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1、第五章第五章 紫外紫外- -可见吸光光度法可见吸光光度法5-5-1 1 吸光光度法的基本原理吸光光度法的基本原理5-5-2 2 光的吸收定律光的吸收定律郎伯郎伯- -比耳定律比耳定律5-5-3 3 紫外紫外- -可见吸光光度计可见吸光光度计5-5-4 4 实验条件的选择实验条件的选择5-55-5 吸光光度法应用示例吸光光度法应用示例1化学分析化学分析：常量组分：常量组分(1%), Er : 0.1%-0.2% 依据化学反应依据化学反应, 使用玻璃仪器使用玻璃仪器 化学分析与仪器分析方法比较化学分析与仪器分析方法比较仪器分析仪器分析：微量组分：微量组分(1%), Er : 1%-5% 依据物理或
2、物理化学性质依据物理或物理化学性质, 需要特殊的仪需要特殊的仪器器例例: 含含Fe约约0.05%的样品的样品, 称称0.2 g, 则则m(Fe)0.1 mg重量法重量法 m(Fe2O3)0.14 mg, 称不称不准准容量法容量法 V(K2Cr2O7)0.02 mL, 测不测不准准 光度法光度法 结果结果0.048%0.052%, 满足要求满足要求准确度高准确度高灵敏度高灵敏度高2仪器分析方法分类仪器分析方法分类2. 电化学分析法电化学分析法: 依据物质的电化学性质及其变化依据物质的电化学性质及其变化3. 色谱法色谱法: 气相色谱气相色谱, 液相色谱液相色谱,毛细管电泳法毛细管电泳法4. 质谱法
3、、热分析法、放射化学法等质谱法、热分析法、放射化学法等非光谱法非光谱法 （折射法，浊度法，旋光法）（折射法，浊度法，旋光法）（不（不以光的以光的波长为特征讯号）波长为特征讯号）光谱法光谱法分子光谱法分子光谱法 UV/Vis,IR,NMR 原子光谱法原子光谱法 AAS,AES, AFS（以（以光的光的吸收、发射等作用而建立的分析方法，通过吸收、发射等作用而建立的分析方法，通过检测光谱的波长和强度来进行定性和定量的方法）检测光谱的波长和强度来进行定性和定量的方法）光光学学分分析析法法1. 光学分析法光学分析法: 基于电磁辐射与物质的相互作用基于电磁辐射与物质的相互作用.3吸光光度法吸光光度法 基于
4、被测物质的基于被测物质的分子分子 对对光光 具有选择吸收具有选择吸收的特性而建立的分析方法。的特性而建立的分析方法。 5-1 吸光光度法的基本原理吸光光度法的基本原理 特点特点 灵敏度高：测定下限可达灵敏度高：测定下限可达10-5-10-6molL-1；准确度能够满足微量组分的测定要求：准确度能够满足微量组分的测定要求： 相对误差相对误差2%-5操作简便、快速、选择性好、仪器设备简单操作简便、快速、选择性好、仪器设备简单应用广泛应用广泛4一、光的基本性质一、光的基本性质波动性波动性光的传播速度光的传播速度: : c真空中光速真空中光速 3.0 108 m/s 波长，单位：波长，单位：m,cm,
5、mm,m,nm, 1m=10-6m, 1nm=10-9m, 1=10-10m 频率，单位：频率，单位：Hz 次次/秒秒5h普朗克普朗克(Planck)常数常数 6.62610-34JsE光量子具有的能量光量子具有的能量 单位：单位：J(焦耳焦耳)，eV(电子伏特电子伏特) 1eV=1.6021019 J微粒性微粒性光量子，具有能量：光量子，具有能量：6结结论论: :一一定定波波长长的的光光具具有有一一定定的的能能量量，波波长长越越 长长( (频率越低频率越低) )，光量子的能量越低，光量子的能量越低. .单色光：单色光：具有相同能量具有相同能量( (相同波长相同波长) )的光的光. .混混 合
6、合 光光 ： 具具 有有 不不 同同 能能 量量 ( (不不 同同 波波 长长 ) )的的 光光 复复 合合 在在 一起一起. . 例如白光例如白光. .波粒二象性波粒二象性7 射射线线x射射线线紫紫外外光光红红外外光光微微波波无无线线电电波波10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm可可 见见 光光光学光谱区光学光谱区8二、物质对光的选择性吸收二、物质对光的选择性吸收物质的颜色与光的关系物质的颜色与光的关系完全吸收完全吸收完全透过完全透过吸收黄色光吸收黄色光光谱示意光谱示意表观现象示意表观现象示意复合光复合光9 /nm颜色颜色互
7、补光互补光400-450紫紫黄绿黄绿450-480蓝蓝黄黄480-490绿蓝绿蓝橙橙490-500蓝绿蓝绿红红500-560绿绿红紫红紫560-580黄绿黄绿紫紫580-610黄黄蓝蓝610-650橙橙绿蓝绿蓝650-760红红不同颜色的可见光波长及其互补光不同颜色的可见光波长及其互补光蓝绿蓝绿101.价电子相对于原子核的运动价电子相对于原子核的运动-电子能级电子能级; 能级差：能级差：1-20 ev；吸收波长：吸收波长：1.25-0.06 m； 紫外紫外-可见光谱或电子光谱。可见光谱或电子光谱。2. 原子核在其平衡位置附近的相对振动原子核在其平衡位置附近的相对振动-振动能级振动能级; 能级差
8、：能级差：0.05-1 ev；吸收波长：吸收波长：25-1.25 m； 红外光谱或分子振红外光谱或分子振-转光谱。转光谱。3. 分子本身绕其重心的转动分子本身绕其重心的转动-转动能级转动能级. 能级差：能级差：0.005-0.05 ev；吸收波长：吸收波长：250-25 m； 远红外光谱或分子转动光谱。远红外光谱或分子转动光谱。物质分子内部物质分子内部3 种运动形式及其对应能级种运动形式及其对应能级11三、定性分析与定量分析的基础三、定性分析与定量分析的基础定性分析基础定性分析基础定量分析基础定量分析基础物质对光的选择物质对光的选择吸收吸收ABA 在在一一定定的的实实验验条条件件下下，物物质质
9、对对光光的的吸吸收收与与物物质质的的浓度成正比。浓度成正比。A C增增大大12 5-2 光的吸收定律光的吸收定律郎伯郎伯-比耳定律比耳定律郎伯郎伯- -比耳定律；比耳定律；吸光度与透光度的关系；吸光度与透光度的关系；偏离郎伯偏离郎伯- -比耳定律的原因；比耳定律的原因；13一、郎伯一、郎伯-比耳定律比耳定律透光度透光度(透射比透射比) Transmittance透光度定义：透光度定义：T 取值为取值为 0.0% 100.0%全部吸收全部吸收T = 0.0 %全部透射全部透射T = 100.0 %入射光入射光 I0透射光透射光 I14朗伯定律朗伯定律:(1760) A b 当入射光的当入射光的
10、、吸光物质的吸光物质的c一定时，溶液一定时，溶液的吸光度的吸光度A与液层厚度与液层厚度b成正比成正比.比耳定律比耳定律(1852) A c当入射光的当入射光的 、液层厚度液层厚度b 一定时，溶液一定时，溶液的吸光度的吸光度A与吸光物质的与吸光物质的c成正比成正比.15意意义义：当当一一束束平平行行单单色色光光通通过过均均匀匀、透透明明的的、非非散散射射的的吸吸光光物物质质时时，其其吸吸光光度度与与溶溶液液液液层层的的厚厚度和浓度的乘积成正比。度和浓度的乘积成正比。A=lg(I0/I)=abc前提条件：前提条件：单色光：单色光：应选用应选用 max处测定处测定；吸光质点形式不变；吸光质点形式不变
11、； 离解、络合、缔合会破坏线性关系离解、络合、缔合会破坏线性关系, 应控制条件应控制条件(酸度、浓度、介质等酸度、浓度、介质等)；稀溶液：稀溶液：浓度太大，分子间作用力增强。浓度太大，分子间作用力增强。16吸光度与透光度吸光度与透光度T ： 透光度透光度A： 吸光吸光度度1.00.50ACA100500T %TT = 0.0%A = T = 100.0%A = 0.0A = 0.434T = 36.8%17吸光系数吸光系数b: 吸光液层的厚度吸光液层的厚度, cmc: 吸光物质的浓度吸光物质的浓度, g/L, mol/La：比例常数比例常数入射光波长入射光波长物质的性质物质的性质温度温度取值与
12、浓度的单位相关取值与浓度的单位相关c: mol/La 摩尔吸光系数摩尔吸光系数, cm-1 mol1 Lc: g/La吸光系数吸光系数, Lg1cm-1 Molar Absorptivity18溶液浓度的测定溶液浓度的测定Abc工作曲线法工作曲线法(标准曲线标准曲线)朗伯朗伯- -比耳定律的分析应用比耳定律的分析应用 0 1.0 2.0 3.0 4.0 cA。 。 。 。*0.800.600.400.200.00Axcx吸光度的加和性与吸光度的测量吸光度的加和性与吸光度的测量 A = A1 + A2 + +An19二、偏离郎伯二、偏离郎伯- -比耳定律的原因比耳定律的原因AC主要原因主要原因非
13、非单色光单色光吸光质点的相互作用吸光质点的相互作用20 5-3 紫外紫外-可见吸光光度计可见吸光光度计分光光度计的构成；分光光度计的构成；分光光度法的灵敏度和准确度分光光度法的灵敏度和准确度212223紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法, UV-VIS0.434光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器显示显示24吸光分析法的仪器简介吸光分析法的仪器简介紫外紫外- -可见分光光度计组件可见分光光度计组件光源光源单色器单色器样品池样品池检测器检测器显示装置显示装置氢灯氢灯, 氘灯氘灯, 180-375 nm; 卤钨灯卤钨灯, 320-2500 nm.基本要求基本要求: 光源强光源强, 能量
14、分布均匀能量分布均匀, 稳定稳定作用作用: 将复合光色散成单色光将复合光色散成单色光棱镜棱镜光栅光栅玻璃玻璃, 350-3200 nm, 石英石英, 185-4000 nm光学玻璃光学玻璃, 石英石英作用作用: 将光信号转换为电信号将光信号转换为电信号, 并放大并放大光电池，光电管光电池，光电管, 光电倍增管光电倍增管, 光导摄像管光导摄像管(多道分析器多道分析器)微安表、检流计、屏幕、数字显示记录仪微安表、检流计、屏幕、数字显示记录仪25氙灯氙灯氢灯氢灯钨灯钨灯26棱镜：棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同依据不同波长光通过棱镜时折射率不同入射狭缝入射狭缝准直透镜准直透镜棱镜棱镜聚焦透镜
15、聚焦透镜出射狭缝出射狭缝白光白光红红紫紫1 12 2800 600 50040027光栅：光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等等宽度等间距间距条条痕痕(600、1200、2400条条/mm )。 利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。波长范围宽波长范围宽, , 色散均匀色散均匀, ,分辨性能好分辨性能好, , 使用方便使用方便. .光栅衍射示意图光栅衍射示意图M1M2出出射射狭狭缝缝光屏光屏透透镜镜平面透平面透射光栅射光栅28单光束分光光度计单光束分光光度计可变波长单光束紫外可变波长单光束紫外- -可见分光光度
16、计示意图可见分光光度计示意图29吸光光度法的灵敏度与准确度吸光光度法的灵敏度与准确度灵敏度灵敏度吸光光度法是一种适合于微量组分测定的仪器分析法，检吸光光度法是一种适合于微量组分测定的仪器分析法，检测限大多可达测限大多可达10-3 10-4 g/L 或或 g/mL 数量级。数量级。准确度准确度能能满足微量组分测定的要求。一般相对误差满足微量组分测定的要求。一般相对误差25%。30对摩尔系数的理解一对摩尔系数的理解一32+桔红色桔红色 508邻二氮菲邻二氮菲 =1.1104测定测定工作曲线的斜率即为摩尔吸收系数工作曲线的斜率即为摩尔吸收系数摩尔吸收系数是对吸光物质而言，是由吸光摩尔吸收系数是对吸光
17、物质而言，是由吸光物质的结构特征，吸光面积等因素决定。物质的结构特征，吸光面积等因素决定。灵敏度的表示方法灵敏度的表示方法摩尔吸光系数摩尔吸光系数 当当 b=1 时，时， AC031对对摩尔系数的理解二摩尔系数的理解二对对同一种待测物质，不同的方法具有不同的同一种待测物质，不同的方法具有不同的 ，表明具有不同的灵敏度。表明具有不同的灵敏度。例：分光光度法测铜例：分光光度法测铜铜铜试剂法测试剂法测 Cu426 = 1.28 104 L mol-1 cm-1双硫腙法测双硫腙法测 Cu495 = 1.58 105 L mol-1 cm-1一般情况一般情况 105低低灵敏度灵敏度中等灵敏度中等灵敏度高
18、灵敏度高灵敏度32影响准确度的因素影响准确度的因素仪器测量误差仪器测量误差吸光定律吸光定律根据误差传递公式，有根据误差传递公式，有 又又得得浓度测量的浓度测量的相对偏差相对偏差令令得得T = 0.368 = 36.8 %A = 0.434 时，仪器测量误差最小时，仪器测量误差最小331086420204060800.70.40.20.1AT/%Er(36.8)0.434浓度浓度测量测量的相的相对误对误差与差与T(或或A)的的关系关系实际工作中，应控制实际工作中，应控制T在在1070, A在在0.151.0之间之间 (调调c, b, )34 5-4 实验条件的选择实验条件的选择 测量条件；测量条
19、件； 分析条件；分析条件；35测量条件的选择测量条件的选择测量波长的选择测量波长的选择无无干扰，选择测量干扰，选择测量 max有有干扰干扰A A 待测溶液吸光度的选择待测溶液吸光度的选择控制控制A = 0.2 0.8 T = 65% 15% 方法方法选择选择 C选择选择 b1 非单色光非单色光影响小影响小2 灵敏度高灵敏度高36 用用参参比比溶溶液液调调T=100%（A=0），再再测测样样品品溶溶液液的的吸吸光光度度，即即消消除除了了吸吸收收池池对对光光的的吸吸收收、反反射射，溶剂、试剂对光的吸收等。溶剂、试剂对光的吸收等。参比溶液参比溶液I0I参比参比样品样品入射光入射光 I0透射光透射光
20、I37参比溶液的选择参比溶液的选择原则：原则：扣除非待测组分的吸收扣除非待测组分的吸收以显色以显色反应为例进行讨论反应为例进行讨论M + R = M-R max试液试液 显色剂显色剂 溶剂溶剂 吸光物质吸光物质 参比液组参比液组成成无无吸收吸收无无吸收吸收光光学学透透明明溶剂溶剂基质吸收基质吸收无无吸收吸收吸收吸收不加显色剂的试液不加显色剂的试液无无吸收吸收吸收吸收吸收吸收显色剂显色剂基质吸收基质吸收吸收吸收吸收吸收吸收吸收显色显色剂剂 + 试液试液 + 待测组分的掩蔽剂待测组分的掩蔽剂若欲若欲测测 M-R 的吸收的吸收A(样样) = A(待测吸光物质待测吸光物质) + A(干扰干扰) + A
21、(池池)A(参比参比) = A(干扰干扰) + A(池池)38吸光光度法分析条件的选择吸光光度法分析条件的选择显色显色反应反应有机物质有机物质官能团强吸收官能团强吸收直接测定直接测定UV-VIS官能团弱吸收官能团弱吸收衍生化反应衍生化反应UV-VIS显色显色反应反应无机物质无机物质通常通过显色反应生成吸光系数大的有色通常通过显色反应生成吸光系数大的有色物质进行测定，以提高灵敏度。物质进行测定，以提高灵敏度。32+桔红色桔红色 508邻二氮菲邻二氮菲39显色剂与显色反应显色剂与显色反应 ：助色团助色团NH，OH，X （孤对电子）孤对电子）neO生色团生色团：NN，NO，OC=S,N （共轭双键）
22、共轭双键）e40显色反应的选择显色反应的选择灵敏度高灵敏度高，一般，一般 104;选择性好选择性好;显色剂在测定波长处无明显吸收显色剂在测定波长处无明显吸收, 对照性好对照性好, max 60 nm;反应生成的有色化合物反应生成的有色化合物组成恒定，稳定组成恒定，稳定;显色条件易于控制，显色条件易于控制，重现性好重现性好.41酸度的选择酸度的选择酸度的影响酸度的影响副反应副反应M + nR = MRnOH-H+存在型体的变化存在型体的变化RH = R- + H+ 1 2生成不同配比的络合物生成不同配比的络合物例，磺基水杨酸例，磺基水杨酸 Fe3+pH = 2-3FeR紫红色紫红色pH = 4-
23、7FeR2橙色橙色pH = 8-10FeR3黄色黄色42酸度的选择酸度的选择理论计算理论计算M + nR = MRnOH-H+例：邻二氮菲例：邻二氮菲-亚铁反应完全度与亚铁反应完全度与pH的关系的关系 cRR =10-4molL-143以以作图，作图， 可得可得适宜适宜pH范围范围实际工作，作实际工作，作 A pH 曲线，曲线，寻找适宜寻找适宜 pH 范围。范围。ApHpH3-844显色剂的用量显色剂的用量M + nR = MRn定量反应定量反应理论计算理论计算45c(R)c(R)c(R)实际工作，作实际工作，作 A-CR 曲线，寻找适宜曲线，寻找适宜 CR 范围。范围。46温度的选择温度的选
24、择实际工作，作实际工作，作 A-T 曲线，寻找适宜反应温度。曲线，寻找适宜反应温度。ATATATATAT反应时间的选择反应时间的选择实际工作，作实际工作，作 A-t 曲线，曲线，寻找适宜反应时间。寻找适宜反应时间。47测定中的干扰以及消除方法测定中的干扰以及消除方法Co2+, Fe3+Co2+FeF63-Co(SCN)2 (蓝蓝)NaFSCN-Co2+Fe2+,Sn4+(2)Sn2+Co(SCN)2SCN-测测Co2+: (掩蔽法掩蔽法)化学法化学法48 5-5 吸光光度法应用示例吸光光度法应用示例单组分的测定；单组分的测定；多组分的测定；多组分的测定；紫外光度法在生物学中的应用；紫外光度法在
25、生物学中的应用；49纯物质或共存物质不干扰纯物质或共存物质不干扰单组分的测定单组分的测定1. 金属离子金属离子: Ni-丁二酮肟丁二酮肟, Co-钴试剂钴试剂2. 磷的测定磷的测定: DNA中含中含P9.2%, RNA中含中含P9.5%, H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3=(NH4)3PO412MoO3+12NH4NO3+12H2O磷钼黄磷钼黄(小小)磷钼磷钼(V)蓝蓝(大大)Sn2+50 x 1, y 1, x 2, y 2由由x,y标液标液 在在 1, 2处分别测得处分别测得.a)在在 1处测组分处测组分x, 在 2处测组分处测组分y.b) 在在 1处测组分处测组分x; 在在 2处测总吸处测总吸收收,扣除扣除x吸收吸收,可求可求y.c) x,y组分不能直接测定组分不能直接测定多多组分的测定组分的测定51吸光光度法在生物学中的应用吸光光度法在生物学中的应用蛋白质含量测定（氨基酸测定）蛋白质含量测定（氨基酸测定）核酸测定核酸测定酶及微生物代谢研究酶及微生物代谢研究52
