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1、第三章第三章 病毒的增殖病毒的增殖 1 细胞细胞病毒的增殖场所病毒的增殖场所一、胞膜一、胞膜 吸附、侵入、释放、生物合成吸附、侵入、释放、生物合成二、胞浆二、胞浆 生物合成、装配、生物合成、装配、 形成包涵体形成包涵体三、胞核三、胞核 生物合成、生物合成、 囊膜的获得、囊膜的获得、 形成包涵体形成包涵体 2 病毒的增殖过程病毒的增殖过程 动物病毒的增殖过程大致分为动物病毒的增殖过程大致分为 5 5个主要阶段个主要阶段: : 吸附吸附 侵入侵入 脱壳脱壳 病毒成分的合成病毒成分的合成 装配与释放装配与释放一、吸一、吸 附附 病病毒毒与与细细胞胞表表面面特特异异性性受受体体发发生生碰碰撞撞，病病毒
2、毒附附着着于于细细胞胞受受体体而而引引起起的的病毒感染的第一阶段。病毒感染的第一阶段。病毒吸附分两步进行：病毒吸附分两步进行：可可逆逆吸吸附附：病病毒毒与与细细胞胞以以静静电电引引力力相相结结合合，是一种非特异性的吸附。是一种非特异性的吸附。与与细细胞胞和和病病毒毒的的浓浓度度成成正正比比；也也与与溶溶液液中中的的Ca2+、Mg2+、和和Na+等等离离子子有有关关（促促进进或或抑抑制制作作用用）；单单纯纯的的稀稀释释或或冲冲洗洗以以及及应应用用抗抗病病毒毒血血清清或或高高浓浓度度的的盐盐类类和和一一定定的的pH环环境境都都可可使使病毒重新解脱。病毒重新解脱。解脱的病毒具备感染性。解脱的病毒具备
3、感染性。 不不可可逆逆吸吸附附：病病毒毒蛋蛋白白（吸吸附附蛋蛋白白）与与细细胞胞膜膜表表面特定蛋白面特定蛋白（细胞受体）（细胞受体）的特异性结合。的特异性结合。 并非所有的病毒都有这并非所有的病毒都有这2个阶段。个阶段。 o通过外力作用使病毒解吸，病毒不再具备感染性。通过外力作用使病毒解吸，病毒不再具备感染性。o细胞表面的特定受体决定了细胞对病毒的易感性细胞表面的特定受体决定了细胞对病毒的易感性o不同病毒完成吸附所需时间不一样，但大多数病不同病毒完成吸附所需时间不一样，但大多数病毒可以在毒可以在1h之内完成吸附过程之内完成吸附过程二、侵入二、侵入l 病毒不可逆地吸附于细胞受体后，病病毒不可逆地
4、吸附于细胞受体后，病毒以毒以核酸或核衣壳或病毒颗粒核酸或核衣壳或病毒颗粒等形式进入等形式进入细胞的过程。细胞的过程。 （一）噬菌体 1无囊膜噬菌体无囊膜噬菌体 利利用用尾尾部部的的溶溶菌菌酶酶部部分分破破坏坏细细菌菌细细胞胞壁壁，尾尾管管刺刺入入细细胞胞，将将病病毒毒核核酸酸注注入入细细胞胞，衣壳留在细胞外衣壳留在细胞外2有囊膜的噬菌体有囊膜的噬菌体 机理仍不清楚机理仍不清楚（二）植物病毒 其侵入细胞的方式主要有三种：其侵入细胞的方式主要有三种：1由由携携带带有有病病毒毒的的介介体体（主主要要是是具具有有吸吸口口器器的的昆昆虫）在植物上取食，或以其它方式将病毒带入细胞；虫）在植物上取食，或以其
5、它方式将病毒带入细胞；2通通过过自自然然或或人人为为的的原原因因造造成成的的植植物物细细胞胞壁壁上上的的伤口进入细胞：伤口进入细胞：大多数实验室采用的感染方式。大多数实验室采用的感染方式。3通通过过植植物物细细胞胞与与外外界界环环境境沟沟通通的的胞胞外外连连丝丝和和沟沟通两个相邻细胞的原生质体的胞间连丝进入细胞通两个相邻细胞的原生质体的胞间连丝进入细胞（三）动物病毒（三）动物病毒 1、细胞吞饮病毒：、细胞吞饮病毒：e.g 多瘤病毒多瘤病毒2、病毒直接转入胞浆（跨膜移位）：、病毒直接转入胞浆（跨膜移位）： e.g. 小小RNA病毒病毒3、病病毒毒囊囊膜膜同同细细胞胞膜膜融融合合：由由病病毒毒的的
6、具具有有细胞融合活性的包膜糖蛋白介导细胞融合活性的包膜糖蛋白介导 e.g. 副副粘粘病病毒毒的的F糖糖蛋蛋白白，单单纯纯疱疱疹疹病病毒的毒的gB糖蛋白，流感病毒。糖蛋白，流感病毒。 三、脱壳三、脱壳 脱脱壳壳是是病病毒毒侵侵入入细细胞胞后后，病病毒毒的的包包膜膜或或壳壳体体去去除除而而病病毒毒核核酸酸释释放放出出来来的的过过程程，包包括括脱囊膜和脱衣壳两个过程。脱囊膜和脱衣壳两个过程。噬菌体的脱壳与侵入一起发生；噬菌体的脱壳与侵入一起发生；植物病毒脱壳方式了解较少；植物病毒脱壳方式了解较少；动动物物病病毒毒由由于于不不同同的的结结构构类类型型和和不不同同的的侵侵入入方式，脱壳过程较为复杂：方式
7、，脱壳过程较为复杂：1、呼呼肠肠孤孤病病毒毒，并并不不发发生生完完全全的的脱脱壳壳，以以内内吞吞方方式式进进入入细细胞胞后后，吞吞噬噬泡泡与与溶溶酶酶体体结结合合形形成成次次级级溶溶酶酶体体，病病毒毒外外壳壳中中近近50%的的壳壳体体被被溶溶酶酶体体中中的的蛋蛋白白酶酶水水解解，余余下下的的壳壳体体与与病病毒毒核核心心形形成成亚亚病病毒毒颗颗粒粒，病病毒毒的的基基因组的转录均在亚病毒颗粒内进行。因组的转录均在亚病毒颗粒内进行。2、有些在细胞核内增殖的有些在细胞核内增殖的DNA病毒病毒，如，如乳乳多空病毒、腺病毒和疱疹病毒，多空病毒、腺病毒和疱疹病毒，其核衣壳其核衣壳在未被完全脱壳的情况下就进入
8、细胞核在未被完全脱壳的情况下就进入细胞核3、口蹄疫病毒口蹄疫病毒可能就在细胞膜上脱掉衣壳，可能就在细胞膜上脱掉衣壳，病毒核酸直接进入细胞内。病毒核酸直接进入细胞内。 4、痘病毒：较为特殊、痘病毒：较为特殊 外外层层囊囊膜膜在在胞胞膜膜或或吞吞饮饮泡泡膜膜上上被被融融合合,病病毒毒核核心心进进入入胞胞浆浆内内，核核心心借借助助自自身身衣衣壳壳上上的的依依赖赖DNA的的RNA聚聚合合酶酶合合成成mRNA，进进一一步步译译制制出出一一些些早早期期蛋蛋白白质质，这这些些蛋蛋白白质质中中有有脱脱壳壳酶酶，该该酶酶反反过过来来帮帮助助病病毒毒核核心心进一步脱壳。进一步脱壳。四、病毒大分子的合成四、病毒大分
9、子的合成隐隐蔽蔽期期（晦晦暗暗期期）：从从侵侵入入细细胞胞的的病病毒毒粒粒子子消消失失开开始始，到到新新的的病病毒毒粒粒子子出出现现为为止止的一段时间。的一段时间。痘病毒痘病毒10h，脊髓灰质炎病毒脊髓灰质炎病毒24h 病毒核酸的复制和蛋白质的合成可以分成几病毒核酸的复制和蛋白质的合成可以分成几个连续阶段：个连续阶段：1. mRNA的早期转录的早期转录2. mRNA的早期翻译的早期翻译早期蛋白质早期蛋白质包括：包括：1） 酶酶：在在病病毒毒的的核核酸酸复复制制、晚晚期期转转录录和和晚晚期期翻翻译译中发挥作用中发挥作用2）其它蛋白质（功能蛋白质）：参与改变或抑制）其它蛋白质（功能蛋白质）：参与改
10、变或抑制宿主细胞大分子合成（影响细胞正常生物合成）宿主细胞大分子合成（影响细胞正常生物合成）。3病毒核酸的复制病毒核酸的复制 病病毒毒核核酸酸及及其其转转录录和和复复制制分分为为6个个基本类型基本类型第一类病毒的核酸复制第一类病毒的核酸复制1） 双双 链链 DNA病病毒毒：呈呈半半保保留留 型型 复复 制制（PRV）第二类病毒的核酸复制第二类病毒的核酸复制+2）单链）单链DNA病毒（病毒（PPV）第三类病毒的核酸复制第三类病毒的核酸复制3）双链）双链RNA病毒病毒（IBDV）保留型复制：保留型复制：指母指母代双链在复制子链代双链在复制子链过程中，一方面产过程中，一方面产生子链，一方面母生子链，
11、一方面母链又重新结合，结链又重新结合，结果在产生的两个子果在产生的两个子代中，一个仍是母代中，一个仍是母代原来的双链。代原来的双链。第四类病毒的核酸复制第四类病毒的核酸复制4）单股正链）单股正链RNA病毒病毒（FMDV）第五类病毒的核酸复第五类病毒的核酸复制制5）单股负链）单股负链RNA病毒病毒（NDV） 第六类病毒的核酸复制第六类病毒的核酸复制6）反转录病毒）反转录病毒（HIV）4mRNA的再度转录（晚期转录）的再度转录（晚期转录） 在在新新合合成成的的RNA聚聚合合酶酶的的作作用用下下，由由母母代代病病毒毒和和子子代代病病毒毒的的DNA进进一一步步转转录录出出第第二二批批mRNA。某些某些
12、RNA 病毒则仍由病毒则仍由RNA直接转录直接转录5mRNA的再度译制（晚期翻译）的再度译制（晚期翻译） 晚晚期期蛋蛋白白，包包括括病病毒毒衣衣壳壳蛋蛋白白以以及及病病毒毒编编码码的其它蛋白。的其它蛋白。五、装配和释放五、装配和释放1装装配配：新新合合成成的的病病毒毒核核酸酸和和病病毒毒蛋蛋白白在在感感染染细胞内组装成完整的病毒颗粒的过程。细胞内组装成完整的病毒颗粒的过程。 无无囊囊膜膜病病毒毒壳壳体体与与核核酸酸结结合合形形成成的的核核衣衣壳壳即即为为成成熟熟的的病病毒毒；囊囊膜膜病病毒毒需需要要在在核核衣衣壳壳外外加加上上包膜。包膜。 病病毒毒的的装装配配效效率率很很低低，往往往往只只有有
13、不不到到50%的子代病毒成份能组装成完整的病毒粒子。的子代病毒成份能组装成完整的病毒粒子。装配的机制：装配的机制：a. 自我组装（大多数病毒）：自我组装（大多数病毒）：b.指指导导装装配配：需需要要病病毒毒基基因因组组编编码码的的非非结结构构蛋蛋白白（形形态态发发生生因因子子）的的脚脚手手架架作作用用或蛋白质水解的切割作用。或蛋白质水解的切割作用。2释放释放 新新形形成成的的子子代代病病毒毒粒粒子子由由细细胞胞内内到到细细胞外的过程。胞外的过程。1） 细胞自身的溶解将病毒释放出来细胞自身的溶解将病毒释放出来2） 不发生明显细胞病变的病毒的释放方式，目不发生明显细胞病变的病毒的释放方式，目前还不
14、十分清楚。前还不十分清楚。 3）小小RNA 病病毒毒合合成成速速度度极极快快，病病毒毒粒粒子子在在胞胞浆浆内内大大量量积积聚聚，在在细细胞胞死死亡亡之之前前，就可胀破细胞、释放病毒。就可胀破细胞、释放病毒。4）有有囊囊膜膜病病毒毒的的释释放放过过程程也也就就是是病病毒毒衣衣壳壳获得囊膜的过程。获得囊膜的过程。5）疱疱疹疹病病毒毒很很少少释释出出于于细细胞胞外外，而而是是通通过过细胞间桥或融合细胞而传播。细胞间桥或融合细胞而传播。 小结：不同病毒生物合成和装小结：不同病毒生物合成和装配的场所不同配的场所不同 1大大多多数数DNA 病病毒毒：疱疱疹疹病病毒毒、腺腺病病毒毒、乳乳多多空空病病毒毒在在
15、胞胞核核内内合合成成DNA，装装配配过过程程亦亦在在胞胞核核中进行。中进行。2DNA 病病毒毒中中的的痘痘病病毒毒和和虹虹彩彩病病毒毒在在胞胞浆浆内内合合成病毒成病毒 DNA，其装配也在胞浆内完成。其装配也在胞浆内完成。3RNA 病毒均在胞浆内增殖。病毒均在胞浆内增殖。3病毒的非增殖性感染和缺损病毒病毒的非增殖性感染和缺损病毒 一定义一定义非非增增殖殖性性感感染染：指指病病毒毒在在感感染染细细胞胞内内合合成成了了某某些些甚甚至至全全部部的的病病毒毒成成分分，但但不不能能装装配配成成完完整整的的具具有有感感染染性性的的子子代代病病毒毒粒粒子子的的现现象象，称称为为非非增增殖殖性性感感染染（non
16、-productive infection)或流产感染或流产感染(abortive infection) 缺缺损损病病毒毒：在在感感染染细细胞胞内内不不能能形形成成成成熟熟病病毒毒粒粒子子的的病病毒毒。缺缺损损病病毒毒往往往往由由于于病病毒毒基基因因组组中中一一个个或或一一个个以以上上在在病病毒毒复复制制过过程程中中较较为为重重要要的的基基因因丧丧失失了了功功能能，导导致致病病毒毒复复制不能进行。制不能进行。二缺损病毒分类二缺损病毒分类 1 1依赖辅助病毒的缺损病毒依赖辅助病毒的缺损病毒 1） 干扰缺损（干扰缺损（defective interfering, DI）病毒：病毒：在在病毒感染时产
17、生的一类亚基因组缺失突变体。它们因病毒感染时产生的一类亚基因组缺失突变体。它们因失去了其亲代病毒基因组中的复制必需片段，所以不失去了其亲代病毒基因组中的复制必需片段，所以不能单独进行复制，而必需在其同型的完全病毒（标准能单独进行复制，而必需在其同型的完全病毒（标准病毒）的辅助下，由完全病毒提供病毒）的辅助下，由完全病毒提供DI颗粒已丧失的、颗粒已丧失的、但又为复制所必需的基因功能才能复制。但又为复制所必需的基因功能才能复制。 标准病毒（标准病毒（standard virus,SV）：）：与与DI颗颗粒相关的完全病毒。粒相关的完全病毒。2）卫星病毒：）卫星病毒：存在于自然界中的一种绝存在于自然界
18、中的一种绝对的缺损病毒，基因组与辅助病毒的对的缺损病毒，基因组与辅助病毒的DNA或或RNA 没有任何的同源性。没有任何的同源性。 e.g. e.g. 细小病毒科中的腺联病毒只能在细小病毒科中的腺联病毒只能在有腺病毒或疱疹病毒感染的细胞内复制。有腺病毒或疱疹病毒感染的细胞内复制。2伪装性缺损病毒：伪装性缺损病毒：指指具具有有病病毒毒衣衣壳壳及及完完整整外外表表，但但衣衣壳壳内内的的病病毒毒核核酸酸被被细细胞胞源源性性的的核核酸酸完完全全所所取取代代的的缺缺损损病病毒毒。主主要要见见于于多多瘤病毒和噬菌体。瘤病毒和噬菌体。3条件性缺损病毒：条件性缺损病毒：在一定条件下能增殖，但在其它条件下发生流产
19、感染。在一定条件下能增殖，但在其它条件下发生流产感染。 如：温度敏感突变株，宿主易感突变株如：温度敏感突变株，宿主易感突变株三、三、 组织细胞培养组织细胞培养（一）细胞（一）细胞原原代代细细胞胞：应应用用胰胰酶酶等等分分散散剂剂将将动动物物组组织织消消化化成成单单个个细细胞胞悬悬液液，适适当当洗洗涤涤以以后后，加加入入营营养养液液，通通常常即即可使其贴附于玻璃瓶壁上，并生长增殖。可使其贴附于玻璃瓶壁上，并生长增殖。继继代代细细胞胞：将将原原代代细细胞胞从从玻玻璃璃瓶瓶壁壁上上消消化化下下来来再再作作培养。培养。传传代代细细胞胞：由由于于遗遗传传突突变变或或者者在在理理化化学学物物质质和和致致瘤
20、瘤病病毒毒的的作作用用下下，组组织织培培养养细细胞胞中中有有时时出出现现恶恶性性变变细细胞胞，也也就就是是癌癌变变细细胞胞，这这种种病病变变细细胞胞具具有有很很高的增殖势能，而且几乎可以无限地传代。高的增殖势能，而且几乎可以无限地传代。优点：优点：1) 可以无限的传代。可以无限的传代。2) 很多细胞系对病毒很敏感。很多细胞系对病毒很敏感。3) 某某些些传传代代细细胞胞系系能能在在悬悬浮浮培培养养条条件件下下培培养养，适适合病毒抗原的大量生产。合病毒抗原的大量生产。4) 生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。缺点：缺点：在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。在
21、传代过程中遭到支原体和病毒的污染。(二二) 细胞分散剂细胞分散剂胰胰酶酶 使使精精氨氨酸酸或或赖赖氨氨酸酸的的羧羧基基和和其其他他氨氨基基酸酸的的氨氨基基之之间间的的多多肽肽链链发发生生水水解解，导导致致细细胞胞间间质质水水解解而而使使细细胞胞或或组组织织块块消消化化为为分分散散的的单单个细胞。个细胞。乙乙二二胺胺四四乙乙酸酸二二钠钠（EDTA） 与与钙钙、镁镁离离子子结合结合灰色链丝菌酶灰色链丝菌酶 （三）（三） 细胞的保存细胞的保存细胞培养物的常温短期保存细胞培养物的常温短期保存1）实验室中细胞短期保存）实验室中细胞短期保存 将将已已长长成成单单层层的的细细胞胞换换液液后后置置室室温温或或
22、20-22下避下避 光保存，可达光保存，可达15天以上。天以上。 将将细细胞胞培培养养温温度度由由37降降至至32甚甚至至30，可隔可隔15-30天传代一次。天传代一次。2）长途运送细胞培养物的保存）长途运送细胞培养物的保存 取取刚刚刚刚长长成成单单层层的的细细胞胞培培养养物物，弃弃去去营营养养液液，加加入入维维持持液液至至满满瓶瓶，勿勿使使培培养养瓶瓶内内存存留留空空气气，随随后后用用橡橡皮皮塞塞紧紧塞塞瓶瓶口口，并并作作适适当当的的包包扎扎。运运输输途途中中的的温温度度应应保保持持在在15-25左左右右，到到达达目目的的地地后后，置置37培培养养1天天，再再行行传代。传代。. 细胞培养物的
23、长期保存细胞培养物的长期保存 将将刚刚长长满满单单层层的的细细胞胞，按按细细胞胞传传代代方方法法消消化化吹吹散散后后，装装入入离离心心管管中中，3000r/min 5-10min，用用适适量量的的含含有有20%犊犊牛牛血血清清、10%二二甲甲亚亚砜砜（DMSO）的的DMEM悬悬浮浮，分分装装于于细细胞胞冻冻存存管管中中，置置4 2h，-20 2h，-70过过夜夜，然然后后置置于于液液氮氮中中长长期期保保存存。或或在在液液氮氮气气相相中中过过夜夜，然然后后置置于于液液氮氮中中长长期期保保存存。或或置置于于液液氮氮气气相相中中，按按5min 1cm的的速速度度逐逐渐渐往往下下降降直直至至液液氮氮中
24、中长长期期保保存。存。（四）细胞的复苏（四）细胞的复苏 将将冻冻存存于于液液氮氮中中的的细细胞胞取取出出，迅迅速速置置于于4250水水浴浴中中，并并不不停停地地摇摇动动，使使其其快快速速解解冻冻，然然后后离离心心去去掉掉冻冻存存液液，用用生生长长液液悬悬浮浮，再再置置于于细细胞胞培培养养瓶瓶中中进进行行培培养养，或或者者不不离离心心直直接接转转移移到到细细胞胞培培养养瓶瓶中中，等等其其贴贴壁壁几几小小时时后后，再再换换入入新新的的生生长长液液继继续培养。续培养。细胞冻存与复苏的基本原则：细胞冻存与复苏的基本原则：缓慢降温，快速解冻缓慢降温，快速解冻 思考题思考题1.病毒的增殖周期包括哪几个阶段
25、？病毒的增殖周期包括哪几个阶段？2.为为什什么么在在接接种种病病毒毒时时要要吸吸附附一一段段时时间间？不不吸附可以吗？吸附可以吗？3.对对于于一一个个特特定定的的病病毒毒而而言言，往往往往有有一一定定的的宿主细胞范围，这是为什么？宿主细胞范围，这是为什么？4. 什什么么叫叫吸吸附附？病病毒毒的的吸吸附附分分为为哪哪几几个个阶阶段段？处于这两个阶段的病毒有什么区别？处于这两个阶段的病毒有什么区别？5.缺损病毒主要有哪几种？它们之间的区别何在？缺损病毒主要有哪几种？它们之间的区别何在？6.各种病毒的增殖场所有什么不同？各种病毒的增殖场所有什么不同？7.动物病毒侵入细胞的方式有哪几种？动物病毒侵入细胞的方式有哪几种？8.细细胞胞膜膜、细细胞胞浆浆和和细细胞胞核核在在病病毒毒的的增增殖殖过过程程中中各各有什么意义？有什么意义？9.细细胞胞的的长长期期冻冻存存与与复复苏苏要要遵遵循循什什么么样样的的原原则则？具具体如何操作？体如何操作？
