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1、15-1 15-1 概述概述概述概述 高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLCHPLC）是）是）是）是2020世纪世纪世纪世纪6060年代年代年代年代末末末末7070年代初发展起来的一种年代初发展起来的一种年代初发展起来的一种年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不新型分离分析技术，随着不新型分离分析技术，随着不新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为断改进与发展，目前已成为断改进与发展，目前已成为断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分应用极为广泛的化学分离分应用极为广泛的化学分离分应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。析的重要手段。析的重要手段
2、。析的重要手段。 第第15章章 高效液相色谱法高效液相色谱法 液相色谱法最初是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液相色谱法最初是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液相色谱法最初是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液相色谱法最初是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法液位差输送流动相，称为经典液相色谱法液位差输送流动相，称为经典液相色谱法液位差输送流动相，称为经典液相色谱法 高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法(High performance Liquid (High performance Liquid ChromatographyChro
3、matography，HPLC)HPLC)在经典液相色谱法的基础上，引在经典液相色谱法的基础上，引在经典液相色谱法的基础上，引在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱理论而发展起来的分离分析方法入了气相色谱理论而发展起来的分离分析方法入了气相色谱理论而发展起来的分离分析方法入了气相色谱理论而发展起来的分离分析方法 与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，引起高与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，引起高与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，引起高与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法
4、阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High (High Pressure Liquid ChromatographyPressure Liquid Chromatography，HPLC)HPLC) 又因分析速度快而称为高速液相色谱法又因分析速度快而称为高速液相色谱法又因分析速度快而称为高速液相色谱法又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid (High Speed Liquid ChromatographyChromatography，HSLC)HSLC)，也称现代液相色谱，也称现代液相色谱，也称现代液相
5、色谱，也称现代液相色谱15-1-1 15-1-1 高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法 HPLC HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：与经典液相色谱相比有以下优点：与经典液相色谱相比有以下优点：与经典液相色谱相比有以下优点：n n速度快：通常分析一个样品在速度快：通常分析一个样品在速度快：通常分析一个样品在速度快：通常分析一个样品在15 15 30 min30 min，有些样品，有些样品，有些样品，有些样品甚至在甚至在甚至在甚至在5 min5 min内即可完成内即可完成内即可完成内即可完成n n分辨率高：可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果分辨率高：可选择固定相和流动相
6、以达到最佳分离效果分辨率高：可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果分辨率高：可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果n n灵敏度高：紫外检测器可达灵敏度高：紫外检测器可达灵敏度高：紫外检测器可达灵敏度高：紫外检测器可达0.01ng0.01ng，荧光和电化学检测，荧光和电化学检测，荧光和电化学检测，荧光和电化学检测器可达器可达器可达器可达0.1pg0.1pgn n柱子可反复使用：用一根色谱柱可分离不同的化合物柱子可反复使用：用一根色谱柱可分离不同的化合物柱子可反复使用：用一根色谱柱可分离不同的化合物柱子可反复使用：用一根色谱柱可分离不同的化合物n n样品量少，容易回收：样品经过色谱柱后不被破坏，可
7、样品量少，容易回收：样品经过色谱柱后不被破坏，可样品量少，容易回收：样品经过色谱柱后不被破坏，可样品量少，容易回收：样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备以收集单一组分或做制备以收集单一组分或做制备以收集单一组分或做制备液相色谱的发展过程液相色谱的发展过程液相色谱的发展过程液相色谱的发展过程 液相色谱法的分离原理是：溶于流动相中的各组分经过液相色谱法的分离原理是：溶于流动相中的各组分经过液相色谱法的分离原理是：溶于流动相中的各组分经过液相色谱法的分离原理是：溶于流动相中的各组分经过固定相时，由于与固定相发生作用（吸附、分配、离子吸引、固定相时，由于与固定相发生作用（吸附、分配、离子
8、吸引、固定相时，由于与固定相发生作用（吸附、分配、离子吸引、固定相时，由于与固定相发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。从而先后从固定相中流出。从而先后从固定相中流出。从而先后从固定相中流出。 又称为色层法、层析法。又称为色层法、层析法。又称为色层法、层析法。又称为色层法、层析法。15-1-2 15-1-2 液相色谱分离原理液相色谱分离原理液相色谱分离原理液相色谱
9、分离原理n n样品形态：液体样品形态：液体样品形态：液体样品形态：液体 气体或液体气体或液体气体或液体气体或液体( (加热气化加热气化加热气化加热气化) )n n流动相流动相流动相流动相: : 液体液体液体液体( (黏度大，黏度大，黏度大，黏度大，10102 2倍倍倍倍) ) 气体气体气体气体( (黏度小黏度小黏度小黏度小) )n n输送压力：输送压力：输送压力：输送压力：5-50MPa 0.1-0.5MPa5-50MPa 0.1-0.5MPan n固定相：固定相：固定相：固定相： 粒度粒度粒度粒度5-105-10 m m 粒度粒度粒度粒度0.1-0.5 mm0.1-0.5 mmn n柱长柱长
10、柱长柱长: 10-25cm 1-4m(: 10-25cm 1-4m(填填填填) 10-100m() 10-100m(开开开开) )n n检测器：检测器：检测器：检测器： 紫外紫外紫外紫外 TCDTCD 示差折光示差折光示差折光示差折光 FIDFID 荧光荧光荧光荧光 ECDECD 电化学电化学电化学电化学 FPDFPDn n应用范围：高沸点应用范围：高沸点应用范围：高沸点应用范围：高沸点 低沸点低沸点低沸点低沸点 热不稳定热不稳定热不稳定热不稳定 （活性）（活性）（活性）（活性） 永久性气体永久性气体永久性气体永久性气体 强极性、大分子强极性、大分子强极性、大分子强极性、大分子 裂解产物裂解产
11、物裂解产物裂解产物15-1-3 15-1-3 液相色谱与气相色谱的比较液相色谱与气相色谱的比较液相色谱与气相色谱的比较液相色谱与气相色谱的比较高压输液系统高压输液系统高压输液系统高压输液系统进样系统进样系统进样系统进样系统分离系统分离系统分离系统分离系统检测系统检测系统检测系统检测系统数据处理系统数据处理系统数据处理系统数据处理系统15-2 15-2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪液相液相液相液相色谱的基本流程图色谱的基本流程图色谱的基本流程图色谱的基本流程图流流流流动动动动相相相相 泵泵泵泵色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱检测器检测器检测器检测器 输输输输液液液液系统系统系
12、统系统分离分离分离分离系统系统系统系统 检测检测检测检测系统系统系统系统数据处理系统数据处理系统数据处理系统数据处理系统A AE EG GB BC CD DF F进样阀进样阀进样阀进样阀进样进样进样进样系统系统系统系统由贮液器、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等构成由贮液器、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等构成由贮液器、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等构成由贮液器、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等构成15-2-1 15-2-1 高压输液系统高压输液系统高压输液系统高压输液系统(2)(2)高压输液泵：高压输液泵：高压输液泵：高压输液泵：主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：主要部件之一，
13、压力：主要部件之一，压力：5 550M Pa50M Paa. a.为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10 电电电电泳泳泳泳时时时时, , , ,阴阴阴阴离离离离子子子子在在在在负负负负极极极极最最最最后流出后流出后流出后流出 电渗：由于外加电场对管电渗：由于外加电场对管电渗：由于外加电场对管电渗：由于外加电场对管壁溶液双电层的作用而产生壁溶液双电层的作用而产生壁溶液双电层的作用而产生壁溶液双电层的作用而产生的溶液的整体流动。的溶液的整体流动。的溶液的整体流动。的溶液的整体流动。
14、4. 4.高效毛细管电泳的特点高效毛细管电泳的特点高效毛细管电泳的特点高效毛细管电泳的特点仪器简单、易自动化仪器简单、易自动化仪器简单、易自动化仪器简单、易自动化 电源、毛细管、检测器、缓冲溶液瓶（电极瓶）电源、毛细管、检测器、缓冲溶液瓶（电极瓶）电源、毛细管、检测器、缓冲溶液瓶（电极瓶）电源、毛细管、检测器、缓冲溶液瓶（电极瓶）分析速度快、分离效率高分析速度快、分离效率高分析速度快、分离效率高分析速度快、分离效率高 在在在在3.13.1minmin内分离内分离内分离内分离3636种无机及有机阴离子，种无机及有机阴离子，种无机及有机阴离子，种无机及有机阴离子，4 4.1 .1minmin内分离
15、了内分离了内分离了内分离了2424种阳离子；种阳离子；种阳离子；种阳离子；分离柱效：分离柱效：分离柱效：分离柱效：10105 510107 7/ /mm理论塔板数理论塔板数理论塔板数理论塔板数操作方便、运耗费低操作方便、运耗费低操作方便、运耗费低操作方便、运耗费低 进样量极少，在水介质中进行进样量极少，在水介质中进行进样量极少，在水介质中进行进样量极少，在水介质中进行应用范围极广应用范围极广应用范围极广应用范围极广 有机物、无机物、生物、中性分子、生物大分子等有机物、无机物、生物、中性分子、生物大分子等有机物、无机物、生物、中性分子、生物大分子等有机物、无机物、生物、中性分子、生物大分子等 分
16、子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等 15-9-2 15-9-2 分离模式分离模式分离模式分离模式 带电粒子的迁移速度带电粒子的迁移速度带电粒子的迁移速度带电粒子的迁移速度= = = =电泳和电渗流速度的矢量和电泳和电渗流速度的矢量和电泳和电渗流速度的矢量和电泳和电渗流速度的矢量和 阳离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出阳离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出阳离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出阳离子：两种效应的运动方向一致，
17、在负极最先流出 中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出 阴离子：最后流出阴离子：最后流出阴离子：最后流出阴离子：最后流出同种类离子由于荷质比的不同而被分离同种类离子由于荷质比的不同而被分离同种类离子由于荷质比的不同而被分离同种类离子由于荷质比的不同而被分离最基本、应用最基本、应用最基本、应用最基本、应用最最最最广的分离模式广的分离模式广的分离模式广的分离模式1. 1.毛细管区带电泳毛细管区带电泳毛细管区带电泳毛细管区带电泳CZECZE
18、（1 1）缓冲溶液中加入离子缓冲溶液中加入离子缓冲溶液中加入离子缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达型表面活性剂，其浓度达型表面活性剂，其浓度达型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水到临界浓度，形成一疏水到临界浓度，形成一疏水到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束内核、外部带负电的胶束内核、外部带负电的胶束内核、外部带负电的胶束2. 2.胶束电动毛细管色谱（胶束电动毛细管色谱（胶束电动毛细管色谱（胶束电动毛细管色谱（MECCMECC、 MEKCMEKC） 在电场力的作用下，在电场力的作用下，在电场力的作用下，在电场力的作用下，胶束在柱中移动胶束在柱中移动胶束在柱中移动胶束在柱中
19、移动 （2 2）电泳和电渗流的方向相反，）电泳和电渗流的方向相反，）电泳和电渗流的方向相反，）电泳和电渗流的方向相反，且且且且 电渗流电渗流电渗流电渗流 电泳电泳电泳电泳 ，负电胶束以较，负电胶束以较，负电胶束以较，负电胶束以较慢的速度向负极移动慢的速度向负极移动慢的速度向负极移动慢的速度向负极移动（3 3）中性分子在胶束相和溶）中性分子在胶束相和溶）中性分子在胶束相和溶）中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强液（水相）间分配，疏水性强液（水相）间分配，疏水性强液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流的组分与胶束结合的较牢，流的组分与胶束结合的较牢，流的组分与胶束结合的较牢
20、，流出时间晚出时间晚出时间晚出时间晚 （4 4）可用来分离中性物质，）可用来分离中性物质，）可用来分离中性物质，）可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用扩展了高效毛细管电泳的应用扩展了高效毛细管电泳的应用扩展了高效毛细管电泳的应用范围范围范围范围 在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以电渗流为流动在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以电渗流为流动在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以电渗流为流动在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以电渗流为流动相，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程相，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程相，试样组分
21、在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程相，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程 目前电色谱采用填充柱、开管柱、整体柱等目前电色谱采用填充柱、开管柱、整体柱等目前电色谱采用填充柱、开管柱、整体柱等目前电色谱采用填充柱、开管柱、整体柱等3. 3.毛细管电色谱毛细管电色谱毛细管电色谱毛细管电色谱 CECCEC一、离子分析一、离子分析一、离子分析一、离子分析 1.1.1.1.阳离子分析阳离子分析阳离子分析阳离子分析离子迁移方向和电渗流方向一致；离子迁移方向和电渗流方向一致；离子迁移方向和电渗流方向一致；离子迁移方向和电渗流方向一致； 4.5 4.5minmin内分离了内分离了内分离了内分离了
22、2424多种金属多种金属多种金属多种金属离子离子离子离子阳极进样，阴极检测阳极进样，阴极检测阳极进样，阴极检测阳极进样，阴极检测15-9-2 15-9-2 分离分析实例分离分析实例分离分析实例分离分析实例2. 2.阴离子分析阴离子分析阴离子分析阴离子分析加入电渗流改性剂，如：十六烷基三甲基溴化胺等，使电泳方向加入电渗流改性剂，如：十六烷基三甲基溴化胺等，使电泳方向加入电渗流改性剂，如：十六烷基三甲基溴化胺等，使电泳方向加入电渗流改性剂，如：十六烷基三甲基溴化胺等，使电泳方向和电渗流方向一致，可在和电渗流方向一致，可在和电渗流方向一致，可在和电渗流方向一致，可在3.13.1minmin内分离内分
23、离内分离内分离3636种阴离子种阴离子种阴离子种阴离子阴极进样，阳极检测阴极进样，阳极检测阴极进样，阳极检测阴极进样，阳极检测二、药物分析二、药物分析二、药物分析二、药物分析 检测体液或细胞中某些检测体液或细胞中某些检测体液或细胞中某些检测体液或细胞中某些代谢产物的分析代谢产物的分析代谢产物的分析代谢产物的分析 尿液中的氨基酸含量作为尿液中的氨基酸含量作为尿液中的氨基酸含量作为尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病的辅助手段临床诊断糖尿病的辅助手段临床诊断糖尿病的辅助手段临床诊断糖尿病的辅助手段 采用毛细管区带电泳方式，采用毛细管区带电泳方式，采用毛细管区带电泳方式，采用毛细管区带电泳方式，在在
24、在在1111minmin内分离内分离内分离内分离1717种药物种药物种药物种药物采用采用采用采用MEKCMEKC模式，鉴定模式，鉴定模式，鉴定模式，鉴定违禁药物；效果优于违禁药物；效果优于违禁药物；效果优于违禁药物；效果优于HPLCHPLC法法法法三、手性化合物分析三、手性化合物分析HPCEHPCE分离分析手性化合物的方法：加入手性选择剂；分离分析手性化合物的方法：加入手性选择剂；分离分析手性化合物的方法：加入手性选择剂；分离分析手性化合物的方法：加入手性选择剂；形成配合物的稳定常数有差异，结合形成配合物的稳定常数有差异，结合形成配合物的稳定常数有差异，结合形成配合物的稳定常数有差异，结合HP
25、CEHPCE的高分离效率的高分离效率的高分离效率的高分离效率 常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠醚；手性表面活性剂常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠醚；手性表面活性剂常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠醚；手性表面活性剂常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠醚；手性表面活性剂（氨基酸衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性（氨基酸衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性（氨基酸衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性（氨基酸衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性表面活性剂）表面活性剂）表面活性剂）表面活性剂）四、氨基酸
26、与蛋白质分析四、氨基酸与蛋白质分析四、氨基酸与蛋白质分析四、氨基酸与蛋白质分析采用采用采用采用MEKCMEKC模式，在模式，在模式，在模式，在2525分钟内分离了分钟内分离了分钟内分离了分钟内分离了2323种丹酰化氨基酸种丹酰化氨基酸种丹酰化氨基酸种丹酰化氨基酸HPCEHPCE可取代传统的氨基酸分析仪可取代传统的氨基酸分析仪可取代传统的氨基酸分析仪可取代传统的氨基酸分析仪蛋白质分析蛋白质分析五、核酸分析及五、核酸分析及DNA排序排序重要分析手段重要分析手段重要分析手段重要分析手段如图，酶解的双螺旋如图，酶解的双螺旋如图，酶解的双螺旋如图，酶解的双螺旋DNADNADNADNA限制性片段的分离限制
27、性片段的分离限制性片段的分离限制性片段的分离进展进展进展进展1. 1.微型化微型化微型化微型化 整体化学分析系统（整体化学分析系统（整体化学分析系统（整体化学分析系统（TASTAS）及及及及TASTAS微型化微型化微型化微型化 在硅片上光刻出矩形槽作为毛细管在硅片上光刻出矩形槽作为毛细管在硅片上光刻出矩形槽作为毛细管在硅片上光刻出矩形槽作为毛细管，理论塔板数理论塔板数理论塔板数理论塔板数10105 5/ /mm；2. 2.联用仪器联用仪器联用仪器联用仪器 CE-MSCE-MS3. 3.阵列毛细管凝胶电泳阵列毛细管凝胶电泳阵列毛细管凝胶电泳阵列毛细管凝胶电泳 应用于人类基因应用于人类基因应用于人
28、类基因应用于人类基因DNADNA测序；测序；测序；测序； 5 51010万个基因，万个基因，万个基因，万个基因，3030亿个碱基对，目前最有效的亿个碱基对，目前最有效的亿个碱基对，目前最有效的亿个碱基对，目前最有效的DNADNA序列分析仪，序列分析仪，序列分析仪，序列分析仪，1010小小小小时时时时/ /次；可同时电泳次；可同时电泳次；可同时电泳次；可同时电泳2424个样品；速度个样品；速度个样品；速度个样品；速度12001200碱基对碱基对碱基对碱基对/ /小时，提高速度小时，提高速度小时，提高速度小时，提高速度100100支毛细管阵列电泳；速度支毛细管阵列电泳；速度支毛细管阵列电泳；速度支毛细管阵列电泳；速度280280碱基对碱基对碱基对碱基对/ /小时小时小时小时/ /支支支支
