荧光标记蛋白的发展

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1、荧光标记蛋白的发展荧光标记蛋白技术实际上是也是一种标记技术。就如同最早用P标记脱氧核糖核酸用S标记蛋白质是一样。左图所示为验证DNA和蛋白质谁是遗传物质的实验荧荧光光标标记记蛋蛋白白在在生生物物研研究究反反面面的的作作用用：荧荧光光标标记记蛋蛋白白的的基基因因可可作作为为报报告告基基因因，提提供供细细胞胞内内物物质质的的跟跟踪踪定定位位 如图所示为肽链的形成过程肽链经过弯曲、折叠、多条肽链的重叠等形成蛋白质。所以，如若一开始便把荧光标记蛋白的基因插入到某一特定基因内，则新的基因会合成荧光融合蛋白如左图所示，当体内物质融合了荧光蛋白后会发出荧光，用显微镜、荧光计、荧光激活细胞分选仪等就可以看见，

2、若在靠近体表处且光源强烈则肉眼可视。例如，要研究细胞内某蛋白质的游走状态，则用荧光蛋白标记后，其所处位置清晰可见。 最早为水母体中提取的GFP在适当刺激下会改变结构从而发出或改变荧光的第二类荧光蛋白FHP及其典例GPAC 最新的PRIME技术技术变革技术变革GFP1，GFP的发现发现GFP是从一种生活在北太平洋寒冷水域的水母体内发现的。这种水母体内含有一种生物发光蛋白质aequorin，它本身发蓝光。GFP能把这种光转变成绿色，也就是当水母容光焕发的时候我们实际看到的颜色。受到Ca2+或紫外线激活时, 水母中的发光蛋白Aequorin 被激活, 产生蓝光, GFP 能够吸收蓝光( 395nm

3、处有最大光吸收) , 发射绿色( 或黄绿色) 荧光 2，GFP发光原理发光原理GFP控制光的部位是其自身的一部分，仅由氨基酸构建而成，该部位含有一段三个氨基酸组成的特殊序列：丝氨酸酪氨酸甘氨酸（有时丝氨酸会被相似的苏氨酸取代）。当蛋白质链折叠时，这段短片段就被深埋在蛋白质内部，然后，发生一系列化学反应：甘氨酸与丝氨酸之间形成化学键，生成一个新的闭合环，随后这个环会自动脱水。最终，经过大约一个小时的反应，周围环境中的的氧气攻击酪氨酸的一个化学键，形成一个新的双键并合成荧光发色团。蛋白质链形成一个圆柱形罐头（蓝色），子链的一部分直接从中间穿过（绿色），发色团刚好在罐头盒的中间，它被保护起来以免受周

4、围环境的影响。这种保护对于发射荧光是必需的。 3，与其他报告基因不同的性质性质从生化角度来讲, 所有已知的荧光素酶都是氧化酶, 它利用分子氧来氧化底物, 使产物分子处于一种激发态而发光。这种酶/底物的相互作用是生物发光的普遍模式。而GFP 是第一个例外, 它的27kDa 的单体由238 个氨基酸构成, 本身就是一个生物发光系统。其荧光机制是自身含有的, 绿色荧光的发射仅需分子氧的存在, 而无需其他外源辅因子无需其他外源辅因子GFP 的表达无种属特异性无种属特异性。不管细胞的种类和位置如何, 都能够自主表达; GFP 还能克服穿透、毒素、光漂白等不利因素1。GFP 的荧光可以耐受福尔马林的固定,

5、 因而可以制成长期保存的标本; 对细胞内GFP 的检测非常简单检测非常简单, 用显微镜、荧光计、荧光激活细胞分选仪等就可实现4，GFP目前存在的不足不足( 1) 检测灵敏度还有待提高, 而且其荧光信号强度方面的非线性性质使得定量非常困难。( 2) 新生GFP 折叠和加工折叠和加工成为具有荧光活性形式的过程十分缓慢过程十分缓慢, 使得某些快速过程如转录的激活过程还难以用该方法进行研究。( 3) 紫外激发对某些GFP 有光漂白和光破坏作用, 导致荧光信号快速丧失。( 4) 多数生物具有微弱的自发荧光现象, 并有着类似的激发和发射波长, 这些荧光背景会影响某些GFP 的检测。 FHP（fluores

6、cent highlighter proteins光激活蛋白即第二类荧光蛋白）及GPAC （Green photoactivatable Cherry光激活绿樱桃） 1，第二类荧光蛋白，FHP特点特点这些荧光蛋白在适当的刺激下会经历结构的改变，从而打开荧光这个开关，或者荧光发射波长改变。与第一代荧光蛋白相比，它们的优势在于能脉冲标记细胞或分子亚群，从而实现复杂的动力学时空分析动力学时空分析典例：PAGFP，mRFP1，KFP1，Dronpa等缺点缺点：其中一些蛋白光转换效率不高，亮度较低，会迅速淬灭，或者需要多聚化。此外，光转换通常伴随着第一种颜色的丧失，这样不得不借助计算机方法来查看整个群体

7、。2,GPAC构成：构成：这是一个融合蛋白，它融合了红色荧光蛋白（RFP）单体Cherry和GFP的光激活变异体。这种融合蛋白能够在表达标志物的细胞中持续发出红色荧光，而绿色荧光只有在405-nm光激发下才会发出。特点特点：表达GPAC的细胞在光激活前后都表现出强的红色信号，而绿色荧光只持续数小时。将某一特定蛋白放置在GPAC的N端或C端，均不影响其活性，也不会显著影响胞内蛋白的定位或功能。即便融合伴侣需要大量的翻译后加工和修饰，GPAC仍可容忍。不足不足：荧光标签相对较大，超过了50 kDa，这样，与GPAC融合的蛋白在用于功能研究前就必须进行仔细的验证其杰出性杰出性体现在：在时空动力学监测

8、中突出了光转换的部分。PRIME技术技术开发此技术的原因原因：无论是GPAC还是GFP，他们都有一个缺点，蛋白过大。一旦荧光探针过大，它们就有可能干扰蛋白的正常功能，或妨碍它们到达目的地。如：238个氨基酸的GFP干扰了一些蛋白的功能，比如肌动蛋白actin。此蛋白参与了细胞分裂、运动及通讯。然而研究人员发现，与GFP的融合对肌动蛋白的功能和运输有着不利影响。概述概述：PRIME技术使用一种比GFP小得多的蓝色荧光探针。与GFP不同的是，新探针一开始并不与目的蛋白相连。它是在后来通过一种全新的酶而附在蛋白上。这种全新的酶被称为荧光基团连接酶。原原理理：原理原理：在导入目的基因的同时也将编码这种酶的基因导入细胞。还在目的基因上加上了一个短的标签（13个氨基酸），此标签让连接酶识别蛋白随后，目的蛋白质与荧光基团蛋白质同时产生当7-香豆素这种蓝色荧光探针进入细胞后，连接酶将它与目的蛋白上的短标签相连。这便使融合荧光蛋白发出可见荧光 优点优点：使用这种方法后，标有荧光探针的肌动蛋白能在细胞中自由游走，并穿过细胞核。此方法能应用于细胞内特定区域的蛋白，比如细胞核、细胞膜或细胞溶质。在连接酶上加入一段信号肽，指导它到达特定区域。之后，酶将荧光探针与此区域的蛋白相连。