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1、微生物学实验基本操作与培训一、无菌操作一、无菌操作 1、无菌概念： 什么地方是有菌的，什么地方是无菌的； 哪些地方要求基本无菌，哪些地方严格要求无菌。 2、操作环境： 实验室；接种箱；超净工作台；无菌工作室。 3、工作范围： 接种、转管、倒平板、梯度稀释、涂平板、平板划线、菌体(菌悬液)转移及其他需要无菌操作的实验环节。一、无菌操作一、无菌操作 4、要领及注意事项： （以实验室接种、转管为例）（1）斜面、接种环拿法；（2）火焰保护；（3）接种环灭菌；（4）接种环冷却及轻快接触斜面；（5）棉塞的制作及处理。二、染色、制片二、染色、制片 1、类型：分装片和涂片； 2、操作步骤：（以涂片为例） 1）
2、 涂片：载玻片-滴加生理盐水-挑菌涂成 薄膜； 2）干燥：室温自然干燥： 3）固定：菌面向上，火焰上过2-3次： 4）染色：滴加染色液（美蓝）,覆盖（2-3分 钟）； 5）水洗：自来水冲洗，至基本无色，晾干； 6）镜检：调节光源，低倍镜观察，高倍镜观察， 油镜观察。二、染色、制片二、染色、制片4、要领及注意事项： （1）生理盐水和菌体一定不能过多； （2）菌膜不能过厚，最好细胞分布疏密相间； （3）固定要到位，不能残留水，也不能固定过度； （4）染色时间正确，一定要按规定计时； （5）水洗时，水流不宜过急； （6）镜检前片子一定要干燥无水。三、油镜头的使用三、油镜头的使用 1工作范围： 观察细
3、菌及相近大小的微生物，真核微生物的细胞器。2、使用特点： 一定要用油；操作要求较高。三、油镜头的使用三、油镜头的使用3、要领及注意事项： （1）所用装片、涂片上一定不能有水； （2）先用低、高倍镜观察并选好视野，并将待 观察目标调至视野正中心； （3）注意保护镜头和片子，从侧面观察镜头进 入油系； （4）油镜头观察时，用微调调焦距，始终按 镜、片分离方向用微调调焦距； （5）调焦距速度一定要慢，避免焦躁,因为图象 出现的焦距范围很小； （6）注意光线的强弱； （7）用擦镜纸蘸取溶剂（二甲苯）擦净镜头和装 片。四、革兰氏染色四、革兰氏染色 1工作范围： 细菌学中最重要的鉴别染色法之一，也可用于其
4、他微生物的鉴别中。 一般的微生物形态观察不必用革兰氏染色。2、基本步骤： 1）初染：结晶紫染色； 2）媒染：碘液媒染； 3）脱色：乙醇脱色； 4）复染：番红复染;四、革兰氏染色四、革兰氏染色 3、要领及注意事项： 1）菌种的菌龄，要选择生长旺盛期的典型菌体； 2）制片，按单染色的基本要求操作； 3）乙醇脱色时间是本实验成功与否的关键，注意 衬以白背景，用95%乙醇滴洗至刚刚刚刚无紫色为 止，约2030秒，立即立即用水冲净乙醇； 4）观察时，以分散开的细菌颜色为准。 5）对未知菌进行革兰氏染色时，应选择两株形态 不同、染色结果不同的已知菌和未知菌一起混合 制片、染色。五细菌、放线菌、酵母菌和霉菌
5、五细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的菌体形态的差别的菌体形态的差别 （1）细菌、放线菌是原核生物，酵母菌和霉）细菌、放线菌是原核生物，酵母菌和霉 菌是真核生物，大小不同；菌是真核生物，大小不同；（2）放线菌和霉菌是丝状菌，细菌和酵母菌）放线菌和霉菌是丝状菌，细菌和酵母菌 是非丝状菌；是非丝状菌；（3）霉菌有孢子柄、子实体等特化形态，放）霉菌有孢子柄、子实体等特化形态，放 线菌没有。线菌没有。（4）一定要注意提问，不要理解为菌落形）一定要注意提问，不要理解为菌落形 态。态。六、用血球计数板计数微生物的数量六、用血球计数板计数微生物的数量 1工作范围： 此法计得的是死、活菌的总数，故称总菌计数法。2、基
6、本步骤： 1）稀释：将酵母菌悬液进行适当稀释，菌液不浓，可不必 稀释。 2）镜检计数室：在计数前，先对计数板的计数室进行镜 检。若有污物，则进行清洗。 3）加样品：盖上盖玻片，用毛细管将菌液由盖玻片边缘滴 一小滴，让其自行渗进计数室。不可有气泡。 4）显微镜计数：五分钟后，先低倍镜找计数室，后高倍镜 计数。一般以每小格510个菌体为宜。常选四角 和中央五个中格计数。格线上菌体只数上线和左 边线。芽大于母体一半方计。同法计另一室。5）清洗血球计数板：自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，自行 晾干。镜检，洗净为止。六、用血球计数板计数微生物的数量六、用血球计数板计数微生物的数量3、要领及注意事项：（1）计
7、数结果是微生物总数，含死、活菌；（2）菌悬液要摇匀；（3）计数格数和分布要合理；（4）对压线、出芽等情况处理；（5）菌悬液稀释要适当，不要过浓或过稀；（6）光线要适中（尤其不要太强），否则找不到计 数室；（7）要先低倍镜，后高倍镜。七、七、 微生物大小的测定微生物大小的测定 1工作范围： 原核微生物的测定一般要用油镜头； 真核微生物的测定一般用高倍镜即可； 测微尺多用来测定细菌和酵母菌，放线菌和霉菌较少。2、操作步骤 1）目镜测微尺的标定 (1)放置目镜测微尺：测微尺刻度朝下； (2)放置镜台测微尺：测微尺刻度朝上； (3)校正目镜测微尺：按低、高、油顺序，使两种测微尺某一区间的 两对刻度线完
8、全重合，按下式计算： 两对重合线间镜台测微尺格数10目镜测微尺每小格长度（um）= 两对重合线间目镜测微尺格数 2）菌体大小的测定：换上装片，测出菌体长宽格数，算出菌体大小。 3）取出目镜测微尺，将两种测微尺用擦镜纸擦净，入盒。七、七、 微生物大小的测定微生物大小的测定 3、要领及注意事项：（1）镜台测微尺刻度务必朝上；（2）目镜测微尺刻度朝下，放于目镜与镜头之间；（3）按低、高、油顺序校正目镜测微尺；（4）两对刻度线要整格完全重合；（5）镜台测微尺线条太粗时，可与线条的同边对齐。（6）测细菌等原核微生物时，用油镜头要严格按油镜头的 使用要求操作，要特别注意光线的强弱。（7）对不到一格的数值的
9、判断一定要尽量准确，不能马 虎；（8）对各类微生物的大小要心中有数，如计算的结果与理 论值差距很大，要验算。八、斜面、平板、摇瓶的制作八、斜面、平板、摇瓶的制作 1工作范围： 斜面：培养和保存菌种； 平板：微生物分离、纯化和活菌计数； 摇瓶：微生物液体培养，模拟发酵罐。2、操作步骤： 1）按培养基配方称量各种药品、试剂； 2）斜面和平板按要求称量琼脂，摇瓶不用琼脂； 3）溶化：加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，在电 热套上加热使其溶解。加入琼脂，加热，搅拌溶化， 补充水分至所需的总体积； 4）调pH：测pH值，用滴管向培养基中加入NaOH或 HCl,边调边测，直至要求的pH范围； 八、斜面、平
10、板、摇瓶的制作八、斜面、平板、摇瓶的制作5）分装：将配制的培养基分装入试管和三角烧瓶（250ml） 内，试管装1/4。6）加塞：在管（瓶）口塞上棉塞，既保证通气又可阻止外 界微生物进入造成污染： 摇瓶用八层纱布盖口；7）包扎8）灭菌9）搁置斜面：趁热将试管棉塞端搁在玻棒上，使斜 面长度不超过试管长度的一半； 倒平板：用无菌操作的方法将三角烧瓶中的培养基趁热 倒入培养皿中，6-7个/100 ml；10）无菌检查：将斜面37恒温培养2448小时，以检查 灭菌是否彻底。八、斜面、平板、摇瓶的制作八、斜面、平板、摇瓶的制作3、要领及注意事项： 1）各种药品、试剂的称量要注意精确性； 2）微生物培养用培
11、养基一般用自来水配制； 3）斜面的琼脂溶化要彻底； 4）调pH（除“自然”外）千万不要省略； 5）分装培养基应用培养基分装器（移液管、玻璃 漏斗）分装，不要使培养基沾在管（瓶）口上； 6）倒平板时，注意避免烧、烫手。九、灭菌九、灭菌1、操作步骤： 1) 通电，打开开关，观察指示灯，视状态添加 水； 2) 放置灭菌物品； 3) 设定温度、时间（121，20 min），通电加 热； 4) 完全排净冷空气，关上排气阀； 5) 灭菌结束后，切断电源，使锅内温度自然降至 压力为0，打开排气阀 6) 取出灭完菌的培养基、物品，自然冷却，排尽 水。九、灭菌九、灭菌2、要领及注意事项： 1）一定要检查水位；
12、2）温度和时间设置方法按说明书要求操作； 3）排净冷空气是关键，要理解原理； 4）应开盖蒸发一定时间后再取出灭完菌的培 养基、物品； 5）大胆、细心，注意安全。十、包扎十、包扎 1、试管：若干试管一捆，棉塞外包一层牛皮 纸；2、三角烧瓶：棉塞外包一层牛皮纸，以防冷 凝水润湿棉塞，用绳子扎好；3、移液管：上口塞棉花，报纸包扎；4、培养皿：6-7套一组，报纸包扎；5、棉塞：最好非脱脂棉制作；6、注明日期、姓名。实验操作考试实验操作考试1、细菌单染色制片；2、用油镜观察细菌装片；3、血球计数板的使用；4、测定装片中酵母菌的大小；5、从斜面中取菌种接种到平板上；6、取菌悬液涂平板；7、斜面转接保藏菌种；8、用三角瓶制备1瓶无菌水；9、制1支1 ml无菌吸管。 谢谢
