《核酸检测培训》由会员分享，可在线阅读，更多相关《核酸检测培训（38页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、主要内容主要内容 为什么要做核酸检测？为什么要做核酸检测？ 核酸是什么？核酸是什么？ 怎样进行核酸检测？怎样进行核酸检测？ 市场状况市场状况为什么要做核酸检测？为什么要做核酸检测？ 核酸检测（基因检测） 现知人类的疾病都与基因有直接或间接的关系。医学实验室所要检测和分析的核酸既包括人体本身的基因(DNA ) 以及反映基因转录水平的mRNA , 也包括侵入人体的致病微生物等所携带的外源性基因(DNA/RNA )。 传统检测试剂（酶免传统检测试剂（酶免ELISAELISA）技术特点技术特点技术特点技术特点： 检测目标为蛋白检测目标为蛋白检测目标为蛋白检测目标为蛋白, , , , 所检测的主要是疾病
2、所引所检测的主要是疾病所引所检测的主要是疾病所引所检测的主要是疾病所引发的人体抗体而不是病原体本身发的人体抗体而不是病原体本身发的人体抗体而不是病原体本身发的人体抗体而不是病原体本身, , , ,是一种间接、滞是一种间接、滞是一种间接、滞是一种间接、滞后的检测方式。易操作，成本低。后的检测方式。易操作，成本低。后的检测方式。易操作，成本低。后的检测方式。易操作，成本低。 固有不足固有不足固有不足固有不足： 不能够消除对不能够消除对不能够消除对不能够消除对“窗口期窗口期窗口期窗口期”标本标本标本标本( ( ( (抗体阴性抗体阴性抗体阴性抗体阴性, , , ,核核核核酸阳性酸阳性酸阳性酸阳性) )
3、 ) )的漏检的漏检的漏检的漏检 难于检测病原体的不同亚型及突变型难于检测病原体的不同亚型及突变型难于检测病原体的不同亚型及突变型难于检测病原体的不同亚型及突变型 不典型血清阳转不典型血清阳转不典型血清阳转不典型血清阳转 对免疫逃避或免疫沉寂的标本产生漏检对免疫逃避或免疫沉寂的标本产生漏检对免疫逃避或免疫沉寂的标本产生漏检对免疫逃避或免疫沉寂的标本产生漏检核酸检测核酸检测显著缩短窗口期显著缩短窗口期:HIV:HIV窗口期缩短窗口期缩短45%45%，HCVHCV缩缩 短短89%89%，HBVHBV缩短缩短50%50%。提提 高高 灵灵 敏敏 度度: :理论上扩增体系中单拷贝的模板理论上扩增体系中
4、单拷贝的模板 也能被检测出。也能被检测出。特特 异异 性性 好好: :使用荧光探针技术的使用荧光探针技术的PCRPCR检测，检测， 几乎没有方法学的假阳性。几乎没有方法学的假阳性。直接揭示病原体的存在直接揭示病原体的存在 对操作者及检测环境的要求较高对操作者及检测环境的要求较高检测成本相对较高检测成本相对较高输血中可传染病原体的“窗口期”病毒种类病毒种类ELISAELISA检测项目检测项目窗口期窗口期HCVHCV抗抗-HCV 2.0/3.0 EIA-HCV 2.0/3.0 EIA 8-108-10周周HIVHIV抗抗-HIV-1/2 EIA and HIV-1 -HIV-1/2 EIA and
5、 HIV-1 抗原抗原 EIAEIA 2-42-4周周HBVHBVHBVsAg EIA and HBVcAg EIAHBVsAg EIA and HBVcAg EIA 6-86-8周周HTLVHTLV抗抗-HTLV I/II EIA-HTLV I/II EIA 8-108-10周周CMVCMV抗抗-CMV EIA-CMV EIA 3-5 3-5 周周窗口期检测率窗口期检测率国家或地区国家或地区HBVHCVHIV加拿大加拿大加拿大加拿大1:1530001:153000(1/151/15万万万万) )1:23000001:2300000(1/2301/230万万万万) )1:78000001:78
6、00000(1/7801/780万万万万) )法国法国法国法国1:6400001:640000(1/641/64万万万万) )1:100000001:10000000(1/10001/1000万万万万) )1:31500001:3150000(1/3151/315万万万万) )德国德国德国德国1:2300001:230000(1/231/23万万万万) )1:6700001:670000(1/671/67万万万万) )1:27700001:2770000(1/2771/277万万万万) )日本日本日本日本（5050混）混）混）混）1:519881:51988(1/5.21/5.2万万万万) )
7、1:3480911:348091(1/351/35万万万万) )1:26686961:2668696(1/2671/267万万万万) )美国美国美国美国（2424混）混）混）混）1:1800001:180000(1/181/18万万万万) )1:2300001:230000(1/231/23万万万万) )1 12 2:3:371640547164054(1/309(1/309万万万万) )香港香港香港香港1:327861:32786(1/3.31/3.3万万万万) )1:54561:5456(1/0.51/0.5万万万万) )1:2221:222(1/0.021/0.02万万万万) )核酸检测
8、在临床诊断中的应用定性诊断 血液筛查血液筛查 病原体筛查诊断病原体筛查诊断 SNPSNP和耐药突变诊断和耐药突变诊断 基因型分型基因型分型 遗传病诊断遗传病诊断 个体用药诊断个体用药诊断 基因鉴定和配型基因鉴定和配型 定量检测 病情的评估和预后判断病情的评估和预后判断 抗病毒药物疗效的观察抗病毒药物疗效的观察 新药验证新药验证 癌基因表达差异癌基因表达差异 核核 酸酸 是是 什什 么？么？ 核酸核酸（Nucleic Acid）是一种主要位于细胞核内的生物大分子，其充当着生物体遗传遗传信息信息的携带和传递。核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内。 现已发现近2000种遗传性疾病都和DNA结构
9、有关。肿瘤的发生、病毒的感染、射线对机体的作用等都与核酸有关。 核酸分类：DNA、RNA；l lDNADNA：dATPdATP（A A）、）、dTTPdTTP（T T）、）、 dCTPdCTP（C C）、）、dGTPdGTP（GG）；）；l lRNARNA：ATPATP、UTPUTP、CTPCTP、GTPGTP；l l3355磷酸键磷酸键DNA结构结构单链DNA形成双链的原则 碱基互补配对： G-C T-A外部为磷酸和戊糖形成外部为磷酸和戊糖形成的骨架的骨架内部为碱基互补形成的内部为碱基互补形成的共价结合区域共价结合区域螺旋结构螺旋结构核酸在体内的复制核酸在体内的复制DNADNA的热变性的热变
10、性DNA受热，会解开双链互补状态，形成单链；降温会恢复双链状态怎样进行核酸检测？怎样进行核酸检测？核酸检测的一般流程核酸检测的一般流程核酸样品的制备： 从血液、体液、组织中提取或PCR扩增样品的检测： 核酸杂交、PCR、荧光定量PCR、PCR-ELISA等 结果判读： 电泳、膜、荧光定量PCR仪等核 酸 杂 交 核酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。其原理是核酸变性和复性理论。即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双边结构。杂交通常在一支持膜上进行，因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为DNA印迹交（Souther
11、n blot hybridization ）和RNA印迹杂交（Northern blot hybridization）。核酸提取核酸提取PCR扩增扩增探针点膜探针点膜交联交联杂交杂交显色显色结果判读结果判读PCR聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。DNA的复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成
12、为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 PCR的产生实时荧光实时荧光PCR 在在PCRPCR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团荧光基团，利用，利用荧光信号累积实现了荧光信号累积实现了实时监测实时监测整个整个PCRPCR进程，进程，对对起始模板起始模板进行分析的方法进行分析的方法, ,可以进行定量和定可以进行定量和定性检测。性检测。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是 基线（背景）荧光信号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域
13、值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）。 荧光定量PCR标记方法内掺式染料内掺式染料SYBR Green ISYBR Green I序列特异性探针序列特异性探针Taqman Taqman Molecular BeaconsMolecular Beacons Dual Probes(Dual Probes(FRET)FRET)引物特异性探针引物特异性探针 Amplifluor (Intergen) Amplifluor (Intergen)SYBRGREEN 双探针杂交分子信标 Taqman 引物特异探针 性质 可逆荧光 积累荧光 熔点分析 能不能特异性 引物（
14、非特异性扩增或引物二聚体有影响） 引物2探针 引物探针 引物探针 引物（非特异性扩增或引物二聚体有影响） 探针无有有有无通用性通用专用专用专用专用探针特点SYBR Green 融解曲线分析SYBR Green法优缺点优点:对DNA模板没有选择性适用于任何DNA使用方便-不必设计复杂探针非常灵敏便宜TaqMan探针法TaqMan法优缺点市市 场场 状状 况况生产厂家生产厂家检测项目检测项目使用技术使用仪器达安基因达安基因HBV、HIV、HCV、HPV 、TB、HCMV、淋球菌、解脲脲原体、肺炎支原体、沙眼衣原体、单纯疱疹病毒型、地中海贫血、缺失型-地中海贫血、淋球菌、血筛试剂PCR荧光探针法PC
15、R-反向点杂交法荧光定量PCR仪PCR仪上海科华上海科华HBV、HCV、新型冠状病毒、血筛试剂PCR荧光探针法PCR-酶免荧光定量PCR仪酶免相关仪器匹基匹基HBV、HIV、HPV、TB、HCV、沙眼衣原体、新型冠状病毒PCR荧光探针法荧光定量PCR仪上海华美上海华美HBV、HCV、TB、沙眼衣原体、新型冠状病毒PCR荧光探针法荧光定量PCR仪上海克隆上海克隆HBV、TB、HPVPCR荧光探针法荧光定量PCR仪凯普、港龙以HPV检测为主。浩源血筛试剂已进入审批阶段。罗氏、生物梅里埃公司有HIV检测试剂盒，均以各自公司的专利技术为主研发。现状和趋势1 1、现状：公司多、竞争激烈、同质化；手工操、
16、现状：公司多、竞争激烈、同质化；手工操作为主；缺乏规范；核心技术少；作为主；缺乏规范；核心技术少；2 2、趋势：管理部门逐渐加强管理，相关标准制、趋势：管理部门逐渐加强管理，相关标准制订中；进口试剂以全自动诊断平台为主在国内订中；进口试剂以全自动诊断平台为主在国内推广，国内厂家渐进推出自动化核酸提取仪器推广，国内厂家渐进推出自动化核酸提取仪器进入市场；进入市场；实时荧光PCR检测的难点1 1、大规模适合自动化核酸提取的样品制备技术、大规模适合自动化核酸提取的样品制备技术2 2、适合筛查应用的多重、适合筛查应用的多重PCRPCR技术技术3 3、高通量全自动的核酸提取设备和耗材、高通量全自动的核酸提取设备和耗材4 4、高通量检测设备和配套耗材的成本控制、高通量检测设备和配套耗材的成本控制5 5、质量控制和质量管理方法、质量控制和质量管理方法6 6、核心原料的成本控制、核心原料的成本控制试剂质量控制方法1、实验室分类和功能化2、人员培训和自我约束3、建立切实可行的质量控制方法 和管理体系
