《BD流式基础知识qj课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《BD流式基础知识qj课件（68页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、流式细胞术流式细胞术For FCM TrainingBD: 钱钱 璟璟2011.9.28 重庆重庆 流式细胞术？流式细胞术？对于处在流动状态中的细胞或颗粒各项特性进行检测Flow Cyto metryFlow Cyto metryin motioncellmeasure 特点：特点： 速度快(10000cells/s) 特异性强，灵敏度高( MRD:1/10000 ) 多参数分析、活细胞分选 研究对象研究对象: : 单细胞悬液单细胞悬液 可检测的样本种类多样：外周血、骨髓、细胞穿刺液、洗脱液、实体组织、培养细胞、藻类等 流式细胞术流式细胞术 FACSVerseAccuri C6LSR fort
2、tesa现代流式细胞仪现代流式细胞仪(Flow cytometer) FL2 PESSCFSC电子系统计算机系统FL3 PerCP, Cy5 FL1 FITCLight detectors液流系统光学系统laser流式细胞仪工作流程流式细胞仪工作流程 流式细胞仪的构造流式细胞仪的构造1. 细胞样本成单列依次通过光检测区 液流系统液流系统2. 激发并收集各种光信号3. 光信号转换成电信号，数字化处理4. 数字信号传入计算机 光学系统光学系统 电子系统电子系统计算机系统计算机系统 分选系统分选系统5. 活细胞分选 液流系统液流系统流动室（流动室（Flow cell）LaserSample流体动力学
3、聚焦鞘液：sheathSheathSample StreamCell 样本流和鞘液流的驱动一般采用加正压的方法鞘液压力恒定，流速不变通过调节样本压力调节样本进样速率液流系统液流系统液流驱动系统 调节样本进样速度样本流与鞘液压力差改变，样本流直径改变，细胞间距改变10 psi10 psi10 psi10 psi10 psi10.2 psi10.4 psi10.8 psi压力差 样本流 进样速度 分辨率分辨率HiHiLoLoMedMed Low pressureHigh pressure细胞周期细胞周期FL301024204830724096Count30028026024022020018016
4、0140120100806040200.G0/G1 CV= 2.42G2/MS phaseG0/G1FL301024204830724096Count340320300280260240220200180160140120100806040200GO/G1 CV= 7.79.GO/G1 CV= 7.79 流式细胞仪的构造流式细胞仪的构造1. 细胞样本成单列依次通过光检测区2. 激发并收集各种光信号 液流系统液流系统 光学系统光学系统 光学系统光学系统激发光学系统:激发光源激光透镜和反射镜将激光引导到检测区域接收光学系统:滤光片等将产生的光信号引导到对应的光学接收器 激发光学系统: 将激光引导到
5、检测区域，产生光信号激光激光单波长高强度高稳定488 nm blue633 nm red405 nm violetLight Signals光学棱镜光学棱镜 流式细胞仪检测信号流式细胞仪检测信号Injector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluidLaser beam 1. 散射光信号 2.染色过细胞的荧光信号 前向角散射光(FSC) 侧向角散射光(SSC)360度立体角 通过流式细胞仪我们可以得到通过流式细胞仪我们可以得到- 相对细胞大小 （前向角散射光-FSC） 相对细胞颗粒密度和内部复杂度 （侧向角散射光-SSC） 染色过
6、细胞的相对荧光强度 （荧光-Fluoresent light） 前向角散射光（前向角散射光（FSCFSC）Forward (Angle Light) Scatter FSC信号收集方向与激光束相平行 FSC与被测细胞或颗粒相对大小及表面积相关 FALS SensorLaser 前向角散射光（前向角散射光（FSCFSC）FSC is proportional to relative size & cell-surface area 侧向角散射光（侧向角散射光（SSCSSC）Side-scattered light (90 Degree Light Scatter) SSC信号收集方向与激光束相垂
7、直（90） SSC与被测细胞或颗粒内部颗粒度和结构复杂度相关FALS Sensor90LS SensorLaser 侧向角散射光（侧向角散射光（SSCSSC）SSC is proportional to cell granularity or internal complexity. 散射光（散射光（FSC & SSCFSC & SSC） 散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异 通常使用“散点图”来看散射光信号 散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据 eg. Major leucocyte subpopulations can be differentiated using FSC
8、 and SSC.Figure: Cell subpopulations based on FSC vs SSCDual Parameter dot-plot 流式细胞仪检测信号流式细胞仪检测信号Injector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluidLaser beam 1. 散射光信号 2.染色过细胞的荧光信号 自发荧光信号特异性荧光信号 荧光信号荧光信号（ Fluoresent lightFluoresent light ） 双色荧光散点图双色荧光散点图 荧光强度荧光强度（ Fluoresence Fluoresence i
9、ntensityintensity） 荧光信号的强度代表被测细胞膜表面抗原强度或细胞内物质浓度。 荧光信号荧光信号（ Fluoresent lightFluoresent light ）荧光信号收集方向与激光束相垂直（90）FluorescenceFALS SensorFluorescence detector( FL1,FL2,FL3,FL4)接收光学系统接收光学系统 接收光学系统：接收光信号,并将光信号引导到对应的接收器中光学滤片光学滤片460 500 540460 500 540460 500 540SP 500SP 500LP 500LP 500BP500/50BP500/50Long
10、pass Shortpass Bandpass( 500+/- 25 ) FACSCalibur光路图每个探测器前往往为BP，所以每个探测器只能接收特定波长范围的光信号FL1:515nm - 545nm 光学探测器光电二极管光电二极管 -FSC Photodiodes 光电倍增管光电倍增管 - SSC & Fluoresence Photomultiplier tubes (PMTs)光电转换器：光电转换器： 将光信号转换为电信号将光信号转换为电信号 流式细胞仪的构造流式细胞仪的构造3. 光信号转换成电信号，数字化处理1. 细胞样本成单列依次通过光检测区2. 激发并收集各种光信号 液流系统液流
11、系统 光学系统光学系统 电子系统电子系统 电子系统电子系统l 将光信号转化为电信号（模拟信号）l将模拟信号转化为数字信号l 计算每个脉冲峰l和计算机连接以传出数据将光信号成比例的转换成电信号，并进行数字化处理后传入计算机 光信号转换为电信号Linear Linear AmplificationAmplificationLogLogAmplificationAmplificationororVoltageVoltageTimeTimeVoltageVoltagePMT电压 电信号 电压脉冲的产生模拟信号LaserLaserLaserLaserLaserLaserTimeVoltageTimeVo
12、ltageTimeVoltage1当微粒通过激光束时，脉冲开始。此时，激光强度和信号强度都很低。2当微粒达到激光束中间时，脉冲达到最大强度或者高度，此时激光束和信号强度都最高。此时测定峰值强度或者脉冲高度。3当微粒离开激光束时，脉冲减弱。 计算一个电压脉冲峰TimeVoltsPulse AreaPulse HeightPulse Width0面积是对荧光光通量进行积分测量的结果宽度=面积/高度，与颗粒通过激光照射区的时间成正比特定参数可选择面积、宽度信号（DNA含量分析） 模拟信号转换为数字信号 流式细胞仪的构造流式细胞仪的构造3. 光信号转换成电信号，数字化处理4. 数字信号传入计算机1.
13、细胞样本成单列依次通过光检测区2. 激发并收集各种光信号 液流系统液流系统 光学系统光学系统 电子系统电子系统计算机系统计算机系统 数据的获取表现 专业软件中的数据表现单参数直方图单参数直方图 双参数散点图双参数散点图 三三维点图维点图等高图 密度图 设门（Gating）平均荧光强度百分比 流式细胞仪的构造流式细胞仪的构造1. 细胞样本成单列依次通过光检测区2. 激发并收集各种光信号3. 光信号转换成电信号，数字化处理4. 数字信号传入计算机 液流系统液流系统 光学系统光学系统 电子系统电子系统计算机系统计算机系统 分选系统分选系统5. 活细胞分选 分选系统分选系统检测加电偏转收集 Revie
14、wReviewSorting Review Questions在仪器设置中调高 Red参数的电压，左图中群体会发生什么变化？ 如何进行流式细胞实验？如何进行流式细胞实验？1. 样本处理2. 荧光染料的选择3. 染色4. 数据收集和分析 1. 样本处理单细胞悬液单细胞悬液细胞悬液：直接使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操作简便，样本用血量小灌洗液、体腔积液培养细胞、细胞系实体组织：病理组织：新鲜样本/石蜡包埋样本针吸组织：新鲜样本 2. 选择合适的荧光染料 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发 激发光谱必须在探测器能够接收的合适范围内 根据抗原表达强弱选择荧光抗体 荧光素光谱的重叠应当尽量
15、减少 荧光信号荧光信号（ Fluoresent lightFluoresent light ） Fluorescein (FITC)400 nm500 nm600 nm700 nmWavelengthExcitationExcitation EmissonEmisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm ExcitationExcitationEmissonEmisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nmPhycoerytherin (PE) Allophycocyanin (APC)633 nm 633 nm 红激光红激光红
16、激光红激光ExcitationExcitationEmissonEmisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm 2. 选择合适的荧光染料 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发 激发光谱必须在探测器能够接收的合适范围内 根据抗原表达强弱选择荧光抗体 荧光素光谱的重叠应当尽量减少 FACSCalibur光路图每个探测器前往往为BP，所以每个探测器只能接收特定波长范围的光信号FL1:515nm - 545nm 2. 选择合适的荧光染料 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发 激发光谱必须在探测器能够接收的合适范围内 根据抗原表达强弱选择荧光抗体 荧光素光
17、谱的重叠应当尽量减少 2. 选择合适的荧光染料 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发 激发光谱必须在探测器能够接收的合适范围内 根据抗原表达强弱选择荧光抗体 荧光素光谱的重叠应当尽量减少 荧光光谱重叠与补偿530/30585/42利用电子术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的技术称“荧光补偿” 荧光补偿荧光补偿补偿前补偿前 补偿后补偿后 2. 选择合适的荧光染料 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发 激发光谱必须在探测器能够接收的合适范围内 根据抗原表达强弱选择荧光抗体 荧光素光谱的重叠应当尽量减少 3.染色 体积 温度 孵育时间 对照 4. 数据收集和分析1) 画
18、图（直方图，散点图）2) 调整仪器设置到合适的状态3) 寻找目标细胞4) 我们可以得到怎样的结果？ 它们意味着什么？ 仪器设置调节仪器设置调节1. 用阴性细胞调整仪器用阴性细胞调整仪器PMT电压电压2. 用单染色的细胞调节仪器补偿用单染色的细胞调节仪器补偿二原则：二原则： 同型对照同型对照（Isotype control）例：一个双色染色的实验 抗体A FITC，抗体B PE 对应的同型对照是IgG1 FITC,IgG1 PE那么需要准备的是 阴性对照：细胞加上IgG1 FITC,IgG1 PE 单阳性对照： FITC: 细胞加上Ab A FITC PE: 细胞加上Ab B PE同型抗体为没有特异性，与荧光抗体蛋白亚型一致的免疫球蛋白，通常同型抗体为没有特异性，与荧光抗体蛋白亚型一致的免疫球蛋白，通常是未进行免疫小鼠血清的纯化是未进行免疫小鼠血清的纯化IgG1IgG1或或IgG2.IgG2.同型对照就是使用同型抗体进行平行实验，反映待测样本对抗体非特异同型对照就是使用同型抗体进行平行实验，反映待测样本对抗体非特异性结合水平。性结合水平。 数据分析数据分析设门设定阴性与阳性群体的界限确定阳性与阴性细胞群体统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平均荧光值，绝对数或抗体结合数 如何设定阴性与阳性的界限如何设定阴性与阳性的界限 直方图 散点图 Thanks!
