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1、第十七章第十七章流式流式细胞胞仪分析技分析技术及及应用用第一第一节 概述概述一、工作原理一、工作原理二、散射光的二、散射光的测定定三、三、荧光光测量量四、四、细胞分胞分选原理原理第二第二节 数据的数据的显示与分析示与分析一、参数一、参数二、数据二、数据显示方式示方式三、三、设门分析技分析技术第三第三节 流式流式细胞胞仪免疫分析的技免疫分析的技术要求要求一、免疫一、免疫检测样品制品制备二、免疫分析中常用的二、免疫分析中常用的荧光染料与光染料与标记染色染色三、免疫胶乳三、免疫胶乳颗粒的粒的应用用四、流式四、流式细胞免疫学技胞免疫学技术的的质量控制量控制第四第四节流式流式细胞胞术在免疫学在免疫学检查
2、中的中的应用用一、淋巴一、淋巴细胞及其胞及其亚群的分析群的分析二、淋巴二、淋巴细胞功能分析胞功能分析三、淋巴造血系三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型分化抗原及白血病免疫分型四、四、肿瘤耐瘤耐药相关蛋白分析相关蛋白分析五、五、AIDS病病检测中的中的应用用六、自身免疫性疾病相关六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析抗原分析七、移植免疫中的七、移植免疫中的应用用思考思考题小小结流式流式细胞胞术(flow cytometry, FCM)是以流式是以流式细胞胞仪为检测手段的一手段的一项能快速、精确的能快速、精确的对单个个细胞理化特性胞理化特性进行多参数定量分析和分行多参数定量分析和分选的新技的新技
3、术。 流式流式细胞胞术最大的特点是能在保持最大的特点是能在保持细胞及胞及细胞器或微粒的胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状构及功能不被破坏的状态下，下，通通过荧光探光探针的的协助，从分子水平上助，从分子水平上获取多种取多种信号信号对细胞胞进行定量分析或行定量分析或纯化分化分选。 细胞不被破坏，胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量量快速、大量、准确、灵敏、定量流式流式细胞胞术的特点的特点流式流式细胞胞仪是是测量染色量染色细胞胞标记物物荧光光强度的度的细胞分析胞分析仪，是在，是在单个个细胞分胞分析和分析和分选基基础上上发展起来的展起来的对细胞的物胞的物理或化学性理或化学性质（如大小、内部（如
4、大小、内部结构、构、DNA、RNA、蛋白、蛋白质、抗原等）、抗原等）进行快行快速速测量并可分量并可分类收集的高技收集的高技术。第一第一节 概述概述细胞组成细胞组成细胞功能细胞功能大小大小细胞表面细胞表面/ /胞浆胞浆/ /核核-特异性抗原特异性抗原粒度粒度细胞活性细胞活性DNA, RNADNA, RNA含量含量胞内细胞因子胞内细胞因子蛋白质含量蛋白质含量激素结合位点激素结合位点钙离子钙离子, PH, PH值值, , 膜电位膜电位 酶活性酶活性流式流式细胞胞仪常常检测的的细胞特性胞特性采用激光作采用激光作为激激发光源，保光源，保证其具有更好的其具有更好的单色性与激色性与激发效率；效率；利用利用荧
5、光染料与光染料与单克隆抗体技克隆抗体技术结合的合的标记技技术，保，保证检测的灵敏度和特异性；的灵敏度和特异性；用用计算机系算机系统对流流动的的单细胞胞悬液中液中单个个细胞的多个参数胞的多个参数信号信号进行数据行数据处理分析，保理分析，保证了了检测速度与速度与统计分析精确分析精确性。性。 一、工作原理一、工作原理 （1） 液流系液流系统（2） 光学系光学系统（3） 数据数据处理系理系统1.流式流式细胞胞仪的基本的基本结构：构：由由样本和鞘液本和鞘液组成成待待测细胞胞单个个细胞的胞的悬液液 荧光染料光染料标记的的单抗抗对其染色其染色受清受清洁气体气体压力力从从样品管品管进入流入流动室形成室形成样本
6、流本流鞘液：鞘液：辅助助样本流被正常本流被正常检测的基的基质液。主要作用是液。主要作用是包裹包裹样本流的周本流的周围，保持，保持样本流中本流中细胞胞处于于喷嘴中心嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。孔。（1）液流系）液流系统喷嘴嘴FluorescencesignalsFocused laserbeam鞘液鞘液液流系液流系统示意示意图FCM的液流系的液流系统（如（如何形成何形成单个个细胞流）胞流）样本管本管鞘液管鞘液管激光光源：气冷式激光光源：气冷式氩离子激光器离子激光器分色反光分色反光镜：反射：反射长/短波短波长，通，通过短短/长波波长光束成形器：两十字交叉放置的透
7、光束成形器：两十字交叉放置的透镜透透镜组：形成平行光，除去室内光：形成平行光，除去室内光滤片：片：长通、短通、通、短通、带通通光光电倍增管：倍增管：FS, SS（散射光），（散射光），FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）光）（2）光学系）光学系统FlowTipLaserSS and FLDetectorFS Detector光学系光学系统示意示意图主要由主要由计算机及其算机及其软件件组成成（3）数据）数据处理系理系统基本工作原理基本工作原理单细胞液柱已标记的单细胞悬液和鞘液硅化管流动室喷嘴荧光检测系统和散射光感受系统收集光信号荧光染料被激发发光光电倍增管脉冲信号计算机系统分析结果放大垂
8、直相交形成稳态水平激光与之基本基本过程程区别区别流式细胞仪流式细胞仪显微镜显微镜光源光源激光激光自然光、灯光自然光、灯光对象对象细胞、生物粒子细胞、生物粒子细胞、组织等细胞、组织等承载工具承载工具鞘液及流动室鞘液及流动室载玻片载玻片检测信号检测信号光学信号光学信号形态及染色形态及染色放大方式放大方式PMTPMT、放大电路、放大电路目镜目镜物镜、光学放大物镜、光学放大统计统计计算机，计算机，50005000人工，人工，200200结果结果多参数，综合分析多参数，综合分析简单，单参数简单，单参数流式流式细胞胞仪与与显微微镜的区的区别 细胞在液柱中与激光束相交胞在液柱中与激光束相交时向周向周围360
9、立体角方向散射的光立体角方向散射的光线信号，它的信号，它的强弱与弱与细胞的大小、形胞的大小、形状、胞内状、胞内颗粒折射等有关，主要分粒折射等有关，主要分为前向散射光前向散射光和侧向散射光向散射光。二、散射光的二、散射光的测定定前向散射光前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射激光束照射细胞胞时，光，光以相以相对轴较小角度小角度(0.510)向前方散射的向前方散射的讯号用于号用于检测细胞胞等粒子的表面属性，信号等粒子的表面属性，信号强弱与弱与细胞体胞体积大小成正比大小成正比。FALS SensorLaser前向散射光示意前向散射光示意图侧向散射光（向散射光（side sc
10、atter, SS）：）：激光束照射激光束照射细胞胞时，光以，光以90角散射的角散射的讯号，用于号，用于检测细胞胞内部内部结构构属性。属性。FALS Sensor90LS SensorLaser侧侧向散射光向散射光示意示意图测得的得的FS与与SS信号通信号通过计算机算机处理，理，可得到可得到FS-SS图，由，由此可此可仅用散射光信号用散射光信号对未染色的活未染色的活细胞胞进行分析或分行分析或分选。此此为血血细胞分胞分类的基本原理，但不能的基本原理，但不能分析表面分子。分析表面分子。淋巴淋巴细胞胞单核核细胞胞中性粒中性粒细胞胞光散射光散射测量最有效用途：量最有效用途：从非均一群体中从非均一群体中
11、鉴别出某些出某些亚群群荧光信号由被光信号由被检细胞上胞上标记的特异性的特异性荧光染料受激光染料受激发后后产生，生，发射的射的荧光波光波长与激与激发光波光波长不同。不同。每种每种荧光染料会光染料会产生特定波生特定波长的的荧光和光和颜色，通色，通过波波长选择通透性通透性滤片，可将不同波片，可将不同波长的散射光和的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光光信号区分开，送入不同的光电倍增管。倍增管。选择不同的不同的单抗及染料就可同抗及染料就可同时测定一个定一个细胞上的胞上的多个不同特征。多个不同特征。线性放大器和性放大器和对数放大器数放大器三、三、荧光光测量量荧光染料的特性光染料的特性激激发波波长(EXC
12、ITING)发射波射波长(EMISSION)荧光光补偿 通通过流式流式细胞胞仪进行行细胞分胞分选主要是在主要是在对具有某种特征的具有某种特征的细胞需胞需进一步培养和研究一步培养和研究时进行的。行的。四、四、细胞分胞分选原理原理细胞胞悬液形成液流柱液形成液流柱流流动室振室振动液流断裂成液滴液流断裂成液滴空白液滴空白液滴含含细胞的液滴胞的液滴弃去弃去偏偏转落入收集器落入收集器压电晶体晶体产生生机械振机械振动不充不充电充充电（一）分（一）分选基本原理基本原理分分选速度：速度：单位位时间内分内分选的的细胞数量。与胞数量。与悬液中液中细胞的含量成正比。胞的含量成正比。分分选纯度：度：分分选出的目的出的目
13、的细胞占所有收胞占所有收获细胞胞的百分率。的百分率。分分选收收获率：率：实际收收获的分的分选细胞与胞与设定通定通过测量点的分量点的分选细胞之胞之间的比率。与的比率。与纯度成反比。度成反比。分分选得率：得率：从一群体从一群体细胞胞悬液中分辨出目的液中分辨出目的细胞的胞的总量，再量，再经分分选后得到目的后得到目的细胞的胞的实际得率。得率。与分与分选速度成反比。速度成反比。（二）分（二）分选的技的技术要求要求参数：参数：FS,SS,FL数据数据显示方式示方式 （单参数直方参数直方图 、双、双参数散点参数散点图 、二、二维等高等高图 、假三、假三维等高等高图 、三参数散点、三参数散点图 ）设门分析技分
14、析技术 第二第二节 数据的数据的显示与分析示与分析FS：反映：反映颗粒的大小粒的大小SS：反映：反映颗粒的内部粒的内部结构复构复杂程度程度FL：反映：反映颗粒被染上的粒被染上的荧光数量多少光数量多少一、一、 参数参数单参数直方参数直方图双参数直方双参数直方图:点点图二二维等高等高图假三假三维等高等高图三参数直方三参数直方图多参数分析多参数分析直分析方直分析方图设门分析分析:REGION和和GATE设置置二、数据二、数据显示方式示方式由一由一维参数参数(散射光或散射光或荧光光)与与颗粒粒计数数(COUNT)构成，反映同构成，反映同样散射光或散射光或荧光光强度的度的颗粒数量的多少。粒数量的多少。（
15、一）（一）单参数直方参数直方图单参数直方参数直方图细胞胞相相对数数量量信道信道(channel )双参数直方双参数直方图：纵轴和横和横轴分分别代表被代表被测量量细胞的两个胞的两个测量参数，根据量参数，根据这两个参数两个参数就可以确定就可以确定细胞在胞在图上的表达位置。上的表达位置。双参数信号双参数信号通常采用通常采用对数信号，最常用的数信号，最常用的是点密是点密图，在，在图中，每个点代表一个中，每个点代表一个细胞，胞，点点图利用利用颗粒密度反映同粒密度反映同样散射光或散射光或荧光光强度的度的颗粒数量的多少。粒数量的多少。（二）双参数直方（二）双参数直方图1.双参数直方双参数直方图点点图绿色色荧
16、光光强度度红色色荧光光强度度双参数直方双参数直方图点点图2. 二二维等高等高图由由类似地似地图上的等高上的等高线组成，其本成，其本质也是也是双参数直方双参数直方图。等高等高图上每一条上每一条连续曲曲线上具有相同的上具有相同的细胞相胞相对或或绝对数，即数，即“等高等高”。曲曲线层次越高次越高(越里面的越里面的线) 所代表的所代表的细胞胞数愈多。数愈多。等高等高线越密集越密集则表示表示细胞数胞数变化率越大。化率越大。二二维等高等高图3. 假三假三维等高等高图（三）三参数直方（三）三参数直方图 多参数分析：当多参数分析：当细胞胞标记了多色了多色荧光，被激光，被激发光激光激发后，得到的后，得到的荧光信
17、号和散射光信光信号和散射光信号可根据需要号可根据需要进行行组合分析。合分析。（四）流式（四）流式细胞胞仪的多参数分析的多参数分析 Gate设置：指在某一置：指在某一张选定参数的直定参数的直方方图上，根据上，根据该图的的细胞群分布胞群分布选定定其中想要分析的特定其中想要分析的特定细胞群，并要求胞群，并要求该样本所有其他参数本所有其他参数组合的直方合的直方图只只体体现这群群细胞的分布情况。胞的分布情况。根据根据门的形状又分的形状又分为了了线性性门、矩形、矩形门、圆形形门、多、多边形形门、任意形状、任意形状门和十字和十字门。 三、三、设门分析技分析技术A 淋巴淋巴细胞胞B 单核核细胞胞C 中性粒中性
18、粒细胞胞A、B、C均均为任意任意门线性性门Region设置置: 区区阈（region, R）与）与门(gate, G ) 是两个是两个相关的概念，区相关的概念，区阈可与可与门对应，但是也，但是也可以包含于可以包含于门。D1 CD4+/CD3-D2 CD4+/CD3+D3 CD4- /CD3-D4 CD4- /CD3+如十字如十字门分析分析时，起，起就可以由四个区域构就可以由四个区域构成，即成，即G=D1+D2+D3+D4。 样本制本制备标记染色染色液相芯片技液相芯片技术 质量控制量控制 第四第四节 流式流式细胞胞仪免疫分析的技免疫分析的技术要求要求外周血淋巴外周血淋巴细胞胞样品的制品的制备分离
19、分离单个核个核细胞胞培养培养细胞的胞的样品制品制备蛋白蛋白酶消化消化机械吹打机械吹打使使贴壁壁细胞脱落胞脱落洗洗涤尼尼龙网网过滤单细胞胞悬液液一、免疫一、免疫检测样品制品制备新新鲜实体体组织单细胞胞悬液的制液的制备机械法机械法酶处理法理法化学化学试剂处理法理法表面活性表面活性剂处理法理法单细胞胞悬液的保存液的保存深低温保存法（一年）深低温保存法（一年）乙醇或甲醇保存法（乙醇或甲醇保存法（2周）周）甲甲醛或多聚甲或多聚甲醛保存法（保存法（2月）月）适用条件适用条件:有有较高的量子高的量子产额和消光系数和消光系数对488nm的激的激发光波光波长有有较强的吸收的吸收发射光波射光波长与激与激发光波光波
20、长间有有较大的波大的波长差差易与易与标记单抗抗结合而不影响抗体的特异性合而不影响抗体的特异性二、常用的二、常用的荧光染料与光染料与标记染色染色FITCTexas redPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光激光细胞胞悬液液异硫异硫氰酸酸荧光素光素得州得州红能量能量传递复合染料复合染料藻胆蛋白藻胆蛋白类（一）几种常（一）几种常见的的荧光染料光染料名称名称染料染料激发激发波长波长荧光颜荧光颜色色溶解性溶解性对对PHPH敏感敏感性性特点特点异硫氰酸荧异硫氰酸荧光素光素FITCFITC488488绿绿 525525易易敏感敏感易溶于水，与抗体结易溶于水，与抗体结合不影响特异性合不影响
21、特异性得州红得州红Texas Texas redred568568红红 615615不易不易不敏感不敏感稳定，偶联后量子产稳定，偶联后量子产额低额低藻红蛋白藻红蛋白PEPE488488橙橙575575易易不敏感不敏感具较多发光基团，消具较多发光基团，消光系数和量子产额高光系数和量子产额高藻青蛋白藻青蛋白PCPC488488别藻青蛋白别藻青蛋白APCAPC633633红红670670能量传递复能量传递复合染料合染料PEcy5PEcy5488488红红670670易易不敏感不敏感减少交叉，成本高减少交叉，成本高常用的几常用的几类荧光染料光染料用化学法将两种不同激用化学法将两种不同激发波波长的染料的
22、染料结合在一起，在合在一起，在488nm激激发光照射下，通光照射下，通过一个一个荧光染料被激光染料被激发后后产生的生的发射波射波长再激再激发另一另一荧光染料光染料产生生荧光信号，从而光信号，从而检测到到该特定特定荧光信号。光信号。能量能量传递复合染料复合染料PECY5CY5CY5488nm575nm670nm红色荧光花青苷花青苷5藻藻红蛋白蛋白能量能量传递复合染料机制复合染料机制荧光染料与光染料与细胞成分的四种胞成分的四种结合方式合方式结构构亲和式和式嵌入嵌入结合合共价共价键结合合荧光光标记抗体特异性抗体特异性结合合免疫免疫荧光光标记方法方法直直标:干干扰少少,但需但需购买多种多种单抗抗间标:
23、步步骤多多,干干扰多多,不需不需标记多种抗体多种抗体组合合标记（二）免疫（二）免疫荧光光标记免疫胶乳免疫胶乳颗粒的粒的应用即液相芯片技用即液相芯片技术是把微小是把微小的乳胶微球分的乳胶微球分别染成上百种不同的染成上百种不同的荧光色，把光色，把针对不同不同检测物的乳胶微球混合后再加入待物的乳胶微球混合后再加入待标本，在本，在悬液中与微粒液中与微粒进行特异性地行特异性地结合，合，经激激光照射后不同待光照射后不同待测特特产生不同生不同颜色，并可色，并可进行行定量分析。因定量分析。因检测速度极快，所以又有速度极快，所以又有“液相液相芯片芯片”之称之称 。三、免疫胶乳三、免疫胶乳颗粒技粒技术的的应用用微
24、小的乳胶微球分微小的乳胶微球分别染成上百染成上百种不同的种不同的荧光色（固相芯片是光色（固相芯片是用探用探针在芯片上的坐在芯片上的坐标位置位置给基因的特异性基因的特异性编码；而液相芯；而液相芯片片则是用是用颜色来色来编码）通通过对标记不同不同荧光素分子的光素分子的检测，实现FCM对可溶性物可溶性物质的定量分析的定量分析适当的制适当的制备方式方式处理理红细胞胞实体体组织来源来源标本用机械法本用机械法温度温度2537，四、流式四、流式细胞免疫学技胞免疫学技术的的质量控制量控制（一）（一）单细胞胞悬液制液制备的的质控控温度温度pH染料染料浓度度固定固定剂（二）免疫（二）免疫荧光染色的光染色的质控控光
25、路与流路校正光路与流路校正: 确保激光光路与确保激光光路与样品流品流处于正交状于正交状态，减少，减少变异（异（CV）。）。PMT（光（光电倍增管）校准倍增管）校准: 保保证样品品检测时仪器器处于最佳灵敏度工作状于最佳灵敏度工作状态。绝对计数校准数校准: 保保证计数的准确性。数的准确性。Flow-checkFlow-checkFlow-setFlow-setFlow-countFlow-count（三）（三）仪器操作的器操作的质控控同型同型对照：即免疫照：即免疫荧光光标记中的阴性中的阴性对照，照，选用相同源性的用相同源性的未未标记单抗抗作作为对照照调整和整和设置置电压，以保，以保证特异性。特异性
26、。全程全程质量控制：与待量控制：与待测标本一起本一起标记和和检测，结果达靶果达靶值，提示本次，提示本次实验结果可靠。果可靠。（四）免疫（四）免疫检测的的质控控 流式流式细胞胞术目前已广泛地被目前已广泛地被应用于免疫学用于免疫学基基础研究和逐步研究和逐步进入入临床床应用各方面，用流式用各方面，用流式细胞胞仪对细胞表面的抗原成分胞表面的抗原成分进行行标记分析，分析，可区可区别多种多种细胞的特性，胞的特性，为细胞免疫的研究增胞免疫的研究增加了有效的手段和帮助。加了有效的手段和帮助。 第四第四节在免疫学在免疫学检验中的中的应用用T淋巴淋巴细胞及其胞及其亚群分析群分析Th(CD3+CD4+CD8-T);
27、 Tc(CD3+CD4-CD8+T)B淋巴淋巴细胞及其胞及其亚群分析群分析B1(CD19+CD5+):产生生IgM型自身抗体型自身抗体, 参与免疫参与免疫调节、与自、与自身免疫病的身免疫病的发生有关生有关B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激受外来抗原刺激, 产生高生高亲和性特异性抗体和性特异性抗体NK细胞分析胞分析NK(CD3-CD16+CD56+)一、淋巴一、淋巴细胞及其胞及其亚群的分析群的分析细胞介胞介导细胞毒性胞毒性试验(死死细胞与活胞与活细胞比例胞比例)细胞内胞内细胞因子胞因子测定定二、淋巴二、淋巴细胞功能分析胞功能分析三、淋巴造血系三、淋巴造血系统及白血病免疫分型及白血病免疫分
28、型对淋巴瘤和白血病淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型行多色免疫分型用于用于选择化化疗方案、判断方案、判断预后及后及检出微小出微小残留病残留病变CD4+Th细胞、胞、CD4+/CD8+比例比例MDR(+)表示表示对化化疗药物耐物耐药四、四、肿瘤耐瘤耐药基因分析基因分析五、五、AIDS病病检测中的中的应用用HLA-B27可出可出现在在58%97%的的强直直性脊椎炎性脊椎炎(As) 患者患者六、自身免疫病相关六、自身免疫病相关HLA抗原分析抗原分析 FCM作作为一个一个强大的技大的技术平台，已平台，已应用于多个用于多个领域，其在移植免疫分析中的域，其在移植免疫分析中的应用也越来越广用也越来越广泛。目前移
29、植免疫中的泛。目前移植免疫中的FCM应用主要包括流式用主要包括流式细胞胞术的交叉配型（的交叉配型（Flow cytometry cross-matching, FCXM）和群体反）和群体反应性抗体（性抗体（Panel reactive antibody, PRA）检测。七、移植免疫中的七、移植免疫中的应用用思考思考题1.流式流式细胞胞仪的分析的分析检测原理是什么？原理是什么？2.流式流式细胞胞仪分析中前向散射光、分析中前向散射光、侧向散射光和向散射光和荧光的光的检测意意义。3.何何谓荧光光补偿？何？何谓“液相芯片液相芯片”技技术？4.细胞分胞分选的基本原理。的基本原理。5.FCM分析中有哪些数
30、据分析中有哪些数据显示方式，如何解示方式，如何解读结果及其果及其设门分析的意分析的意义？6.如何如何进行行FCM分析分析检测样品的制品的制备？7.流式流式细胞分析前如何胞分析前如何验证仪器工作状器工作状态，采用何种校正物，采用何种校正物？8.流式流式细胞免疫分析的胞免疫分析的质量控制包括哪些方面？量控制包括哪些方面？9.流式流式细胞胞术有哪些有哪些临床床应用价用价值？10.流式流式细胞胞仪分析中常分析中常见的的荧光素有那些？他光素有那些？他们的特性如何的特性如何？小小 结流式流式细胞胞术（FCM）是在保持）是在保持细胞及胞及细胞器或微粒的胞器或微粒的结构构及功能不被破坏的状及功能不被破坏的状态
31、下，从分子水平上下，从分子水平上获取多种信号取多种信号实现对单个个细胞胞进行定量分析或行定量分析或纯化分化分选。FCM分析中前向散射光反映分析中前向散射光反映颗粒的大小；粒的大小；侧向散射光反映向散射光反映颗粒内部粒内部结构复构复杂程度、表面的光滑程度；程度、表面的光滑程度；荧光反映光反映颗粒被粒被染上染上荧光部分数量的多少，根据其光部分数量的多少，根据其标记的抗原分子不同，即的抗原分子不同，即反映了不同抗原分子的表达情况。反映了不同抗原分子的表达情况。同型同型对照照为免疫免疫荧光光标记中的阴性中的阴性对照，可使照，可使荧光光标记单抗的信号保持其特异性。抗的信号保持其特异性。对各各项工作工作环节和和仪器性能器性能进行行严格的格的质量控制和量控制和规范化范化操作，是保操作，是保证FCM分析中各分析中各项检测数据和指数据和指标可靠性的关可靠性的关键。
