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1、生物芯片技术 徐翔丽徐翔丽S11111049S11111049芯片技术徐翔丽优秀生物芯片是指通过机器人自动打印或生物芯片是指通过机器人自动打印或光引导化学合成技术在硅片、玻璃、光引导化学合成技术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的高密度的组织、凝胶或尼龙膜上制造的高密度的组织、细胞、蛋白质、核酸、糖类以及其它细胞、蛋白质、核酸、糖类以及其它生物组分的微点阵。生物组分的微点阵。芯片技术徐翔丽优秀芯片与标记芯片与标记的样品进行的样品进行杂交，通过杂交，通过检测杂交信检测杂交信号即可实现号即可实现对生物样品对生物样品的分析。的分析。基因芯片基因芯片蛋白质芯片蛋白质芯片芯片实验室芯片实验室芯片技术徐翔丽
2、优秀蛋白质芯片蛋白质芯片, , 又称蛋白质阵列或蛋白质微阵又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列，是指以蛋白质分子作为配基列，是指以蛋白质分子作为配基, ,将其有序地将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其他它分子与之作用，洗了荧光的蛋白质或其他它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白之间定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白之间或蛋白与其它分子之间的相互作用关系。或蛋白与其它分子之间的相互作用关系。蛋白质芯片蛋白质芯片DNA芯片与蛋白芯片最大的区别芯片与蛋
3、白芯片最大的区别是靶分子和探针分子的结构差异是靶分子和探针分子的结构差异芯片技术徐翔丽优秀相对于DNA 芯片, 蛋白质芯片技术面临更多困难。第一第一, , 相对于相对于DNA DNA 的碱基配对杂交机制的碱基配对杂交机制, , 蛋白质之蛋白质之间的相互作用呈现出更强的变化性。而且间的相互作用呈现出更强的变化性。而且, , 蛋白质蛋白质的活性以及相互作用的性质可能需要其它蛋白质的的活性以及相互作用的性质可能需要其它蛋白质的作用和翻译后修饰。作用和翻译后修饰。第二第二, , 相对于相对于PCR PCR 技术这样可以大量扩增技术这样可以大量扩增DNA DNA 的技的技术术, , 尚未有可以大量扩增蛋
4、白质的成熟技术。尚未有可以大量扩增蛋白质的成熟技术。第三第三, , 蛋白质的表达和纯化工作十分艰巨蛋白质的表达和纯化工作十分艰巨, , 而且经而且经常不能保持蛋白质的完整功能。常不能保持蛋白质的完整功能。最后最后, , 许多蛋白质很不稳定许多蛋白质很不稳定, , 给阵列制作本身带来给阵列制作本身带来很大的困难很大的困难芯片技术徐翔丽优秀蛋白质是基因表达的最终产物蛋白质是基因表达的最终产物, , 接近生接近生命活动的物质层面；命活动的物质层面； 探针蛋白特异性高、亲和力强探针蛋白特异性高、亲和力强, , 可简化可简化样品前处理，甚至可直接利用生物材料样品前处理，甚至可直接利用生物材料( (血样、
5、尿样、细胞及组织等血样、尿样、细胞及组织等) )进行检测；进行检测；适合高通量筛选与靶蛋白作用的化合物；适合高通量筛选与靶蛋白作用的化合物；有助于了解药物或毒物与其效应相关蛋有助于了解药物或毒物与其效应相关蛋白质的相互作用。白质的相互作用。研究蛋白质芯片的意义芯片技术徐翔丽优秀蛋白质芯片的分类蛋白质芯片的分类一、按制作方法和用途分类一、按制作方法和用途分类蛋蛋 白白 质质 检检 测测 芯芯 片片主要包括抗体芯片、抗原芯片、配体芯片、碳水化主要包括抗体芯片、抗原芯片、配体芯片、碳水化合物芯片等。它是将具有高度亲和特异性的探针分合物芯片等。它是将具有高度亲和特异性的探针分子子 ( ( 如单克隆抗如
6、单克隆抗 体体 ) ) 固定在基片上固定在基片上 , , 用以识别用以识别复杂生物样品溶液复杂生物样品溶液 ( ( 如细胞提取物如细胞提取物 ) ) 中的目标多中的目标多肽肽 , , 当放射性同位素或荧光标记的靶分子与芯片当放射性同位素或荧光标记的靶分子与芯片上的探针分子结合后上的探针分子结合后 , , 通过激光共聚焦扫描或电通过激光共聚焦扫描或电荷耦合检测装置荷耦合检测装置 (CCD) (CCD) 对信号的强度进行检测对信号的强度进行检测 , , 从而判断样品中靶分子的数量。从而判断样品中靶分子的数量。蛋蛋 白白 质质 功功 能能 芯芯 片片它是将所研究体系中的每种天然蛋白质点加在基片它是将
7、所研究体系中的每种天然蛋白质点加在基片上制成芯片，用于天然蛋白质活性及分子亲和性的上制成芯片，用于天然蛋白质活性及分子亲和性的高通量平行研究。要了解体系中有哪些蛋白质能与高通量平行研究。要了解体系中有哪些蛋白质能与蛋白质结合蛋白质结合 , , 则将制成的蛋白质功能芯片与荧光则将制成的蛋白质功能芯片与荧光标记的蛋白质温育标记的蛋白质温育 , , 经荧光显微镜扫描检测可知经荧光显微镜扫描检测可知 , , 芯片上的亮点即为蛋白质的潜在结合物。蛋白质芯片上的亮点即为蛋白质的潜在结合物。蛋白质功能芯片主要用来检测蛋白质的生物学活性。功能芯片主要用来检测蛋白质的生物学活性。芯片技术徐翔丽优秀二、根据检测试
8、剂类型二、根据检测试剂类型抗体芯片、蛋白质芯片、肽芯片、适配体芯片、抗体芯片、蛋白质芯片、肽芯片、适配体芯片、小分子芯片等。为了检测自身抗体，自身抗原也小分子芯片等。为了检测自身抗体，自身抗原也被也被用做检测试剂，这一类蛋白质芯片叫做抗被也被用做检测试剂，这一类蛋白质芯片叫做抗原芯片。原芯片。三、根据密度分类三、根据密度分类低密度蛋白质芯片、高密度蛋白质芯片。低密度蛋白质芯片、高密度蛋白质芯片。四、根据样本分类四、根据样本分类蛋白质芯片能够从不同的生物样品中测出单一的蛋白质芯片能够从不同的生物样品中测出单一的蛋白质，因此蛋白质芯片又被称为细胞溶解物蛋蛋白质，因此蛋白质芯片又被称为细胞溶解物蛋白
9、质芯片、条件化培养基蛋白质芯片、血清蛋白白质芯片、条件化培养基蛋白质芯片、血清蛋白质芯片、反相蛋白质芯片等。质芯片、反相蛋白质芯片等。芯片技术徐翔丽优秀Quantitative analysis of human serum leptin using a nanoarray protein chip based on single-molecule sandwich immunoassayTalanta 78 (2009) 608612We report a method for the quantitative analysis of human serum leptin, which is
10、 a protein hormone asso-ciated with obesity, using a nanoarray protein chip based on a single-molecule sandwich immunoassay.The nanoarray patterning of a biotin-probe with a spot diameter of 150 nm on a self-assembled mono-layer functionalized by MPTMS on a glass substrate was successfully accomplis
11、hed using atomic force microscopy (AFM)-based dip-pen nanolithography (DPN). Unlabeled leptin protein molecules in human serum were detected based on the sandwich fluorescence immunoassay by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). The linear regression equation for leptin in the r
12、ange of 100 zM400 aM was determined to be y = 456.35 x + 80,382 ( R = 0.9901). The accuracy and sensitivity of the chip assay were clinically validated by comparing the leptin level in adult serum obtained by this method with those measured using the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) perform
13、ed with the same leptin stan-dards and serum samples. In contrast to conventional ELISA techniques, the proposed chip methodology exhibited the advantages of ultra-sensitivity, a smaller sample volume and faster analysis time.芯片技术徐翔丽优秀目前应经广泛应用的测定人类瘦蛋白的方法目前应经广泛应用的测定人类瘦蛋白的方法 the capillary electrophore
14、sis（毛细管电泳) immunofunctional assay（细胞免疫功能检测） ELISA（酶联免疫吸附测定） radioimmunoassay （放射免疫检定发） Western blotting techniques （印迹） Although they are reliable,these methods are relatively expensive and are restricted to the determination of single target specificity.芯片技术徐翔丽优秀The leptin protein nanoarrays formed
15、 via atomic force microscopy (AFM)-based dip-pen nanolithography(DPN)were detected using a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) system at the single-molecule level based on a single-molecule sandwich fluorescence immunoassay. 芯片技术徐翔丽优秀The direct deposition of the functional prot
16、ein in the nanodomains demonstrated the viability of the nanoarray leptin protein chipFig. 2. (A) Schematic diagram of the antibodyantigen reactions on the nanoarray protein chip based on the single-molecule sandwich immunoassay, and (B) AFM tapping mode images of a 4 4 nanoarray (150 nm) of dots pa
17、tterned by DPN (upper figure) and height pro first antibody/BPG with streptavidin on biotin-patterned chip(lower figure). The red and green arrows indicate the reacted spot on the chip surface. The following acronyms are used: MPB, maleimidePEO2biotin; SA, streptavidin; BPG,biotinylated protein G; 1
18、st PAb, first polyclonal antibody; Ag, antigen; 2nd BAb, second biotinylated antibody; SAF, streptavidin-Alexa 488.To test whether the leptin antibody proteins deposited in the nanoarrays retain their biologicalactivity and the accessibility of the antigenantibody binding sites,we measured the heigh
19、t of the first antibody/BPG with streptavidinon the biotin-patterned chip after reacting the first antibody for 1 h(bottom atFig. 2B)This result indicated that the use of the MPTMS-coated, glass nanoarray, protein chips functionalized withstreptavidin and protein G decreased the steric effect and no
20、nspecific binding, as well as the binding of the first antibody.芯片技术徐翔丽优秀In the nanoarray leptin protein chip based on the single-molecule sandwich fluorescence immunoassay, the fluorescence intensity of the array spot was proportional to the antigen concentration ( Fig. 3 ).This result demonstrated
21、 the potential application of single-molecule,sandwich-type, antibody nanoarrays for the detection of individual protein molecule markers at the single-molecule level.芯片技术徐翔丽优秀A representative calibration curve based on the plot of the spot fluorescence intensity against the human leptin standard in
22、 the range of concentrations of 100 zM7.8 pM using the nanoarray protein chip and TIRFM is shown in Fig. 4 A. The linear range was 100 zM400 aM (correla-tion coefficient, R = 0.9901) in the assay of the nanoarray protein chip ( Fig. 4B). The spot intensity values were calculated after back-ground su
23、btractions. The LOD of the leptin protein was 100 zM in the nanoarray leptin protein chip assay.芯片技术徐翔丽优秀Comparison of ELISA and nanoarray protein chip说明纳米阵列蛋白质芯片与酶联免疫吸附测定相比具有更低的检测限，需要更少的样品量和检测时间。说明在低浓度范围内纳米阵列芯片上的响应信号与待测物的浓度更成比例关系芯片技术徐翔丽优秀存在的问题存在的问题成本过高成本过高, , 需一系列昂贵的尖端仪器需一系列昂贵的尖端仪器芯片的标准化问题芯片的标准化问题
24、提高芯片的特异性、简化样品制备和标记操提高芯片的特异性、简化样品制备和标记操作程序、增加信号检测的灵敏度和消除芯片作程序、增加信号检测的灵敏度和消除芯片背景对于结果分析的影响等等背景对于结果分析的影响等等芯片技术徐翔丽优秀展望蛋白质芯片未来的发展重点建立快速、廉价、高通量的蛋白质表达和纯建立快速、廉价、高通量的蛋白质表达和纯化方法，高通量制备抗体并定义每种抗体的化方法，高通量制备抗体并定义每种抗体的亲和特异性。亲和特异性。 改进基质材料的表面处理技术以减少蛋白质改进基质材料的表面处理技术以减少蛋白质的非特异性结合。的非特异性结合。提高芯片制作的点阵速度；提供合适的温度提高芯片制作的点阵速度；提供合适的温度和湿度以保持芯片表面蛋白质的稳定性及生和湿度以保持芯片表面蛋白质的稳定性及生物活性。物活性。研究通用的高灵敏度、高分辨率检测方法，研究通用的高灵敏度、高分辨率检测方法，实现成像与数据分析一体化。实现成像与数据分析一体化。 芯片技术徐翔丽优秀芯片技术徐翔丽优秀谢谢！芯片技术徐翔丽优秀
