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1、生化检测方法汇总 一、血清谷丙转氨酶(SGPT) 赖氏改良法 器材: 试管及试管架、移液器或吸量管、恒温水浴锅、721型分光光度计、温度计、动物血清 试剂: (1)0、1mol/L pH7 、4磷酸盐缓冲液: 0、1mol/L 磷酸氢二钠溶液: 称取 Na2HPO414 、22g 或 Na2HPO42H2O17、8g 溶 解于蒸馏水中, 并稀释至1 000ml,4 保存。 0、1mol/L 磷酸二氢钾溶液: 称 KH2PO413 、61g 溶解 dH2O中, 稀释至1000ml, 4保存。 将0、1mol/L 磷酸氢二钠溶液420ml 与0、1mol/L 磷酸二氢钾溶液80ml 混与即 为0、
2、1mol/L pH7 、4的磷酸盐缓冲液。加氯仿数滴,4 保存。 (2)标准丙酮酸( 含丙酮酸2、0mol/mL) : 取标准丙酮酸钠10mg,用上述缓冲液准确定容为50mL 。此液须当日用当日配。 (3)SGPT底物液( 含-酮戊二酸2mol/ml 及 DL- 丙氨酸200mol/ml) : 取-酮戊二酸29、2mg,DL-丙氨酸7g , 用试剂1溶成100ml, 在稀释到刻度前, 以1mol /L NaOH 调 pH 7、4( 因为转氨酶在 pH7 、3以下或7、6以上的环境中酶活性下降), 加数滴氯仿防腐。此液于冰箱保存可使用4天。 (4)GOT 底物液(DL天冬氨酸200mmol/L
3、, -酮戊二酸 2mmol/L):称取- 酮戊二酸29、2mg与 DL- 门冬氨酸2、66g 置于一小烧杯中, 加入1mol/L 氢氧化钠20、5ml 使溶解, 并校正pH至7、4, 然后将溶液移入100ml 容量瓶内, 用0、1mol/L 磷酸盐缓冲液定容至刻度。放置冰箱内保存。 (5)2、4-二硝基苯肼溶液: 取分析纯2,4- 二硝基苯肼19、8mg,用1mol/L HCl 溶于100ml, 置棕色瓶中保存。 (6)0、4mol/L NaOH 溶液: 称取16g 固体 NaOH, 用蒸馏水溶解, 冷却至室温, 定容至1000mL,备用。 操作步骤: 1、标准曲线绘制: 取试管 18 支按下
4、表操作。 试 管 号 对 照 1 2 3 4 5 丙酮酸标准液(1 毫升 2 微克分子) 0 0、05 0、10 0、15 0、20 0、25 SGPT或 SGOT底物 0、50 0、45 0、40 0、35 0、30 0、25 0、1M磷酸盐缓冲液 PH7 、4 0、1 0、1 0、1 0、1 0、1 0、1 生化检测方法汇总 相当于谷丙转氨酶单位 00 相当于谷草转氨酶单位 每个样做 3 个平行, 置 37 水浴 30 分钟, 各管加 2,4- 二硝基苯肼液 0、 5mL,混匀, 再在 37水浴中放置 20mL,各管加 0、4mol/L 氢氧化钠溶液 5mL,混匀,10 分钟后, 从水浴箱
5、中取出, 以蒸馏水调 “零” 点, 用 520nm波长比色, 读取各管之吸光值, 各管之吸光值均减去空白的吸光值,然后以吸光值为纵坐标, 各管相应的转氨酶单位为横坐标。绘制成标准曲线。为了方便, 可列出各光度相当于转氨酶单位表。 2、酶活性测定: 取试管两支, 注明测定管及对照管。 试剂 样品测定( 每个样 3 个平行) 对 照( 每个样 3 个平行) 血 清(mL) 0、1 0、1 SGPT或 SGOT底物(mL) 0、5 置 37水浴 30 分钟(SGOT为 37,60 分钟后再加枸橼酸苯胺1 滴) 2、4-二硝基苯肼(mL) 0、5 0、5 置 37水浴 20 分钟 SGPT或 SGOT
6、底物(mL) 0、5 NaOH 溶液(mL) 5、0 5、0 对照及样品各做3个平行, 充分摇匀, 静置10 分钟后, 用520nm波长比色, 以蒸馏水调节零点, 读取吸光值, 用样品减去对照吸光值, 求得样品的谷丙转氨酶活力。 谷丙转氨酶活性单位: 37, pH7 、4, 每小时每毫升血清催化生成 1mol 丙酮酸为 1 个单位。例:0 、1ml血清每小时催化生成 0、1mol 丙酮酸, 即相当于 GPT 100U / 100ml 血清。 注意: 生化检测方法汇总 1、 在测定 SGPT时, 应事先将底物、血清在 37水浴中 保温, 然后在血清管中加入底物, 准确记时。 2、 标准曲线上数值
7、在 20500U就是准确可靠的, 超过 500U时, 需将样品稀释。 3、 转氨酶只能作用于L氨基酸, 对 D氨基酸无 作用。实验室多用DL 氨基酸( 较 L氨基酸 价廉), 若用 L氨基酸, 则用量减半。 4、 溶血标本不宜使用, 因血细胞中转氨酶活力较高, 会影响测定效果。 5、 血清样品的测定需在显色后 30 分钟内完成。 6、丙酮酸标准液的浓度要求十分精确。由于丙酮酸开封后易 变质为多聚丙酮酸, 而影响丙酮酸标准液的有效浓度而不 易察觉。建议使用质量可靠的市售丙酮酸标准液。 7、每批试剂的空白管吸光度上下波动不应超过 0、015A,若有 超出, 应仔细检查试剂与仪器方面的问题。 8、严
8、重脂血、黄疸、溶血与糖尿病酮症酸中毒病人血清标本 可增加测定的吸光度, 测定这类标本应做血清标本对照管 优点:尽管基质液中余下的 a-酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝醌化合物而影响测定结果,但因其量不多,加之对 505nm 的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强,尤其用标准曲线作测定时,所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正,摈弃了赖氏法一些固有弊端,结果比其她比色法准确、 故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续监测法的单位使用赖氏法、1981 年全国常规生化检验方法学术讨论会认为赖氏法测定 ALT 活性较为合理, 缺点:由于赖氏法设计的底物浓度,如 a-酮戊二酸不足,反应速度只能达到
9、最大速度的 65%; 显色剂 2,4-二硝基苯肼的用量只及反应液中酮酸浓度的一半;保温 30min 的酶促反应后,新生成的丙酮酸与未用完的 a-酮戊二酸存在着无法人为控制的竞争显色的几率问题,如此等等,使赖氏法的重现性较差,在测量精度上仍与连续监测法相差甚大、 * 1 个卡门氏单位的定义就是: 在温度 25,pH7、4, 波长 340nm,光径 1cm 的条件下,1ml 血清使 NADH 的吸光度下降 0、001 的转氨酶活性。 * 国际单位: 在最适温度(25 ) 下,1 分钟产生 1mol 丙酮酸的酶量为 1 个活性单位, 即 1IU=1umol/min 。 * King 法单位定义就是:
10、 每 1ml 血清在 37条件下与底物作用 60 min, 生 成 1mol 丙酮酸称为一个单位。 * Mohun 法单位定义就是: 每毫升血清在 pH=7 、4,37 条件下与底物作用 30 min, 每生成 2、5 微克丙酮酸为 1 单位。 二、尿素氮(BUN)( 二乙酰一肟法尿素测定) (一)仪器设备:水浴锅、紫外分光光度计、10mL 试管 (二)试剂: 1、尿素氮试剂: 蒸馏水 100mL,浓硫酸 44mL,85% 磷酸 66mL,冷却至室温后, 加氨基硫脲 50mg,硫酸镉(3CdSO4 8H2O)2g, 溶解后稀释至 1000mL。 2、20g/L 二乙酰一肟试剂:称取二乙酰一肟2
11、0g,加入蒸馏水溶解,定容至1000mL。 生化检测方法汇总 3、尿素氮标准贮存液(357mmol/L): 称取尿素 1、072g 溶解于蒸馏水中定容至1000mL,至于棕色瓶中贮存。 4、尿素氮标准应用液(17、85mmol/L): 取贮存液 5mL,加蒸馏水定容至 100mL。 (三)操作步骤 按下面表格的试剂配比操作: 试剂 测定管 标准管 空白管 血清(ml) 0、02 - - 尿素氮标应用准液(ml) - 0、02 - 蒸馏水(ml) 0、02 二乙酰- 肟试剂(ml) 0、5 0、5 0、5 尿素氮试剂(ml) 5、0 5、0 5、0 按上述表的配方每个样做 3 个平行样,混匀,置
12、沸水浴中加热 15min,立即用自来水冷却5分钟。 分光光度计选用540nm 波长,以空白管调零点,读取各管吸光度。 尿素(mg%)= 测定管吸光度/标准管吸光度17、85(mg/ml) 1、 此法灵敏度高, 用量极微( 一般只需 0、02ml 血清即可) 。本实验就是先将血清用生理水以 1:4 加以稀释再取 0、1ml, 故最后计算时, 应乘以稀释倍数“5” 2、 试剂中加入硫胺脲与镉离子, 可增进显色强度与色泽稳定性, 但仍有轻度褪色现象( 小于 5%/h)。 3、 此法操作简单, 特异性强, 不受其她非蛋白质含氮化合物如尿酸、 肌酸等影响, 但应控制好实验条件。 4、 吸管必须校正, 使
13、用时务必注意清洁干净, 加量务必准确。 5、尿液中的尿素氮也可用此法进行测定。由于尿液中尿素氮含量高, 标本需用蒸馏水以 1:50 稀释。如果呈色后吸光度仍超过本法的线性范围, 还需将尿液再稀释, 重新测定。 3. 尿素浓度以前习惯用尿素氮表示, 尿素分子中含有二个氮原子, 因此 1mmol/L 尿素等于 2 mmol/L 尿素氮。世界卫生组织推荐使用尿素, 并以 mmol/L 表示浓度单位, 我国卫生部也已规定一律使用尿素, 不再使用尿素氮一词。 尿素氮 mg% = 测定管/ 标准管0、002100/0 、15 = 测定管/ 标准管10 【参考范围】 5-20 mg/dl 生化检测方法汇总
14、三、肌酐(Cr) 四、血糖(Glu)( 邻甲苯胺法) 血糖就是指血液中的葡萄糖,葡萄糖与冰醋酸、邻甲苯胺共热时,葡萄糖先脱水转化为羟甲基糠醛,再与邻甲苯胺缩合为蓝绿色的薛夫碱,其颜色的深浅与葡萄糖含量成正比。可用比色法进行定量测定。 1、仪器:紫外分光光度计、水浴锅 2、试剂: (1) 葡萄糖标准母液 (10mg/ml, 用饱与苯甲酸溶液配制) (2)邻甲苯胺溶液: 2、5g 硫脲溶于冰醋酸,加入邻甲苯胺 150ml 及 2、4%硼酸 100ml,用冰醋酸定容至 1 升。 3、操作步骤: (1)配置不同浓度葡萄糖标准溶液:取 5 支 10ml 容量瓶,标号,依次加入葡萄糖母液 0、25,0、5
15、,1、0,2、0,3、0ml,用饱与苯甲酸稀释至 10ml,混匀(则上述溶液 100ml 葡萄糖含量为 25,50,100,200,300mg ); 生化检测方法汇总 (2)分别精密吸取不同浓度葡萄糖标准溶液于试管中,设平行管,空白管加 0、 1mL蒸馏水,各管加入邻甲苯胺试剂 5、0mL,混匀后,置沸水中 15 分钟,立即移入冷水浴中冷却; (3)以空白号管调零,于紫外分光光度计波长 630nm 处测吸光值,以各管的吸光度为纵坐标,相应管中葡萄糖含量(mg) 为横坐标,绘制标准曲线,得出线性方程。 (4)测试样品:取全血 0、1mL,设平行样,按上述方法测出其A630nm吸光值,通过线性方程
16、求出其血糖含量。 试剂(mL) 0 1 2 3 4 5 邻甲苯胺试剂 5、0 5、0 5、0 5、0 5、0 5、0 不同浓度葡萄糖标准溶液 0 0、1 0、1 0、1 0、1 0、1 蒸馏水 0、1 0 0 0 0 0 100mL 全血相当于葡萄糖质量 mg 300 A630nm 0、000 注意事项: 1、 本法不需要除去蛋白质,邻甲苯胺试剂只与醛糖显色,血液中其她还原性物质基本上无影响。 2、 邻甲苯胺试剂与葡萄糖显色的深浅及其稳定性与试剂中邻甲苯胺浓度、冰醋酸浓度、加热时间有关。此法显色稳定,24 小时内无变化。如将加热时间缩短,生成颜色容易消褪。 3、 轻度溶血的血清对结果无明显影响
17、。根据推导,血清中含血红蛋白 450 毫克/100 毫升时,可使测定结果降低约 10%。 4、高脂血的标本最后显色有时会出现浑浊,影响测定结果。可先制备血滤液后生化检测方法汇总 再行测定。 五、血清白蛋白(Alb)( 溴甲酚绿法 BCG) 原理:血清白蛋白在 PH4、2 的缓冲液中带正电荷,在有非离子型表面活性剂存在时,可与带负电荷的染料溴甲酚绿(BCG) 结合形成蓝绿色复合物,在波长 630 纳米处有光吸收峰,其颜色的深浅与白蛋白浓度成正比,与同样处理的白蛋白标准比较,可求得血清白蛋白含量。 试剂: 1、 溴甲酚绿(BCG) 贮存液:取 BCG 419mg, 用 10ml 0、 1mol/L
18、 NaOH 溶解,加 NaN3 100mg ,定容至 1000mL。贮于棕色瓶备用。如用溴甲酚绿钠盐应称取 432mg、加水溶解。 2、 0、1mol/L 柠檬酸缓冲液(pH 4、2):分别配制 0、1mol/L 柠檬酸与柠檬酸钠溶液,然后按 12、 3:7、 7 的体积比例混合。 每 1000ml 混合液加入 NaN3 100mg。 3、 30%聚氧化乙烯月桂醚(Brij-35)溶液:取 Brij-35 30g,加少量水,60水浴溶解,加水至 100ml(此可用 Tween-20 或 Tween-80 代替)。 4、 BCG应用液:BCG贮存液 250ml,0 、1mol/L柠檬酸缓冲液(p
19、H4 、2)750ml,30%Brij-35 8ml(也可以用Tween-20 8ml或Tween-80 10ml代替)混合而成。 5、标准蛋白溶液(10mg/ml): 称取白蛋白 1、00g,用生理盐水。 实验操作: 1. 白蛋白标准曲线绘制 (1) 稀释白蛋白标准液:分别精密量取白蛋白标准液 0、10 mL,0、20 mL,0、40 mL,0、60 mL 于试管中,再在每个管中依次加入蒸馏水 0、9 mL,0、8 mL,0、6 mL,0、4 mL,混匀,得到稀释后白蛋白标准液含量分别为 1、0 mg/ml,2 、0 生化检测方法汇总 mg/ml,4、0 mg/ml,6 、0 mg/ml 。
20、 (2) 分别精密量取每个不同浓度稀释白蛋白标准液 0、 2mL 于试管中,空白管加入生理盐水 0、2mL,设平行样,再在每个管中加入 BCG 应用液 5、0mL,混匀后以空白管调零,立即于紫外分光光度计测吸光值,吸收波长为 620mn,绘制标准曲线,得出线性方程。 (3) 样品血清白蛋白测定:用生理盐水按1:10的比例稀释血清,取稀释后的血清0、2ml 按上述方法测出其吸光值,求得其白蛋白含量。 注意事项 1.BCG 就是一种 PH 指示剂,变色域为 PH3、8(显黄色)5、4(显蓝绿色),因此控制反应液的 PH 就是本法测定的关键。 2.配制 BCG 试剂也可用其她缓冲液如枸椽酸盐或乳酸盐
21、缓冲液。 但以琥珀酸缓冲液的校正曲线通过原点,线性好,灵敏度高,成为首选推荐配方。 3.试剂中的 Brij-35 也可用其她表面活性剂代替,如吐温 20 或吐温 80,终浓度为 2ml,灵敏度与线性范围不变。 4.当白蛋白标准与 BCG 结合后,溶液光径 1,在 630 处测定的吸光度应为 0、8110、035,如达不到此值,表示灵敏度较差。 5.蛋白质标准液就是一个复杂的问题,实验证明,BCG 不但与白蛋白呈色,而且与血清中多种蛋白质成分呈色,其中以球蛋白、运铁蛋白、结合珠蛋白更为显著,其反应速度较白蛋白稍慢。由于 30S 内呈色对白蛋白特异,故 BCG 与血清混合后,在 30S 内读取吸光
22、度,可明显减少非特异性呈色反应。为了减少本法基质效应的影响,最好用参考血清作标准。 1.本法操作简便、快速、胆红素、溶血与中度脂血无干扰,既可手工操作,也能自动化分析,就是目前国内测定血清白蛋白的最常用方法。 生化检测方法汇总 2.本法线性范围 10-60g/L,RCV4%。但该法与溴甲酚紫法比较,对血清白蛋白特异性稍差。 六、血清总蛋白(TP)( 双缩脲法) 原理:血清中蛋白质分子的肽键与双缩脲试剂中的 Cu+ 结合形成紫色化合物;其色度与总蛋白的浓度成正比,在 546 波长下进行比色测定。实际上凡就是分子内含有两个氨基甲酰基(-CONH2)的化合物,不论直接相连或就是通过一个氮或碳原子间接
23、连接,均能与双缩脲试剂发生反应。蛋白质分子内含有许多肽键(-CONH2 ),因此可用双缩脲法作比色测定。 但应注意的就是不仅仅就是(-CONH2),凡含-CSNH2、-C(NH)NH2 或-CH2NH2 等基团而具有累似结构的化合物对双缩脲试验亦呈阳性,所以本反应并非为蛋白质所特有。但在体液中,除蛋白质外实际上不存在可与双缩脲试剂显色的物质。各种血浆蛋白质,包括病理的与正常的,呈色的程度基本相同,因此在血浆蛋白的比色测定中,双缩脲反应就是比较理想的方法。 仪器:紫外分光光度计、水浴锅、电子天平、 试剂: (1)10%氢氧化钠溶液:称取 10、00g 氢氧化钠,用蒸馏水溶解,冷却至室温后,定容至
24、 1L,备用。 (2)双缩脲试剂:取 1、50g 硫酸铜与 6、0g 酒石酸钾钠,用 500mL 水溶解,在搅拌下加入 300mL10氢氧化钠溶液,1、0g 碘化钾;用水稀释到 1000mL,避光保存。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色或暗红色沉淀出现,则需重新配制。 (3)标准蛋白溶液:10mg/mL 牛血清白蛋白溶液或相同浓度的酪蛋白溶液(酪蛋白用 0、 05moL/L 氢氧化钠溶液配制)。 作为标准用的蛋白质要预先用微生化检测方法汇总 量凯氏定氮法测定蛋白质含量,根据其纯度称量,配制成标准溶液。 (4)待测蛋白质溶液:待测血清按 1:10 倍数稀释,待用。(注意样品浓度不要超过10mg/
25、ml) 操作方法: (1)标准曲线的测定:精密吸取 0 mL,0、2 mL,0、4 mL,0、6 mL,0、8 mL,1、0mL的标准蛋白质溶液于试管中,分别依次加入蒸馏水 1、0mL,0、8mL,0、6mL,0、4mL,0、2mL,0mL, 设平行样,然后加入 4mL 双缩脲试剂。充分摇匀后,37水浴 10min,以空白管调零点,在 540nm 波长处测定吸光值。以蛋白质的含量为横坐标,光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。 (2)样品的测定:用上述同样的方法,测定稀释的待测血清的蛋白质浓度。 注意: 1、样品中总蛋白含量超过 100、0g/L,则用生理盐水稀释后测定,结果乘以稀释倍数。 2、试剂浑
26、浊变色不能用。 3、试剂使用后立即盖紧瓶盖。 1、白蛋白/球蛋白=1、52、5/1,通过计算其比值可以判定肝脏的功能情况; 2、总蛋白升高:脱水,皮肤大面积烧伤、发烧、腹泻、呕吐。 3、 总蛋白降低:大量输液将机体血浆稀释,某些水肿性疾病,长期营养不良与消耗性疾病。 4、球蛋白大量降低:机体免疫功能降低。 七、总胆固醇(TCH) 八、甘油三酯(TG) 九、酪氨酸多巴氧化酶活性测定(多巴色素法) 生化检测方法汇总 1、仪器设备:紫外分光光度计,离心机,秒表 2、试剂: (1)0、10mol/L 磷酸缓冲液(pH6、0):50mL0 、20mol/L Na2HPO4 与 22mL0、1mol/L
27、HCl 混合,稀释至 200mL。 (2)0、010mol/L 多巴溶液:称取 0、195g 多巴,用 pH6、0 磷酸缓冲液溶解并定容至 100mL。 3、实验方法: 取 0、1mL 待测液于试管中,加入 2、9mL pH6、0 缓冲液,再加入 2mL 多巴溶液,立即摇匀于 480nm 波长下测吸光值,开始 6min 内每分钟读一次数,以后各2min 读一次数,直至吸光度变化不大为止。 以吸光度对时间作图,从直线斜率求出酶活性。设平行样,同样方法测 0、2mL 与 0、3mL 待测液的吸光值,求出酶活力。 试样中酶活力计算公式: =k/ V106 待测样品的酶活性; k吸光值对时间作出的直线
28、斜率; 多巴溶液的摩尔吸收系数,L/g、cm; V待测样品的体积,mL。 十、SOD的测定方法 1、试剂的配制 (1)0 、05mol/L 磷酸缓冲液(PBS,pH7、8): A母液:0 、2mol/L 磷酸氢二钠溶液: 取 Na2HPO412H2O(分子量 358、14)71 、7g,用蒸馏水溶解并定容至 1000mL; B母液:0 、2mol/L 磷酸二氢钠溶液: 取 NaH2PO42H2O(分子量 156、01)31 、2g, 生化检测方法汇总 用蒸馏水溶解并定容至 1000mL; 0、 05mol/L PBS(pH7、 8) 的配制: 分别取A母液(Na2HPO4) 228、 75mL
29、,B母液(NaH2PO4) 21、25mL,用蒸馏水定容至 1000mL 。 (2)14 、5mM 甲硫氨酸溶液(Met): 取 2、1637g Met 用磷酸缓冲液(pH7、8) 定容至1000ml。 (3)30 M EDTA-Na2 溶液: 取 0、001gEDTA-Na2 用磷酸缓冲液定容至 100mL 。 (4)60 M核黄素溶液: 取 0、 0023g 核黄素用磷酸缓冲液定容至 100mL,避光保存。 (5)2 、25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液: 取 0、1840g NBT 用 PBS定容至 100ml, 避光保存。 2、酶活性测定 (1) 反应混合液配制( 以 60 个样为准):
30、 分别取 Met 溶液 162mL,EDTA-Na2溶液 0、6mL,磷酸缓冲液 5、4mL,NBT溶液 6mL,核黄素溶液 6mL,混合后摇匀; (2) 分别取 3ml 反应混合液与 30L酶液于试管中 (3) 将试管置于光照培养箱中在 4000 lux光照下反应 20min; 同时做两支对照管, 其中 1 支试管取 3mL反应混合液加入 30L PBS( 不加酶液)照光后测定作为最大光还原管, 另 1 支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。 (4) 以不照光的对照管( 只有缓冲液并置于暗处) 调零后, 避光测 A560( 出现颜色即可测定) 。 (5) 酶活性计算:SOD活性单位以抑制 NB
31、T光化还原 50所需酶量( 测的样品值要在最大管的一半左右才合适, 否则要调整酶量) 为 1 个酶活单位(U) 。 SOD总活性 ( Ack-AE ) V/(1/2AckVt) 式中Ack为照光对照管的吸光度; 生化检测方法汇总 AE为样品管的吸光度; V为样品液总体积(ml,1 、6ml, 加入 PBS的体积); Vt为待测样(ml,30ul) 十一、CAT(过氧化氢酶) 的测定方法 1、试剂配制: 0、15mol/L 磷酸缓冲液(pH7、0):取 A 母液(Na2HPO4) 457、5 ml 与 B 母液(NaH2PO4) 292、5 ml 混合后用蒸馏水定容至 1000ml。 2、酶活测
32、定 (1)反应液配制:取 200ml PBS(0 、 15M,pH7、 0),加入 0、 309ml 30%的 H2O2(原液)摇匀即可。 (2)样品测定:以 PBS 为对照调零,取 3ml 反应液加入 0、1ml(可视情况调整)样品液,立即测定 A240(紫外),1min 测一次,连续 4min。 (3)酶活性计算:以每 min OD 值减少 0、01 为 1 个酶活性单位(u)。 CAT(u/mL min)= A240 /(Vs 0、01 t) 式中A240:为反应时间内吸光度的变化; T:为反应时间 (min); Vs:为测定时样品液体积(ml)。 十二、MDA 的测定方法 1、试剂配制
33、: (1)5%TCA(三氯乙酸):5 、0gTCA用蒸馏水定容至 1000ml; Cm mol/L(2)0 、5%TBA(2- 硫代巴比妥酸):2 、5g 用 TCA定容至 500ml。( 避光) 2、操作方法: 取待测样 2mL 与 3ml0、5%TBA混合后在沸水浴煮沸 15min, 然后迅速冷却,4500r/min离心10min, 用蒸馏水为空白调零, 分别测定上清液在450nm 、 532nm与 600nm处的吸光值。 生化检测方法汇总 3、计算组织中 MDA 含量: MDA 浓度 C ( mol/L)=6 、452(OD532-OD600)-0、559D450 十三、谷胱甘肽过氧化物
34、酶(GSHPx) 活力测定方法 原理 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)就是体内存在的一种含硒清除自由基与抑制自由基反应的系统。对防止体内自由基引起膜脂质过氧化特别重要, 其活力以催化 GSH氧化的反应速度, 及单位时间内 GSH减少的量来表示,GSH与 5,5 -二硫对硝基苯甲酸(DTNB)反应在 GSH-Px催化下可生成黄色的 5-硫代 2-硝基苯甲酸阴离子, 于 423nm波长有最大吸收峰, 测定该离子浓度, 即可计算出 GSH减少的量,由于 GSH能进行非酶反应氧化, 所以最后计算酶活力时, 必须扣除非酶反应所引起的 GSH减少。 1、试剂与仪器 仪器: 可见光分光光度计、低温高速离心
35、机、恒温水浴锅、微量加样器 试剂: （1）叠氮钠磷酸缓冲液 pH7、0: 分别称取 NaN316、25mg,EDTA-Na27、44mg,Na2HPO4 1、 732g,NaH2PO41、 076g, 加入蒸馏水溶解至 100mL,用少量 HCL 、 NaOH调 pH7 、0,4 保存。 (2)1mmol/L谷胱甘肽( 还原型 GSH)溶液: 称取 GSH 30、7mg加叠氮钠磷酸缓冲液至 100mL,临用前配制, 冰冻保存 1-2 天。 (3)1 、25-1、5mmol/L H2O2溶液: 取 30H2O2 0 、15mL-0 、17mL,用双蒸水稀释至 100mL,作为贮备液,4 避光保存
36、, 临用前将贮备液用双蒸水稀释 10 倍即可。 (4) 偏磷酸沉淀液: 称取 16、7gHPO3(先用蒸馏水溶解),0 、5gEDTA,280gNaCl加蒸馏水溶解至 1000mL,用普通滤纸过滤, 室温保存。 (5)0 、32mol/LNa2HPO4溶液: 称取 22、7gNa2HPO4加蒸馏水至 500mL,室温保存。 生化检测方法汇总 (6)DTNB 显色液: 称取 40、0mgDTNB,1 、000g 柠檬酸三钠加蒸馏水溶解至100mL,4避光保存 1 个月。 2、实验步骤 1、3、6、2、3、1 样品制备 溶血液: 取鼠血 10l 加入到 1mL双蒸水中, 充分振摇, 使之全部溶血
37、1:100待测,4h 内测定酶活力。若当天来不及测定, 将肝素抗凝全血置-20冻存,3d 内测定, 若 4存放,28h 内必须测完。测前取出样品室温自然解冻。 组织上清液: 动物禁食过夜, 处死后, 立即取出所需脏器, 放入冷生理盐水中洗去浮血, 剔除脂肪及结缔组织, 滤纸吸干后, 在冰浴上剪成碎块, 称取适量组织,加冷 0、 2M磷酸缓冲液, 以 20000r/min 匀浆 10s, 间歇 30s, 反复 3 次制成 5% 组织匀浆, 操作在冰浴中进行, 匀浆以12500g 离心10min( 低温高速离心机), 以沉淀为破碎的细胞、细胞碎片、核及线粒体, 上清液用以测胞液中的酶活力, 最好当
38、天测, 否则加 20(v/v)甘油分装于塑料管, 放置-20-80, 可保存数周, 而酶活力不减。 (1) 样品测定: 将组织上清液按 1:20 稀释( 若溶血液按 1:100 稀释) 。按样品管、非酶管分别对应加入 1、0mmol/L GSH 溶液各 0、4mL,稀释样品 0、4mL与0mL,蒸馏水 0mL与 0、4mL,混匀置于 37水浴预温 5min。然后各加入 H2O20、2mL,37水浴准确反应 3min, 取出各加入偏磷酸沉淀液 4mL,混匀于 3000r/min离心 10min。各取出上清液 2mL(非酶管加热使酶失活), 加入 0、32mol/LNa2HPO4各 2、5mL及
39、DTNB 显色液各 0、5mL,显色反应 1min 后于 412nm波长(1cm 光径)测 OD值,5min 之内读数准确。另外空白管与标准管分别对应加入蒸馏水 0、4mL与 0mL,20mol /L GSHR 标准液 0mL与 0、 4mL,偏磷酸沉淀液各 1、 6mL,0、 32mol/L Na2HPO4各 2、5mL,DTNB 显色液各 0、5mL反应, 同样条件测 OD值。 生化检测方法汇总 试剂 样品管(mL) 非酶管(mL) 标准管(mL) 空白管(mL) 1、0mmol/LGSH 应用液 0、4 0、4 样品液 0、4 蒸馏水 0、4 20mol /L GSH 标准液 0、4 3
40、7水浴预温 5min H2O2(37预热) 0、2 0、2 37水浴准确反应 3min (严格控制时间) 偏磷酸沉淀液 4 4 3000r/min 离心 10min 离心上清液 2 2 双蒸水 0、4 偏磷酸沉淀液 1、6 0、32mol/LNa2HPO4 2、5 2、5 2、5 DTNB 显色液 0、5 0、5 0、5 显色反应 1min 后于 423nm 波长(1cm 光径),读 OD 值,5min 之内读数准确。 注:样品为组织上清液时,非酶管改为加热使酶失活的组织上清液。溶血液稀释 100 倍取 0、10、4mL,组织上清液按 1:20 稀释,取稀释液 0、4mL。 (2) 计算 规定为毫克蛋白质, 每分钟扣除非酶反应的作用, 就是反应体系中 GSH浓度降低 1mol/L 为一个活力单位。 组织上清液 GSH-Px酶活力=(OD 非酶-OD酶)/(OD 标准-OD空白) cn/t/m C标准管浓度,20 mol/L; N样品稀释倍数; t 反应时间 m 取样量的蛋白含量
