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1、微生物学实验基本操作与培训一、无菌操作一、无菌操作 1、无菌概念: 什么地方是有菌的,什么地方是无菌的; 哪些地方要求基本无菌,哪些地方严格要求无菌。 2、操作环境: 实验室;接种箱;超净工作台;无菌工作室。 3、工作范围: 接种、转管、倒平板、梯度稀释、涂平板、平板划线、菌体(菌悬液)转移及其他需要无菌操作的实验环节。一、无菌操作一、无菌操作 4、要领及注意事项: (以实验室接种、转管为例)(1)斜面、接种环拿法;(2)火焰保护;(3)接种环灭菌;(4)接种环冷却及轻快接触斜面;(5)棉塞的制作及处理。二、染色、制片二、染色、制片 1、类型:分装片和涂片; 2、操作步骤:(以涂片为例) 1)
2、 涂片:载玻片-滴加生理盐水-挑菌涂成 薄膜; 2)干燥:室温自然干燥: 3)固定:菌面向上,火焰上过2-3次: 4)染色:滴加染色液(美蓝),覆盖(2-3分 钟); 5)水洗:自来水冲洗,至基本无色,晾干; 6)镜检:调节光源,低倍镜观察,高倍镜观察, 油镜观察。二、染色、制片二、染色、制片4、要领及注意事项: (1)生理盐水和菌体一定不能过多; (2)菌膜不能过厚,最好细胞分布疏密相间; (3)固定要到位,不能残留水,也不能固定过度; (4)染色时间正确,一定要按规定计时; (5)水洗时,水流不宜过急; (6)镜检前片子一定要干燥无水。三、油镜头的使用三、油镜头的使用 1工作范围: 观察细
3、菌及相近大小的微生物,真核微生物的细胞器。2、使用特点: 一定要用油;操作要求较高。三、油镜头的使用三、油镜头的使用3、要领及注意事项: (1)所用装片、涂片上一定不能有水; (2)先用低、高倍镜观察并选好视野,并将待 观察目标调至视野正中心; (3)注意保护镜头和片子,从侧面观察镜头进 入油系; (4)油镜头观察时,用微调调焦距,始终按 镜、片分离方向用微调调焦距; (5)调焦距速度一定要慢,避免焦躁,因为图象 出现的焦距范围很小; (6)注意光线的强弱; (7)用擦镜纸蘸取溶剂(二甲苯)擦净镜头和装 片。四、革兰氏染色四、革兰氏染色 1工作范围: 细菌学中最重要的鉴别染色法之一,也可用于其
4、他微生物的鉴别中。 一般的微生物形态观察不必用革兰氏染色。2、基本步骤: 1)初染:结晶紫染色; 2)媒染:碘液媒染; 3)脱色:乙醇脱色; 4)复染:番红复染;四、革兰氏染色四、革兰氏染色 3、要领及注意事项: 1)菌种的菌龄,要选择生长旺盛期的典型菌体; 2)制片,按单染色的基本要求操作; 3)乙醇脱色时间是本实验成功与否的关键,注意 衬以白背景,用95%乙醇滴洗至刚刚刚刚无紫色为 止,约2030秒,立即立即用水冲净乙醇; 4)观察时,以分散开的细菌颜色为准。 5)对未知菌进行革兰氏染色时,应选择两株形态 不同、染色结果不同的已知菌和未知菌一起混合 制片、染色。五细菌、放线菌、酵母菌和霉菌
5、五细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的菌体形态的差别的菌体形态的差别 (1)细菌、放线菌是原核生物,酵母菌和霉)细菌、放线菌是原核生物,酵母菌和霉 菌是真核生物,大小不同;菌是真核生物,大小不同;(2)放线菌和霉菌是丝状菌,细菌和酵母菌)放线菌和霉菌是丝状菌,细菌和酵母菌 是非丝状菌;是非丝状菌;(3)霉菌有孢子柄、子实体等特化形态,放)霉菌有孢子柄、子实体等特化形态,放 线菌没有。线菌没有。(4)一定要注意提问,不要理解为菌落形)一定要注意提问,不要理解为菌落形 态。态。六、用血球计数板计数微生物的数量六、用血球计数板计数微生物的数量 1工作范围: 此法计得的是死、活菌的总数,故称总菌计数法。2、基
6、本步骤: 1)稀释:将酵母菌悬液进行适当稀释,菌液不浓,可不必 稀释。 2)镜检计数室:在计数前,先对计数板的计数室进行镜 检。若有污物,则进行清洗。 3)加样品:盖上盖玻片,用毛细管将菌液由盖玻片边缘滴 一小滴,让其自行渗进计数室。不可有气泡。 4)显微镜计数:五分钟后,先低倍镜找计数室,后高倍镜 计数。一般以每小格510个菌体为宜。常选四角 和中央五个中格计数。格线上菌体只数上线和左 边线。芽大于母体一半方计。同法计另一室。5)清洗血球计数板:自来水冲洗,切勿用硬物洗刷,自行 晾干。镜检,洗净为止。六、用血球计数板计数微生物的数量六、用血球计数板计数微生物的数量3、要领及注意事项:(1)计
7、数结果是微生物总数,含死、活菌;(2)菌悬液要摇匀;(3)计数格数和分布要合理;(4)对压线、出芽等情况处理;(5)菌悬液稀释要适当,不要过浓或过稀;(6)光线要适中(尤其不要太强),否则找不到计 数室;(7)要先低倍镜,后高倍镜。七、七、 微生物大小的测定微生物大小的测定 1工作范围: 原核微生物的测定一般要用油镜头; 真核微生物的测定一般用高倍镜即可; 测微尺多用来测定细菌和酵母菌,放线菌和霉菌较少。2、操作步骤 1)目镜测微尺的标定 (1)放置目镜测微尺:测微尺刻度朝下; (2)放置镜台测微尺:测微尺刻度朝上; (3)校正目镜测微尺:按低、高、油顺序,使两种测微尺某一区间的 两对刻度线完
8、全重合,按下式计算: 两对重合线间镜台测微尺格数10目镜测微尺每小格长度(um)= 两对重合线间目镜测微尺格数 2)菌体大小的测定:换上装片,测出菌体长宽格数,算出菌体大小。 3)取出目镜测微尺,将两种测微尺用擦镜纸擦净,入盒。七、七、 微生物大小的测定微生物大小的测定 3、要领及注意事项:(1)镜台测微尺刻度务必朝上;(2)目镜测微尺刻度朝下,放于目镜与镜头之间;(3)按低、高、油顺序校正目镜测微尺;(4)两对刻度线要整格完全重合;(5)镜台测微尺线条太粗时,可与线条的同边对齐。(6)测细菌等原核微生物时,用油镜头要严格按油镜头的 使用要求操作,要特别注意光线的强弱。(7)对不到一格的数值的
9、判断一定要尽量准确,不能马 虎;(8)对各类微生物的大小要心中有数,如计算的结果与理 论值差距很大,要验算。八、斜面、平板、摇瓶的制作八、斜面、平板、摇瓶的制作 1工作范围: 斜面:培养和保存菌种; 平板:微生物分离、纯化和活菌计数; 摇瓶:微生物液体培养,模拟发酵罐。2、操作步骤: 1)按培养基配方称量各种药品、试剂; 2)斜面和平板按要求称量琼脂,摇瓶不用琼脂; 3)溶化:加入少于所需要的水量,用玻棒搅匀,在电 热套上加热使其溶解。加入琼脂,加热,搅拌溶化, 补充水分至所需的总体积; 4)调pH:测pH值,用滴管向培养基中加入NaOH或 HCl,边调边测,直至要求的pH范围; 八、斜面、平
10、板、摇瓶的制作八、斜面、平板、摇瓶的制作5)分装:将配制的培养基分装入试管和三角烧瓶(250ml) 内,试管装1/4。6)加塞:在管(瓶)口塞上棉塞,既保证通气又可阻止外 界微生物进入造成污染: 摇瓶用八层纱布盖口;7)包扎8)灭菌9)搁置斜面:趁热将试管棉塞端搁在玻棒上,使斜 面长度不超过试管长度的一半; 倒平板:用无菌操作的方法将三角烧瓶中的培养基趁热 倒入培养皿中,6-7个/100 ml;10)无菌检查:将斜面37恒温培养2448小时,以检查 灭菌是否彻底。八、斜面、平板、摇瓶的制作八、斜面、平板、摇瓶的制作3、要领及注意事项: 1)各种药品、试剂的称量要注意精确性; 2)微生物培养用培
11、养基一般用自来水配制; 3)斜面的琼脂溶化要彻底; 4)调pH(除“自然”外)千万不要省略; 5)分装培养基应用培养基分装器(移液管、玻璃 漏斗)分装,不要使培养基沾在管(瓶)口上; 6)倒平板时,注意避免烧、烫手。九、灭菌九、灭菌1、操作步骤: 1) 通电,打开开关,观察指示灯,视状态添加 水; 2) 放置灭菌物品; 3) 设定温度、时间(121,20 min),通电加 热; 4) 完全排净冷空气,关上排气阀; 5) 灭菌结束后,切断电源,使锅内温度自然降至 压力为0,打开排气阀 6) 取出灭完菌的培养基、物品,自然冷却,排尽 水。九、灭菌九、灭菌2、要领及注意事项: 1)一定要检查水位;
12、2)温度和时间设置方法按说明书要求操作; 3)排净冷空气是关键,要理解原理; 4)应开盖蒸发一定时间后再取出灭完菌的培 养基、物品; 5)大胆、细心,注意安全。十、包扎十、包扎 1、试管:若干试管一捆,棉塞外包一层牛皮 纸;2、三角烧瓶:棉塞外包一层牛皮纸,以防冷 凝水润湿棉塞,用绳子扎好;3、移液管:上口塞棉花,报纸包扎;4、培养皿:6-7套一组,报纸包扎;5、棉塞:最好非脱脂棉制作;6、注明日期、姓名。实验操作考试实验操作考试1、细菌单染色制片;2、用油镜观察细菌装片;3、血球计数板的使用;4、测定装片中酵母菌的大小;5、从斜面中取菌种接种到平板上;6、取菌悬液涂平板;7、斜面转接保藏菌种;8、用三角瓶制备1瓶无菌水;9、制1支1 ml无菌吸管。 谢谢