器过滤除菌。2植物原生质体的纯化植物原生质体的纯化3 需用不锈钢网或尼龙网（需用不锈钢网或尼龙网

150、（100-400目）滤除较大杂物目）滤除较大杂物4 收集在离心管中，于收集在离心管中，于500-1000r/ min离心离心5 再用与酶液具有相同糖浓度的溶液反复洗涤沉淀再用与酶液具有相同糖浓度的溶液反复洗涤沉淀3-4次次6（1）漂浮法）漂浮法7 采用比原生质体相对密度大、渗透压较高的溶液，经离心使原生质体采用比原生质体相对密度大、渗透压较高的溶液，经离心使原生质体悬悬8浮于溶液表面。浮于溶液表面。9（2）界面法）界面法10 利用高分子聚合物混合液产生两相水溶液的原理利用高分子聚合物混合液产生两相水溶液的原理11（3）滴洗法）滴洗法12 混合液置于孔径为混合液置于孔径为8 m滤器中滤器中13（

151、4）沉降法）沉降法 （5）沉降法和漂浮法结合）沉降法和漂浮法结合3植物原生质体活力的测定植物原生质体活力的测定4 一般根据形态特征即可判断原生质体的活力一般根据形态特征即可判断原生质体的活力5 用用0.1% 酚番红或伊文思蓝染色，不着色者为活原生质体，染色者为酚番红或伊文思蓝染色，不着色者为活原生质体，染色者为无活无活6力原生质体。力原生质体。7 荧光素双醋酸酯（荧光素双醋酸酯（F D A）8 通过完整原生质体膜通过完整原生质体膜9 受到细胞内酯酶的分解，产生有荧光的极性物质受到细胞内酯酶的分解，产生有荧光的极性物质-荧光素荧光素 植物原生质体的培养植物原生质体的培养 在基因工程中，以原生质体

152、为宿主，更易于重组质粒的转化在基因工程中，以原生质体为宿主，更易于重组质粒的转化 在原生质体培养过程中，可发生频率更高的自发突变和人工诱变在原生质体培养过程中，可发生频率更高的自发突变和人工诱变 半倍体原生质体为材料，因不存在隐性基因，产生的突变体当代即可半倍体原生质体为材料，因不存在隐性基因，产生的突变体当代即可鉴别鉴别 为研究质膜结构、功能及表面特性提供了方便为研究质膜结构、功能及表面特性提供了方便 细胞壁形成的全过程细胞壁形成的全过程 研究病毒侵染及复制机理的良好材料研究病毒侵染及复制机理的良好材料2植物原生质体培养技术植物原生质体培养技术3（1）植物原生质体的培养方法）植物原生质体的培

153、养方法4 密度效应，一般在每毫升培养液中应有密度效应，一般在每毫升培养液中应有105个左右的原生质体利于生个左右的原生质体利于生长长固体培养法：也称平板培养法固体培养法：也称平板培养法 把原生质体均匀的埋入琼脂培养基中的培养方法把原生质体均匀的埋入琼脂培养基中的培养方法液体培养法：原生质体悬浮于液体培养基中液体培养法：原生质体悬浮于液体培养基中a.液体浅层培养法：初期振荡液体浅层培养法：初期振荡1-2次，防止粘壁次，防止粘壁b.液体悬滴培养法：将原生质体悬浮液滴入培养皿盖中，培养皿中加入液体悬滴培养法：将原生质体悬浮液滴入培养皿盖中，培养皿中加入浓度低于培养液的液体，再将皿盖翻盖于皿上并置培养

154、箱中培养。浓度低于培养液的液体，再将皿盖翻盖于皿上并置培养箱中培养。 双层培养法：固体培养基倾入培养皿内使其均匀凝固，再将原生质体悬双层培养法：固体培养基倾入培养皿内使其均匀凝固，再将原生质体悬浮液置于已凝固的培养基上进行培养。浮液置于已凝固的培养基上进行培养。 看护培养法：培养皿底层铺一层正常密度且经射线处理以失去分裂能力看护培养法：培养皿底层铺一层正常密度且经射线处理以失去分裂能力但有代谢活力的原生质体琼脂混合物作饲养层，在于其上接种一层低密度但有代谢活力的原生质体琼脂混合物作饲养层，在于其上接种一层低密度原生质体悬浮液进行培养。原生质体悬浮液进行培养。（2）培养条件）培养条件 固体平板培

155、养时，原生质体密度以固体平板培养时，原生质体密度以103-104个个/ ml为宜，液体培养时密度为宜，液体培养时密度以以104-105个个/ ml为宜。为宜。 温度多为温度多为25-28C，少数在少数在16-37C 植物原生质体的发育和植株再生植物原生质体的发育和植株再生 脱去细胞壁的原生质体脱去细胞壁的原生质体 细胞壁再生细胞壁再生 细胞分裂形成细胞团细胞分裂形成细胞团 愈愈伤组织（或胚状体）伤组织（或胚状体） 分化形成芽或根分化形成芽或根 完整植株完整植株1细胞壁再生细胞壁再生2 此结果可以用质壁分离法或在低渗溶液中出芽现象加以说明此结果可以用质壁分离法或在低渗溶液中出芽现象加以说明3 S

156、 T或或 W B L型，型， 有细胞壁者在荧光显微镜下呈蓝色荧光有细胞壁者在荧光显微镜下呈蓝色荧光42 细胞分裂细胞分裂5 添加新鲜的低渗培养基添加新鲜的低渗培养基63 愈伤组织或胚状体的形成愈伤组织或胚状体的形成7 形成愈伤组织形成愈伤组织 有些植物由细胞系形成胚状体有些植物由细胞系形成胚状体,并在继续发育并在继续发育中中8 产生产生 极性极性, 进而可发育成植株。进而可发育成植株。4植株再生与根的形成植株再生与根的形成5 从愈伤组织诱导形态发生。另一条是通过原生质体再生细胞在从愈伤组织诱导形态发生。另一条是通过原生质体再生细胞在6 培养培养 中直接中直接诱导胚状体，进而由胚状体发育成完整植株。诱导胚状体，进而由胚状体发育成完整植株。A. 选择合适的培养基选择合适的培养基B. 调节生长素和分裂素的比例调节生长素和分裂素的比例 先诱导芽的发生，再诱导根的形成，有些植物的芽和根可同时发生先诱导芽的发生，再诱导根的形成，有些植物的芽和根可同时发生 至分化培养基上诱导器官分化至分化培养基上诱导器官分化 诱导器官分化用诱导器官分化用1500lx左右的光照强度左右的光照强度