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1、抗体生成细胞检测抗体生成细胞检测抗体生成细胞检测抗体生成细胞检测 溶血空斑实验溶血空斑实验溶血空斑实验溶血空斑实验微生物与免疫教研室微生物与免疫教研室实验目的掌握溶血空斑试验检测原理掌握溶血空斑试验检测原理掌握溶血空斑的操作方法掌握溶血空斑的操作方法实验原理溶血空斑实验（溶血空斑实验（plaqueformingcellassay,PFC）体外检测单个抗体形成细胞（体外检测单个抗体形成细胞（B淋巴细胞）的一淋巴细胞）的一种方法。种方法。其原理是将绵羊红细胞（其原理是将绵羊红细胞（SRBCSRBC）免疫家兔或小鼠，）免疫家兔或小鼠，取家兔淋巴结或小鼠脾细胞制成细胞悬液，与一取家兔淋巴结或小鼠脾细胞
2、制成细胞悬液，与一定量的定量的SRBCSRBC结合，在结合，在3737条件下免疫活性淋巴细条件下免疫活性淋巴细胞释放出溶血素，在补体的参与下，可溶解周围胞释放出溶血素，在补体的参与下，可溶解周围的绵羊红细胞，从而在每个抗体形成细胞周围形的绵羊红细胞，从而在每个抗体形成细胞周围形成一个可见的溶血空斑。成一个可见的溶血空斑。一个空斑代表一个抗体形成细胞（即一个空斑代表一个抗体形成细胞（即B B细细胞胞 ），空斑的数量反映机体的体液免），空斑的数量反映机体的体液免疫功能。疫功能。 空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。由于溶血空斑试验具有特异性高，多少。由于溶血空
3、斑试验具有特异性高，筛选力强，可直接观察等优点，故可用筛选力强，可直接观察等优点，故可用做判定免疫功能的指标，观察免疫应答做判定免疫功能的指标，观察免疫应答的动力学变化，并可进行抗体种类及亚的动力学变化，并可进行抗体种类及亚类的研究。类的研究。 实验材料与试剂器材：平皿、器材：平皿、3737水浴箱、离心机、显微水浴箱、离心机、显微镜镜试剂：试剂：SRBCSRBC悬液：取无菌脱纤维羊血，用悬液：取无菌脱纤维羊血，用NSNS或或PBSPBS离心洗涤离心洗涤3 3次，每次以次，每次以2000rpm2000rpm，5min5min，用用PH7.2PH7.2的的PBSPBS（含（含CaCa2+2+、Mg
4、Mg2+2+）悬成细胞浓）悬成细胞浓度为度为2.00102.00109 9个个/ /mLmLHanksHanks液（含液（含CaCa2+2+、MgMg2+2+ ）底层基（底层基（1.4%1.4%）和表层基（）和表层基（0.7% 0.7% ）：）：将琼脂糖用将琼脂糖用HanksHanks液配成液配成1.4%1.4%和和0.7%0.7%两种两种浓度。将表层基分装于小试管中，每管浓度。将表层基分装于小试管中，每管2ml2ml补体：新鲜豚鼠血清补体：新鲜豚鼠血清小牛血清：小牛血清：5656灭活灭活 30min30min实验步骤免疫脾细胞悬液的制备免疫脾细胞悬液的制备小鼠免疫：每只小鼠经尾静脉注入上述小
5、鼠免疫：每只小鼠经尾静脉注入上述SRBCSRBC悬悬液液2.00104个个/0.2ml0.2ml或者腹腔注射或者腹腔注射4.00108个个/1ml1ml。单个脾细胞悬液的制备：将免疫后第四天的小单个脾细胞悬液的制备：将免疫后第四天的小鼠拉颈处死，解剖取出脾脏，放入鼠拉颈处死，解剖取出脾脏，放入PH7.2PH7.2的的PBSPBS中漂洗，去掉结缔组织，加入适量的中漂洗，去掉结缔组织，加入适量的PBSPBS，用镊，用镊子挤压脾脏，稍静置，吸上清液至离心管中，子挤压脾脏，稍静置，吸上清液至离心管中，2500r/min2500r/min离心离心5min5min，弃上清后，定量加入，弃上清后，定量加入P
6、BSPBS液液1ml1ml，混匀，再用，混匀，再用PBSPBS液稀释液稀释1010倍（浓度约为倍（浓度约为5105106 6个个/ml/ml）（二）倾注底层琼脂（二）倾注底层琼脂 将将1.4%1.4%琼脂凝胶加热融化后，倾注于琼脂凝胶加热融化后，倾注于水平位置的平皿内，每皿水平位置的平皿内，每皿6ml6ml，凝固，凝固后，用前置后，用前置5555水浴锅中预温。水浴锅中预温。 （三）表层琼脂的制备（三）表层琼脂的制备 将将0.7%0.7%的琼脂融化后，置于的琼脂融化后，置于5555恒温恒温水浴箱中，依次加入以下试剂：水浴箱中，依次加入以下试剂： 20%SRBC20%SRBC悬液悬液0.1ml0.
7、1ml。 小牛血清小牛血清0.1ml0.1ml。 5.00105.00106 6/ml/ml脾细胞悬液脾细胞悬液0.1ml0.1ml。 迅速混匀后，倾注于已铺好底层琼脂迅速混匀后，倾注于已铺好底层琼脂的平皿内，使之均匀铺平凝固后，静的平皿内，使之均匀铺平凝固后，静置约置约15min15min，放，放3737温育温育2h2h。 （四）加补体（四）加补体 从温箱中取出平皿，每皿加入从温箱中取出平皿，每皿加入1:51:5稀释稀释的新鲜豚鼠血清的新鲜豚鼠血清1ml1ml，继续放，继续放3737温温箱中温育箱中温育30min30min后取出，观察溶血空后取出，观察溶血空斑。也可在室温下放置斑。也可在室温
8、下放置1h1h，44冰箱冰箱过夜，次日观察结果。过夜，次日观察结果。结果判定结果判定 观察时，将平皿对着光亮处，观察时，将平皿对着光亮处，用肉眼或放大镜观察每个溶血空斑用肉眼或放大镜观察每个溶血空斑的溶血状况，并记录整个平皿中的的溶血状况，并记录整个平皿中的空斑数，同时求出每百万个脾细胞空斑数，同时求出每百万个脾细胞内含空斑形成细胞的平均数。内含空斑形成细胞的平均数。注意事项注意事项对对SRBCSRBC的要求：因为的要求：因为SRBCSRBC既是免疫原，也是既是免疫原，也是靶细胞和指示细胞，故要求靶细胞和指示细胞，故要求SRBCSRBC应新鲜，洗涤应新鲜，洗涤不超过不超过3 3次，每次次，每次
9、2000r/min2000r/min离心离心5min5min，细胞，细胞变形或脆性增大者均不能使用。变形或脆性增大者均不能使用。2 2免疫所用免疫所用SRBCSRBC的数量：尾静脉注射以的数量：尾静脉注射以2.00104个个/0.2ml为宜。腹腔注射为为宜。腹腔注射为4.00108个个/ml，用量小，如低于用量小，如低于1.00107个个/ml注射注射0.5ml，空斑形成极少；用量过大，超过，空斑形成极少；用量过大，超过2.50109个个/ml，不能形成空斑。，不能形成空斑。 3 3采取免疫脾的时间：无论是经尾静脉还是腹采取免疫脾的时间：无论是经尾静脉还是腹腔免疫，均以免疫后第四天取脾为宜，过
10、早或腔免疫，均以免疫后第四天取脾为宜，过早或过晚空斑都形成极少。过晚空斑都形成极少。4 4脾细胞的活力：脾细胞的活力：为了保证脾细胞的活力，为了保证脾细胞的活力，制备脾细胞过程中所用制备脾细胞过程中所用PBSPBS（或（或HanksHanks液），液），最好临用时方从最好临用时方从44冰箱中取出，或整个操作冰箱中取出，或整个操作过程应在冰浴中进行。过程应在冰浴中进行。 5 5倾注平板的要求：底层要平，表层要把握好倾注平板的要求：底层要平，表层要把握好温度。不要有气泡，表层基要求混合均匀。温度。不要有气泡，表层基要求混合均匀。6 6补体的活力：补体活力的大小，对溶补体的活力：补体活力的大小，对溶
11、血空斑的形成关系很大。如出现抗体或血空斑的形成关系很大。如出现抗体或补体的活力低下，将不能形成空斑。所补体的活力低下，将不能形成空斑。所以补体要新鲜，并宜将以补体要新鲜，并宜将3 3只以上豚鼠血清只以上豚鼠血清混合。试验中加入混合。试验中加入CaCa2+2+、MgMg2+2+是为了活化是为了活化补体。补体。7 7空斑计数：要求判读准确，避免辨认空斑计数：要求判读准确，避免辨认造成的误差。遇可疑空斑时，应镜检，造成的误差。遇可疑空斑时，应镜检，对肉眼结果进行核对。对肉眼结果进行核对。 所以器皿和各种试剂在加入表层基前均所以器皿和各种试剂在加入表层基前均需预温。需预温。SRBCSRBC可大致计数，但脾细胞计数必须准可大致计数，但脾细胞计数必须准确。确。免疫动物必须用纯系动物，杂种动物个免疫动物必须用纯系动物，杂种动物个体差异大，难以比较，最好先作几次预体差异大，难以比较，最好先作几次预实验，使每个玻片空斑数控制在实验，使每个玻片空斑数控制在100-200100-200个为宜。个为宜。思考题思考题溶血空斑实验的意义？溶血空斑实验的意义？
