沈萍微生物学第八章

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1、第八章第八章 微生物遗传微生物遗传本章的目的要求：本章的目的要求：n n掌握：微生物基因突变的一般规律微生物基因突变的一般规律 原核生物的基因重组、原核生物的基因重组、 营养缺陷型的筛选、营养缺陷型的筛选、 基因工程的主要步骤。基因工程的主要步骤。n n 质粒的特征质粒的特征n n了解：遗传物质的证明遗传物质的证明n n 微生物基因组结构微生物基因组结构n n 基因组测序基因组测序n n几个概念几个概念几个概念几个概念n n遗传遗传遗传遗传(heredity)(heredity)：n n亲代生物传递给子代一套实现与其相同形状的遗亲代生物传递给子代一套实现与其相同形状的遗亲代生物传递给子代一套实

2、现与其相同形状的遗亲代生物传递给子代一套实现与其相同形状的遗传信息。传信息。传信息。传信息。n n 特点：具稳定性。特点：具稳定性。特点：具稳定性。特点：具稳定性。n n遗传型（遗传型（遗传型（遗传型（genotypegenotype）：）：）：）：n n又称基因型，指某一生物个体所含有的全部基因又称基因型，指某一生物个体所含有的全部基因又称基因型，指某一生物个体所含有的全部基因又称基因型，指某一生物个体所含有的全部基因的总和的总和的总和的总和n n是一种内在可能性或潜力。是一种内在可能性或潜力。是一种内在可能性或潜力。是一种内在可能性或潜力。n n表型（表型（phenotype）：）：n n

3、指生物体所具有的一切外表特征和内在特指生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和性的总和; n n是具一定遗传型的生物在一定条件下所表是具一定遗传型的生物在一定条件下所表现出的具体性状。现出的具体性状。n n遗传型遗传型 + 环境条件环境条件 表型表型n n变异变异(variation):n n 生物体在外因或内因的作用下，遗传物质生物体在外因或内因的作用下，遗传物质的结构或数量发生改变而导致表型改变。的结构或数量发生改变而导致表型改变。n n变异的特点：变异的特点：n na. 群体一般为群体一般为10-610-10；n nb. 形状变化的幅度大；形状变化的幅度大； n nc. 变化后形成的新

4、性状是稳定遗传的。变化后形成的新性状是稳定遗传的。n n饰变（饰变（modification）：）：n n指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。录、转译水平上的表型变化。n n特点：特点：n na.几乎整个群体中的每一个个体都发生同样几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化；的变化；n nb.性状变化的幅度小；性状变化的幅度小；n nc.因遗传物质不变，故饰变是不遗传的。引因遗传物质不变，故饰变是不遗传的。引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。起饰变的因素消失后，表型即可恢复。n n 第一节遗传的物质基础第一节遗传的物质基础n n一一

5、.DNA作为遗传物质作为遗传物质n n1.Griffith转化实验 1928 英国1944年年 O.T.Avery活活R菌菌+n n加加S菌菌DNAn n加加S菌菌DNA及及DNA酶以外的酶酶以外的酶n n加加S菌的菌的DNA和和DNA酶酶n n加加S菌的菌的RNAn n加加S菌的蛋白质菌的蛋白质n n加加S菌的荚膜多糖菌的荚膜多糖长出长出S菌菌只长只长R菌菌2. T2噬菌体感染实验噬菌体感染实验10分钟后分钟后用捣碎器用捣碎器使空壳脱离使空壳脱离吸附吸附离心离心二.RNA作为遗传物质n nTMV拆分重建实验三三. 朊朊病毒病毒的发现与思考的发现与思考 遗传物质在微生物细胞内遗传物质在微生物细

6、胞内 存在的部位和方式存在的部位和方式n n7 7个水平个水平个水平个水平n n细胞水平细胞水平 遗传物质集中在核内或核区遗传物质集中在核内或核区n n细胞核水平细胞核水平 核基因组；细胞质基因核基因组；细胞质基因n n染色体水平染色体水平 单倍体和双倍体单倍体和双倍体n n核酸水平核酸水平 核酸种类、结构；核酸种类、结构；DNADNA长度长度n n基因水平基因水平 最小的遗传功能单位最小的遗传功能单位n n密码子水平密码子水平 3 3个核苷酸代表一个氨基酸个核苷酸代表一个氨基酸n n核苷酸水平核苷酸水平 核苷酸是一个最低突变单位核苷酸是一个最低突变单位第二节 微生物的基因组结构n n基因组概

7、念基因组概念n n一一.E.coli.E.coli基因组基因组n n 原核生物 结构特点n n1.1.遗传信息的连续性遗传信息的连续性 一条染色体，一条染色体，DNADNA含量少，大含量少，大部分部分DNADNA用来编码蛋白质用来编码蛋白质n n2.2.功能相关的结构基因组成操纵子功能相关的结构基因组成操纵子功能相关基因丛功能相关基因丛集排列，有利于调节。集排列，有利于调节。n n3.3.结构基因的单拷贝及结构基因的单拷贝及rRNArRNA基因的多拷贝基因的多拷贝n n4.4.基因组重复序列少而短基因组重复序列少而短n n二.啤酒酵母基因组n n 真核生物基因组结构特点n n1、基因组大，多个

8、染色体n n2、mRNA单顺反子结构n n3、断裂基因，（有内含子）n n4、基因组重复序列多 （遗传丰余）n n三.詹氏甲烷球菌的基因组n n 古生菌基因组结构特点n n1、类似原核生物：n n环状染色体n n操纵子结构n n无内含子，无核膜n n2、类似真核生物：n n复制、转录、翻译RNA聚合酶、启动子、延伸因子、复制起始因子、有组蛋白第三节 质粒与转座子n n一一. 质粒：质粒：独立于染色体外，能进行自我复制的细胞质遗传因子n n二二.质粒主要类型质粒主要类型n n1.F因子 分子量n n 4种 F+，F-，Hfr， Fn n2.R因子n n3.Col因子n n4.产毒素质粒n n5.

9、Ti质粒n n6.降解质粒n三三.质粒的特性质粒的特性n n1.能独立复制n n2.带次要性状n n3.可整合，可游离，可细胞间转移n n4.不亲和性n n5.口丫口丫啶类染料可消除之n n 松弛型质粒松弛型质粒n n 严紧型质粒严紧型质粒n n四四.转座因子类型与分子结构转座因子类型与分子结构转座子（转座子（Tn)：存在于染色体存在于染色体存在于染色体存在于染色体DNADNA上可自主复制上可自主复制上可自主复制上可自主复制 和位移的基本单位，最简单的为和位移的基本单位，最简单的为和位移的基本单位，最简单的为和位移的基本单位，最简单的为 插入序列。插入序列。插入序列。插入序列。n n类型类型n

10、 n IS IS - -插入序列插入序列n n TnTn-复合转座子复合转座子n n Mu Mu-噬菌体噬菌体n n结构结构（1）简单转座子：IS 不含有任何宿主基因不含有任何宿主基因 末端反向重复序列，末端反向重复序列， 编码转座酶编码转座酶 转座时引起靶位点正向重复转座时引起靶位点正向重复TnPAACGTACGTTTTGCATGCAA(2) 复合式转座子复合式转座子n n复合式转座子复合式转座子(composite transposon)是一类带有某些抗药是一类带有某些抗药性基因性基因(或其他基因或其他基因)的转座子，其的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的两翼往往是两个相同或高度同源

11、的IS序列，表明序列，表明IS序列插入到某个功序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合转座能基因两端时就可能产生复合转座子。子。 TnA家族家族n nTnATnA家族没有家族没有家族没有家族没有ISIS序列、体积庞大序列、体积庞大序列、体积庞大序列、体积庞大 (5000bp (5000bp以以以以上上上上) )、带有、带有、带有、带有3 3个基因，其中一个编码个基因，其中一个编码个基因，其中一个编码个基因，其中一个编码-内酰胺酶内酰胺酶内酰胺酶内酰胺酶(AmpR)(AmpR)，另两个则是转座作用所必须的。，另两个则是转座作用所必须的。，另两个则是转座作用所必须的。，另两个则是转座作用所必须的

12、。复制性转座复制性转座(3) Mu噬菌体噬菌体CAB C DEHFGITJKLMYNPRSUUS免疫整合复制头尾基因宿主基因转座遗传学效应转座遗传学效应1.引起插入突变2.产生染色体畸变3.产生新的基因-基因移动与重排思考题思考题n n基因组，转座因子，F因子n n何谓质粒？试述质粒的特点。第八章第八章 微生物遗传微生物遗传 （续）（续）本节重点本节重点n n几种主要的突变型的概念和表示方法n n基因突变的一般规律n nAmes试验的原理第四节 基因突变及修复n n一一.基因突变基因突变n n概念概念n n类型类型：1. 碱基变化-遗传信息变化n n 同义突变、错义突变、无义突变、移码突变同义

13、突变、错义突变、无义突变、移码突变n n 2. 2. 表型变化表型变化n n（1 1）营养缺陷型营养缺陷型营养缺陷型营养缺陷型 概念概念 表示方法表示方法n n（2 2）抗性突变型抗性突变型抗性突变型抗性突变型 概念概念 表示方法表示方法n n（3 3）条件致死突变型）条件致死突变型n n（4 4）形态突变型）形态突变型二. 基因突变的分子基础n n1.自发突变自发突变n n（1 1）特性）特性n n非对应性非对应性 抗Str-非Str引起n n稀有性稀有性 10-6- 10-7n n规律性规律性 某种微生物产生某种突变有规律某种微生物产生某种突变有规律n n独立性独立性 抗A10-5，抗B1

14、0-6，抗AB10-11n n可回复性可回复性 his- his+n n可诱变性可诱变性 可提高10-105n n（2）.分子基础分子基础n n 互变异构n n DNA插入与缺失n n 转座因子 概念 转换转换 颠换颠换 突变率突变率2.诱发突变诱发突变 概念 诱变剂诱变剂 诱发突变诱发突变 化学- 碱基类似物 、亚硝酸、染料物理- UV、热 生物诱变因子 5-BU在在DNA复制时掺入并引起碱基转换复制时掺入并引起碱基转换 （BUk为酮式为酮式5-BU；BUe为烯醇式为烯醇式5-BU） 3.Ames testn三.DNA损伤的修复n n 1. 光复活作用光复活作用n n 2. 切除修复切除修复

15、n n 3. 重组修复重组修复n n 4. SOS修复修复n n(1) DNA直接修复直接修复（direct repairdirect repair）：n n 是通过一种可连续扫描是通过一种可连续扫描DNADNA，一些蛋白质可以，一些蛋白质可以识别某种损伤的核苷酸和错配的碱基，将损伤部识别某种损伤的核苷酸和错配的碱基，将损伤部位直接修复的方法。该修复方法不用切断位直接修复的方法。该修复方法不用切断DNADNA或或切除碱基。切除碱基。 紫外线辐射造成的胸腺嘧啶二聚体就可以通过直紫外线辐射造成的胸腺嘧啶二聚体就可以通过直接修复机制修复。接修复机制修复。n n T - T T + T光复活酶光复活酶

16、n n(2) 切除修复切除修复（excision repair）：n n 通过切除-修复内切酶使DNA损伤消除的修复方法。一般是DNA切割酶、切除损伤区，然后在DNA聚合酶的作用下，以露出的单链为模板合成新的互补链，最后用连接酶将缺口连接起来。n n 例如：形成胸腺嘧啶二聚体会引起DNA双螺旋结构的变形，这样的损伤也可以通过核苷酸切除系统修复。修复系统中的主要酶ABC切除核酸酶。n n（3）重组修复复制复制重组修复重组修复DNA聚合酶、连接酶聚合酶、连接酶（4 4） SOS SOS修复修复思考题思考题n n营养缺陷型，完全培养基，基因重组n n有用细菌培养物紫外线照射后涂布在有n nStr的培

17、养基上，在有光条件下培养，结果没有筛选出str抗性菌株，为什么？第八章第八章 微生物遗传微生物遗传 （续（续) )本节重点本节重点n n大肠杆菌四种菌株的特点及相互关系n n转化、转导、接合的本质区别n n中断杂交试验，准性生殖原理和步骤第五节第五节 细菌基因转移和重组细菌基因转移和重组n n基因重组基因重组n n概念：n n原核生物转化，转导，接合，原生质体融合转化，转导，接合，原生质体融合 供体菌供体菌供体菌供体菌-提供部分染色体提供部分染色体 或少数基因的菌体或少数基因的菌体 受体菌受体菌受体菌受体菌-接受部分染色体接受部分染色体 或少数基因的菌体或少数基因的菌体一一一一. .细菌的接合

18、作用细菌的接合作用细菌的接合作用细菌的接合作用 接合接合接合接合-细胞间直接接触细胞间直接接触细胞间直接接触细胞间直接接触1.1.实验证据实验证据实验证据实验证据 U U型管试验型管试验 电镜下直接观察到接合现象电镜下直接观察到接合现象1946年年J.Lederberg等等采用采用E.coli的两的两株营养缺陷型株营养缺陷型进行实验进行实验n2.E.coli接合作用n n雄性菌株雄性菌株 F+-含游离的F因子n n Hfr-含整合的F因子n n F-含游离带有核含游离带有核DNADNA的的F F因子因子n n雌性菌株雌性菌株 F- -F- -不含不含F F因子因子n n四种菌株的相互关系四种菌

19、株的相互关系n n性导的概念性导的概念 （1 1）F F+ + F F F F+ + F+ F+ + （2 2）Hfr FHfr F Hfr + FHfr + F （在大多数情况下）（在大多数情况下）（在大多数情况下）（在大多数情况下） Hfr F Hfr F Hfr + Hfr Hfr + Hfr（或（或（或（或 F F+ +） （极少数情况下）（极少数情况下）（极少数情况下）（极少数情况下） （3 3）F FF F F+ FF+ F注意：注意：注意：注意：接合实验所用到的接合实验所用到的接合实验所用到的接合实验所用到的F F- - 菌株是一系列营养缺陷菌株是一系列营养缺陷菌株是一系列营养缺

20、陷菌株是一系列营养缺陷型菌株，当发生重组时，变成原养型型菌株，当发生重组时，变成原养型型菌株，当发生重组时，变成原养型型菌株，当发生重组时，变成原养型二二. 细菌的转导细菌的转导n概念： 借借助助缺缺陷陷噬噬菌菌体体为为媒媒介介，把把供供体体细细胞胞中中DNADNA片片段段携携带带到到受受体体细细胞胞中中，从从而而使使后后者者获获得得前前者者部部分遗传性状的现象，称分遗传性状的现象，称转导转导转导转导。 获获得得新新遗遗传传性性状状的的受受体体细细胞胞称称为为转转导导子子（transductanttransductant）。转转导导过过程程不不需需要要细细胞胞接接触触，而是以噬菌体为载体而是以

21、噬菌体为载体n n1.发现：发现：转导主要分为：转导主要分为： 完全普遍性转导完全普遍性转导n n普遍性转导普遍性转导 流产普遍性转导流产普遍性转导 低频局限性转导低频局限性转导n n局限性转导两种类型局限性转导两种类型 高频局限性转导高频局限性转导n n2.类型类型 （1） 普遍性转导普遍性转导-供体菌任何部位的基因都有供体菌任何部位的基因都有被转导的可能性。被转导的可能性。n n两种情况两种情况 ： 完全普遍性转导普遍性转导 n n n n n n n n n n流产普遍性转导流产普遍性转导n n（2）局限性局限性转导转导-是指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并

22、获得表达的转导现象。 n三三.细菌的转化细菌的转化n n1.几个概念几个概念n n 转化转化 感受态感受态 感受态因子n n自然转化n n人工转化n n2.转化过程转化过程n n 双链吸附-单链进入-同源区配对整合-复制与分离-形成1/2转化子Hfr菌株菌株中中F因子因子的整合、的整合、断裂和转断裂和转移移 四四.基因定位和基因组测序基因定位和基因组测序1.中断杂交技术中断杂交技术Hfr的接合中的接合中断实验断实验接合的结果转性低，染色体基接合的结果转性低，染色体基因重组率高因重组率高Hfr的中断杂交实验n n“全基因组鸟枪法测序”n n也称也称“ “霰弹法霰弹法” ”，是将基因组打成小片段是

23、将基因组打成小片段进行测序，然后再将这些小的片段拼接起来，进行测序，然后再将这些小的片段拼接起来，重新组装成一个完整的基因组。它的最大优点重新组装成一个完整的基因组。它的最大优点是经济、快速、高效，但对高性能计算的方法是经济、快速、高效，但对高性能计算的方法和设备要求非常高。和设备要求非常高。 2.基因连锁基因连锁3.遗传图谱遗传图谱4.基因组测序基因组测序全基因组鸟枪法测序的主要步骤是全基因组鸟枪法测序的主要步骤是n n第一，建立高度随机、插入片段大小为第一，建立高度随机、插入片段大小为n n 2kb 2kb左右的基因组文库。左右的基因组文库。n n第二，高效、大规模的末端测序。测序第二，高

24、效、大规模的末端测序。测序n n 总长度达总长度达6 6倍基因组。倍基因组。n n第三，序列集合、按末端重叠连接成大片断。第三，序列集合、按末端重叠连接成大片断。n n第四，重叠群按合适顺序排队、填补缺口。第四，重叠群按合适顺序排队、填补缺口。n n鸟枪法测序的缺点随着所测基因组总量增大，所需测序的片段大量增加，n n高等真核生物（如人类）基因组中有大量重复序列，导致判断失误。DNA测序方法 1、双脱氧核苷酸终止法 2、化学修饰法n n 核苷酸序列分析核苷酸序列分析n n（1）Sanger 双脱氧链终止法n n例; n n CTGACTTCGACAAn nddATP ddCTP ddTTP d

25、dGTPDNApol4种种dNTPddNTP5/3/标记的引物n n CTGACTTCGACAAn n ddATP ddCTP ddTTP ddGTPn n11 ddATP 10 ddCTP 9 ddTTP 12 ddGTPn n 7 ddATP 4 ddCTP 3 ddTTP 8 ddGTPn n 6 ddATP 1 ddTTP 5 ddGTPn n ddTTP 2 ddGTP标记的引物标记的引物5/3/n n 电泳CTGACTTCGACAATTGTCGAAGTCAGTTGTCGAAGTCATTGTCGTTGTCGAAGTCTTGTCGAATTGTCGATTGTCGAAGTTGTCGAAGT

26、TTGTCTTGTTTTTTG3/5/5/3/n n（2）化学裂解法）化学裂解法n n1977年 美国 哈佛大学n nMaxam & Gilbert 创立n n基本原理：n n 用化学试剂处理末端带有放射性标记的DNA片段，造成碱基特异性切割，产生不同长度的DNA片段反应混合物，经凝胶电泳分离和放射自显影后，根据X光片底板上显现相应谱带，读出核苷酸顺序。n n DNA化学裂解反应化学裂解反应碱基碱基碱基碱基碱基修饰试碱基修饰试碱基修饰试碱基修饰试剂剂剂剂碱基修饰反碱基修饰反碱基修饰反碱基修饰反应应应应主链断裂试主链断裂试主链断裂试主链断裂试剂剂剂剂G G G G硫酸二甲酯硫酸二甲酯硫酸二甲酯硫

27、酸二甲酯鸟嘌呤甲基鸟嘌呤甲基鸟嘌呤甲基鸟嘌呤甲基化化化化哌啶哌啶哌啶哌啶G+AG+AG+AG+A蚁酸蚁酸蚁酸蚁酸脱嘌呤化脱嘌呤化脱嘌呤化脱嘌呤化哌啶哌啶哌啶哌啶C+TC+TC+TC+T肼肼肼肼嘧啶开环嘧啶开环嘧啶开环嘧啶开环哌啶哌啶哌啶哌啶C C C C肼（加盐）肼（加盐）肼（加盐）肼（加盐）胞嘧啶开环胞嘧啶开环胞嘧啶开环胞嘧啶开环哌啶哌啶哌啶哌啶n n 5GATCACTACTG3n n - -3232P P dATPdATPn n 5* GATCACTACTG3GATCACTACTG GATCACTACTG GATCACTACT GATCACTACGATCACTACTG GATCACTACT

28、G GATCACTACT GATCACTACG GATCACTA GATCACTAC GATCAC G GATCACTA GATCACTAC GATCAC GATCA GATCACT GATC GATCA GATCACT GATC n n GA GATCAC GA GATCACn n G GATC G GATCn n GAT GATG G反应反应G+A反应反应C+T反应反应C反应反应n n GG+AC+TC5* GATCACTACTG5* GATCACTACT5* GATCACTAC5* GATCACT5* GATCACTA5* GATCAC5* GATCA5* GATC5* GAT5* GA

29、5* G第六节第六节 真核微生物的遗传学特性真核微生物的遗传学特性n n一一.酵母菌的接合型遗传酵母菌的接合型遗传n n二二.酵母菌的质粒酵母菌的质粒n n三三.酵母菌的线粒体酵母菌的线粒体n n酵母菌的酵母菌的酵母菌的酵母菌的2um2um质粒质粒质粒质粒n n1 1、闭合、闭合dsDNAdsDNA、2um2um长长n n2 2、约有、约有600bp600bp长的反向重复顺序长的反向重复顺序n n3 3、有两种异构体形式、有两种异构体形式n n4 4、有、有4 4个蛋白质基因（隐秘性质粒）个蛋白质基因（隐秘性质粒）n n酵母菌的线粒体酵母菌的线粒体酵母菌的线粒体酵母菌的线粒体n n1 1、环状

30、、环状dsDNA (dsDNA (为人线粒体基因组的为人线粒体基因组的5 5倍）倍）n n2 2、酵母、酵母mtDNAmtDNA编码几种线粒体成分编码几种线粒体成分n n3 3、有内含子、有内含子n n4 4、与通用的密码系统不同、与通用的密码系统不同n n5 5、核糖体、核糖体70s70sn n四四.丝状真菌的准性生殖丝状真菌的准性生殖n n概念：概念：指不经过减数分裂就能导致基因指不经过减数分裂就能导致基因重组的生殖过程。重组的生殖过程。n n过程过程：1.异核体的形成异核体的形成n n 2.二倍体的形成二倍体的形成n n 3.体细胞交换和单元化体细胞交换和单元化思考题思考题n n转化与转

31、导，普遍性转导与局限性转导n n试述大肠杆菌4种菌株的特点及相互关系第八章第八章 微生物遗传微生物遗传 （续（续) )本节重点本节重点n n营养缺陷型的筛选第七节 微生物育种n n一一.诱变育种诱变育种n n概念概念n n常用诱变剂常用诱变剂n n1. UV 1. UV 灯管功率灯管功率n n 距离距离n n 时间时间n n2. 5-BU 2. 5-BU 浓度浓度n n 温度温度n n 时间时间1、诱变育种的基本规律、诱变育种的基本规律n n2.筛选策略筛选策略n n 平板初筛平板初筛平板初筛平板初筛 透明圈，生长圈，变色圈，抑菌圈透明圈，生长圈，变色圈，抑菌圈n n 三角瓶复筛三角瓶复筛三角

32、瓶复筛三角瓶复筛n n（1).1).营养缺陷型筛选营养缺陷型筛选n nC1 C1 诱变诱变诱变诱变 UV UV 化学诱变剂化学诱变剂n nC2 C2 淘汰野生型淘汰野生型淘汰野生型淘汰野生型 青霉素法青霉素法 菌丝过滤法菌丝过滤法n nC3 C3 检出缺陷型检出缺陷型检出缺陷型检出缺陷型 逐个点种法逐个点种法 影印法影印法n nC4 C4 鉴定缺陷型鉴定缺陷型鉴定缺陷型鉴定缺陷型 生长谱法生长谱法n n C-1：诱变：诱变n n(1) (1) 紫外线紫外线紫外线紫外线在诱变处理前，先开紫外灯预热在诱变处理前，先开紫外灯预热 20 20 分钟，使分钟，使光波稳定。然后，将光波稳定。然后，将 3

33、3 5ml 5ml 细胞悬浮液置细胞悬浮液置 6cm 6cm 培养皿中，置于诱变箱内的电磁搅拌器上，照射培养皿中，置于诱变箱内的电磁搅拌器上，照射 3 3 5 5 分钟进行表面杀菌。打开培养皿盖，开启电分钟进行表面杀菌。打开培养皿盖，开启电磁搅拌器，边照射边搅拌。处理一定时间后，在红磁搅拌器，边照射边搅拌。处理一定时间后，在红光灯下，吸取一定量菌液经稀释后，取光灯下，吸取一定量菌液经稀释后，取 0.2ml 0.2ml 涂涂平板，或经暗培养一段时间后再涂平板。平板，或经暗培养一段时间后再涂平板。n n（2）5-BUn n 加入无菌生理盐水微热溶解，使浓度为 2mg/ml 。将 5-BU 加入培养

34、基内，使其终浓度一般为 10 20g/ml ，混匀后倒平板，涂布菌液，使其在生长过程中诱变，然后挑单菌落进行测定。C-2：淘汰野生型（浓缩缺陷型）：淘汰野生型（浓缩缺陷型）n n诱变后，仍存在大量的野生型，不利于分离诱变后，仍存在大量的野生型，不利于分离n n抗生素法抗生素法n n野生型菌株在野生型菌株在MMMM上生长上生长+ +青霉素青霉素杀死杀死n n缺陷型菌株在缺陷型菌株在MMMM上不生长青霉素上不生长青霉素-不杀死不杀死n n制制霉霉菌菌素素法法则则适适合合于于真真菌菌（例例如如：酵酵母母、霉霉菌菌），可与真菌细胞膜上的甾醇作用，从而引起溶菌可与真菌细胞膜上的甾醇作用，从而引起溶菌菌菌

35、丝过滤丝过滤法法适于：适于：丝丝状（放状（放线线菌、霉菌）菌、霉菌） 原理：原理：野生型基本培养基上野生型基本培养基上发发育成菌育成菌丝丝； 缺陷型缺陷型孢孢子子不萌发不萌发可通可通过滤过滤膜，野膜，野 生型菌生型菌丝丝不能通不能通过过。C-3 检出缺陷型检出缺陷型n逐个检出法n影印检出法n夹层培养法n限量补给法 逐个检出法逐个检出法 影印检出法影印检出法 夹层培养法 限量补给法限量补给法在含少量的（0.01%）蛋白胨的MM上培养,大菌落为野生型小菌落的为缺陷型。C-4 鉴定缺陷型鉴定缺陷型-生长谱法生长谱法n n斜面菌种-生理盐水洗下细胞-洗涤-涂布（105个/皿） 纸片纸片1:氨基酸混合液

36、氨基酸混合液;纸片纸片2:维生素混合液维生素混合液;纸片纸片3: 核酸水解液核酸水解液;纸片纸片4: 酵母水解液酵母水解液n n（2）.抗阻遏和抗反馈突变型筛选抗阻遏和抗反馈突变型筛选n n原理：选择结构类似物抗性突变株n n抗阻遏：调节基因突变调节基因突变-阻遏蛋白失活阻遏蛋白失活-不不能与代谢产物的结构类似物结合能与代谢产物的结构类似物结合-阻遏蛋白不起阻遏蛋白不起阻遏作用（反应的第一个酶继续合成）阻遏作用（反应的第一个酶继续合成）-终产物终产物照样合成照样合成n n抗反馈：变构酶基因突变变构酶基因突变-变构酶不能与结构变构酶不能与结构类似物结合（仍能与底物结合）类似物结合（仍能与底物结合

37、）-终产物照样合终产物照样合成成n n（3). 抗性突变株抗性突变株n n 抗生素抗性-提高抗生素产量n n 条件抗性-由于环境不同，表型可“野生型”，也可突变型。n n二二.代谢工程育种代谢工程育种n n1、改变代谢途径、改变代谢途径n n2、扩展代谢途径、扩展代谢途径n n3、构建新的代谢途径、构建新的代谢途径n n三、体内基因重组育种三、体内基因重组育种n n1.原生质体融合原生质体融合n n 原生质体制备n n 原生质体融合和再生n n 融合子的选择n n2.杂交育种杂交育种n nDNA Shuffling技术n n1994年美国Stemmer提出n n基本步骤基本步骤：n n1.用D

38、Nase消化功能相同的一组基因片断，产生随机小片断n n2.提纯后用无引物PCR反应装配小片断为完整基因组片断，装配过程中有低水平点突变发生n n3.克隆并选择正突变，并将正突变体的重组基因片断作新一轮的体外重组。项目项目进化速度进化速度进化对象进化对象进化进化周期周期影响对象影响对象突变效率突变效率常规定常规定向进化向进化缓慢进化缓慢进化整个基因组整个基因组多年多年完整基因组完整基因组低低DNADNAShufflingShuffling快速进化快速进化特定基因特定基因/ /操纵子操纵子/ /病毒病毒几天几天部分基因组部分基因组高高DNA Shuffling与常规定向进化的比较类类 型型示示

39、例例特特 性性活性增加倍数活性增加倍数潜在应用领域潜在应用领域抗抗 体体人源抗体人源抗体亲和性亲和性400400生物制药生物制药酶酶天冬氨酸转氨酶天冬氨酸转氨酶催化特异性催化特异性1010，000000生物制药生物制药 - -内酰胺酶内酰胺酶抗生素抗性抗生素抗性3232，000000抗生素抗生素枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶E E耐热性耐热性6565耐热时耐热时间间1717200200工业酶工业酶细胞细胞因子因子人类干扰素人类干扰素抗病毒抗病毒285285，000000基因治疗基因治疗肿瘤抑制因子肿瘤抑制因子P53P53 3737半衰期半衰期1212基因治疗基因治疗代谢代谢途径途径砷酸盐代谢途径

40、砷酸盐代谢途径砷酸盐解毒砷酸盐解毒4040生物制药生物制药汞代谢途径汞代谢途径汞解毒汞解毒1212生物制药生物制药部分DNA Shuffling技术的研究成果作业作业:n n1 1、基因组，转座因子，营养缺陷型，完全培、基因组，转座因子，营养缺陷型，完全培养基，基因重组，普遍性转导与局限性转导，养基，基因重组，普遍性转导与局限性转导，原生质体融合原生质体融合n n何谓质粒？试述质粒的特点何谓质粒？试述质粒的特点n n大肠杆菌四种菌株的特点及相互关系大肠杆菌四种菌株的特点及相互关系n n转化、转导、接合的本质区别转化、转导、接合的本质区别n n用细菌培养物经紫外线照射后涂布在有用细菌培养物经紫外线照射后涂布在有n nStrStr的培养基上，在有光条件下培养，结果没的培养基上，在有光条件下培养，结果没有筛选出有筛选出strstr抗性菌株，为什么？抗性菌株，为什么？n n利用紫外线诱变，设计一个实验方案用于筛利用紫外线诱变，设计一个实验方案用于筛选选E.coli his-E.coli his-菌株。菌株。