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1、由于微生物细胞极其微小，研究其个体生长存在由于微生物细胞极其微小，研究其个体生长存在着技术上的困难。着技术上的困难。同步生长同步生长的概念：一个细胞群体中各个细胞都在同的概念：一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进行分裂的状态，称为同步生长一时间进行分裂的状态，称为同步生长（synchronousgrowth），进行同步分裂的细胞称，进行同步分裂的细胞称为为同步细胞。同步细胞。同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相，彼此间形态、生化特征都很一致，因而是细胞学、相，彼此间形态、生化特征都很一致，因而是细胞学、生理学和生物化学等研究的良好材料。生理
2、学和生物化学等研究的良好材料。第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律一、微生物的个体生长和同步生长一、微生物的个体生长和同步生长获得同步生获得同步生长的方法：长的方法：获得同步生长的方法主要有两类：获得同步生长的方法主要有两类：环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。造成与正环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。造成与正常细胞周期不同的周期变化。常细胞周期不同的周期变化。选择法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，选择法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。不影响细胞代谢。Helmstetter-Cummings（硝酸纤维素薄膜）（硝酸纤维素薄膜）法法
3、步骤：步骤：将非同步的细菌液体培养物通过微将非同步的细菌液体培养物通过微孔滤膜，让细胞吸附于其上；然后将滤膜孔滤膜，让细胞吸附于其上；然后将滤膜反置，再以新鲜培养液滤过。这时，一些反置，再以新鲜培养液滤过。这时，一些未粘牢的细胞先被冲洗掉，接着脱落到培未粘牢的细胞先被冲洗掉，接着脱落到培养液中的都是那些新分裂形成的细胞，于养液中的都是那些新分裂形成的细胞，于是就获得了同步生长是就获得了同步生长 二、微生物的群体生长二、微生物的群体生长1.1.无分支单细胞微生物的群体生长特征无分支单细胞微生物的群体生长特征无分支单细胞微生物主要包括细菌和酵母菌，无分支单细胞微生物主要包括细菌和酵母菌，其群体生长
4、是以群体中细胞数量的增加来表示的，其群体生长是以群体中细胞数量的增加来表示的，由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔称为由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔称为世代世代，一，一个世代所需的时间就是个世代所需的时间就是代时（代时（enerationtime,G），代时也就是群体细胞数目扩大一倍所需代时也就是群体细胞数目扩大一倍所需时间，有时也时间，有时也称为称为倍增时间倍增时间。右图表示的是一个细胞经过若干代分裂右图表示的是一个细胞经过若干代分裂后的情况。右图可见，每经过一个代时，后的情况。右图可见，每经过一个代时，细胞数目就增加一倍，呈指数增加，因而细胞数目就增加一倍，呈指数增加，因而被称为被称
5、为指数生长指数生长，这，这就是就是单细胞群体生长单细胞群体生长的特征。的特征。2.无分支单细胞微生物的群体生无分支单细胞微生物的群体生长曲线长曲线以细菌为例介绍无分支单细胞微生物群体生长规以细菌为例介绍无分支单细胞微生物群体生长规律，其结论也基本适用于酵母菌。律，其结论也基本适用于酵母菌。生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、分裂直至死亡的整个动态变化过程。分裂直至死亡的整个动态变化过程。每种细菌都有各自的典型生长曲线，但它们的每种细菌都有各自的典型生长曲线，但它们的生长过程却有着共同的规律性。一般可以将生长生长过程却有着共同的规律性。一般可以将生
6、长曲线划分为四个时期。曲线划分为四个时期。将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。生长曲线的制作生长曲线的制作典型的生长曲线典型的生长曲线 （Growth curve）延延滞滞期期对对数数期期稳定期稳定期衰亡期衰亡期延滞期（延滞期（lag phase）其它名称：停滞期、调整期、适应期其它名称
7、：停滞期、调整期、适应期1.现象：现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。活菌数没增加，曲线平行于横轴。2.特点：特点：生长速率常数生长速率常数=0细胞形态变大或增长细胞形态变大或增长细胞内细胞内RNA特别是特别是rRNA含量增高，原生质嗜碱性增强含量增高，原生质嗜碱性增强合成代谢活跃（核糖体、酶类、合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快），易产生诱合成加快），易产生诱导酶导酶对外界不良条件敏感，（如氯化钠浓度、温度、抗生素等化对外界不良条件敏感，（如氯化钠浓度、温度、抗生素等化学药物）学药物）3.原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必
8、要的中间产物认识延迟期的特点及形成原因对实认识延迟期的特点及形成原因对实践的践的指导意义：指导意义：在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期；在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期；在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌菌种：菌种：繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短；繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短；接种物菌龄接种物菌龄：用对数生长期的菌种延迟期较短；：用对数生长期的菌种延迟期较短；接种量：一般来说，接种量：一般来说，接种量增大可缩短甚至消除接种量增大可缩短甚至消除延迟期（延迟期（发酵工业上一般采用发酵工业上一般采用1/101/10的接种量）；的接种量）；培养基成分：
9、培养基成分：在营养成分丰富的天然培养基上在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；接种接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。基接近。影响延迟期长短的因素：影响延迟期长短的因素：对数期（对数期（logarithmic phase）其他名称：指数期其他名称：指数期现象：现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。 特点：特点：生长速
10、率常数最大，即代时最短生长速率常数最大，即代时最短细胞进行细胞进行平衡生长平衡生长，菌体大小、形态、生理特征等比较一菌体大小、形态、生理特征等比较一致致代谢最旺盛代谢最旺盛细胞对理化因素较敏感细胞对理化因素较敏感指数生长可以用下式表示：指数生长可以用下式表示： b = Bb = B2 2n nB, b B, b 和和 t t 可由试验获得，可由试验获得， n n 可通过上式可通过上式计算得出，将等式两侧取对数重排后得：计算得出，将等式两侧取对数重排后得：lgb=lgB+nlg2n=lgb-lgB=lgb-lgBlg20.301式中：式中：B B 为起始细胞数目，为起始细胞数目，b b 为指数生
11、长某个时刻为指数生长某个时刻 t t 时的细胞数目，时的细胞数目，n n 为世代数为世代数例如：一培养液中微生物数目由开始的例如：一培养液中微生物数目由开始的12,000（B），），经经4h(t)后增加到后增加到49,000,000（b），这样，），这样，n(lg4.91070lg1.2104）0.30112借助于借助于n和和t，还可以计算出不同培养条件下的，还可以计算出不同培养条件下的代代时时G，Gt/n在本例中，在本例中，G460/1220min该种微生物的代时为该种微生物的代时为20分钟。在分钟。在4小时内共繁殖了小时内共繁殖了12代。代。代时在不同种微生物中的变化很大，多数微生物代时在
12、不同种微生物中的变化很大，多数微生物的代时为的代时为13h,然而有些快速生长的微生物的代时还然而有些快速生长的微生物的代时还不到不到10min,而另一些微生物的代时却可长达几小时而另一些微生物的代时却可长达几小时或几天；或几天；另外，同一种微生物，在不同的生长条件另外，同一种微生物，在不同的生长条件下其代时的长短也不同；但是，在一定条件下，每下其代时的长短也不同；但是，在一定条件下，每一种微生物的代时是恒定的，因此它是微生物菌种一种微生物的代时是恒定的，因此它是微生物菌种的一个重要特征。的一个重要特征。 代时能够反应细菌的生长速率，代时短，生长代时能够反应细菌的生长速率，代时短，生长速率快，代
13、时长，生长速率慢。速率快，代时长，生长速率慢。在很多微生物学在很多微生物学研究中常常要了解微生物的代时。研究中常常要了解微生物的代时。一些细菌的代时一些细菌的代时菌名菌名培养基培养基 培养温度培养温度 代时代时E. coli（大肠杆菌）（大肠杆菌） 肉汤肉汤 3717minE. coli 牛奶牛奶 3712.5Enterobacter aerogenes（产气肠细菌）（产气肠细菌）肉汤或牛奶肉汤或牛奶 37 1618E. aerogenes 组合组合 372944B. Cereus（蜡状芽孢杆菌）（蜡状芽孢杆菌）肉汤肉汤3018B. thermophilus（嗜热芽孢杆菌）（嗜热芽孢杆菌）肉汤
14、肉汤5518.3Lactobacillus acidophilus（嗜酸乳杆菌）（嗜酸乳杆菌） 牛奶牛奶376687Streptococcus lactis（乳酸链球菌）（乳酸链球菌）牛奶牛奶3726S. lactis 乳糖肉汤乳糖肉汤3748Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌）（伤寒沙门氏菌）肉汤肉汤3723.5Azotobacter chroococcum（褐球固氮菌）（褐球固氮菌） 葡萄糖葡萄糖2534446Mycobacterium tuberculosis（结核分枝杆菌）组合（结核分枝杆菌）组合3779293Nitrobacter agilis（活跃硝化杆菌）（活跃硝化杆
15、菌）组合组合271200应用意义应用意义：由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体的最适菌龄；由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体的最适菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄；发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期是生理代谢及是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等遗传研究或进行染色、形态观察等的良好的良好材料材料。影响代时的因素：影响代时的因素：菌种菌种营养成分营养成分营养物浓度营养物浓度培养温度培养温度(在微生物的最适生长温度范围时，代时就短。在微生
16、物的最适生长温度范围时，代时就短。 )营养物浓度与对数期生长速率和营养物浓度与对数期生长速率和产量产量作用方式：影响微作用方式：影响微生物的生长速率和生物的生长速率和总生长量总生长量生长限制因子生长限制因子生长限制因子生长限制因子：凡：凡是处于较低浓度范是处于较低浓度范围内，可影响生长围内，可影响生长速率和菌体产量的速率和菌体产量的营养物就称生长限营养物就称生长限制因子制因子8.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml0.1mg/ml只最大收只最大收获量受影响获量受影响生长速度和最大生长速度和最大收获量受影响收获量受影响时间时
17、间稳定期（稳定期（stationary phase）又称：恒定期或最高生长期又称：恒定期或最高生长期特点：特点：新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，微生物微生物的的生长速率处于动态平衡，培养物中的细胞数目达到最高值。生长速率处于动态平衡，培养物中的细胞数目达到最高值。细胞分裂速度下降，开始积累内含物，产芽孢的细菌开始产细胞分裂速度下降，开始积累内含物，产芽孢的细菌开始产芽孢。芽孢。微生物开始微生物开始合成次生代谢产物合成次生代谢产物，对于发酵生产来说，一般在，对于发酵生产来说，一般在稳定期的后期产物积累达到高峰，是最佳的收获时期。稳定期的后期产物积累
18、达到高峰，是最佳的收获时期。产生原因：产生原因：营养物尤其是生长限制因子的耗尽营养物尤其是生长限制因子的耗尽营养物的比例失调，如碳氮比不合适营养物的比例失调，如碳氮比不合适;有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等）有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等）物化条件（物化条件（pH、氧化还原势等）不合适、氧化还原势等）不合适;应用意义：应用意义：(1)(1)发酵生产单细胞蛋白、乳酸的最佳收获期发酵生产单细胞蛋白、乳酸的最佳收获期(2)(2)是对某些生长因子例如维生素和氨基酸等进行生物测定是对某些生长因子例如维生素和氨基酸等进行生物测定的必要前提。的必要前提。(3)(3)促进了连续培养技术的产生和研究。促进
19、了连续培养技术的产生和研究。 应尽量延长此期，提高产量，措施如下：应尽量延长此期，提高产量，措施如下： 补充营养物质（补料）补充营养物质（补料）; ;调调pH; pH; 调整温度调整温度 生长产量常数（生长产量常数（Y，或生长得率，或生长得率，growthyield）：概念：表示微生物对基质利用效率的高低概念：表示微生物对基质利用效率的高低Y=菌体干重菌体干重/消耗营养物质的浓度消耗营养物质的浓度根据产量常数可确定微生物对营养物质的需要量根据产量常数可确定微生物对营养物质的需要量 如：如：Y=0.5Y=0.5，表示要得到，表示要得到5g5g菌体，需某营养物（葡萄菌体，需某营养物（葡萄 糖）糖）
20、10g10g。衰亡期（衰亡期（decline phase）特点：特点：细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中的活菌数目急剧下降，出现中的活菌数目急剧下降，出现“负生长负生长”。细胞内颗粒更明显，细胞出现多形态、畸形或衰退形，芽细胞内颗粒更明显，细胞出现多形态、畸形或衰退形，芽孢开始释放。孢开始释放。因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用，使菌体死亡、自因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用，使菌体死亡、自溶等，发生自溶的菌生长曲线表现为向下跌落的趋势。溶等，发生自溶的菌生长曲线表现为向下跌落的趋势。 有的细胞内多液泡，革兰氏染色反应为阳性
21、的变成阴性；有的细胞内多液泡，革兰氏染色反应为阳性的变成阴性；有的微生物在这时产生抗生素等次生代谢产物；有的微生物在这时产生抗生素等次生代谢产物； 衰亡期比其他各时期时间长，它的长短也与菌种和环境条衰亡期比其他各时期时间长，它的长短也与菌种和环境条件有关。件有关。产生原因：产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡3.微生物生长与代谢产物形成的关系微生物生长与代谢产物形成的关系微生物发酵形成产物的过程与微生物细胞生长的过程并不总是微生物发酵形成产物的过程与微生物细胞生长的过程
22、并不总是一致的。一般认为：一致的。一般认为：初级代谢初级代谢是给予生物能量和生成中间产物的过程，是给予生物能量和生成中间产物的过程，初级代谢初级代谢产产物物的形成往往与微生物细胞的形成过程同步，微生物生长的的形成往往与微生物细胞的形成过程同步，微生物生长的稳定期是这些产物的最佳收获时机；稳定期是这些产物的最佳收获时机；次级代谢产物次级代谢产物与微生物的与微生物的生存、生长和繁殖无关。生存、生长和繁殖无关。次级代谢产物的形成往往次级代谢产物的形成往往与微生物细胞的形成过程与微生物细胞的形成过程不同步。在分批培养中，不同步。在分批培养中，它们的形成高峰往往在微它们的形成高峰往往在微生物生长稳定期的
23、后期或生物生长稳定期的后期或衰亡期。衰亡期。lg细胞数或产物细胞数或产物浓度浓度时间时间细胞细胞产产物物I型型II型型三、连续培养三、连续培养（continuous culture）分批培养分批培养（batchculture）：将微生物置于一定容：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最后一次性收获。再补充和更换，最后一次性收获。连续培养连续培养（continuousculture）：在微生物培养：在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物
24、的发酵液，让培养的微生物长时含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。代谢活性处于某种稳定状态。连续培养连续培养理论基础理论基础：由于对典型生长曲线中稳定期：由于对典型生长曲线中稳定期到来原因的认识，采取相应有效措施推迟其来临，到来原因的认识，采取相应有效措施推迟其来临，从而发展出现在的连续培养技术。从而发展出现在的连续培养技术。连续培养技术连续培养技术恒浊恒浊培养培养概念：概念：通过调节培养基流速，通过调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连续使培养液浊度保持恒定的连续培养方法
25、。培养方法。原理原理：通过调节新鲜培养基流：通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度入的速度和培养物流出的速度来来维持菌浓度不变维持菌浓度不变,即浊度不即浊度不变变。主要采用恒浊器，当浊度。主要采用恒浊器，当浊度高时，使新鲜培养基的流速加高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则减慢培养基快，浊度降低，则减慢培养基的流速。的流速。特点：特点：基质过量，微生物始终基质过量，微生物始终以最高速率进行生长，以最高速率进行生长，并可在并可在允许范围内控制不同的菌体密允许范围内控制不同的菌体密度度；但工艺复杂，烦琐。；但工艺复杂，烦琐。使用范围：使用范围：用于生产大量菌用于生产大量菌体、生产与菌体
26、生长相平行体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。乙醇等。恒恒浊浊器器(turbidostat)连续培养技术连续培养技术恒恒化化培养培养恒化器恒化器(Chemostat)控制某一物质控制某一物质生长限制因子的浓度，设法恒定培养基流生长限制因子的浓度，设法恒定培养基流速。速。恒浊器与恒化器的比较恒浊器与恒化器的比较装置装置控制对象控制对象培养基培养基培养培养基流基流速速生长生长速率速率产物产物应用应用范围范围恒浊恒浊器器菌体密度菌体密度（内控制）（内控制）无限制无限制生长因生长因子子不恒不恒定定最高最高大量菌体或大量菌体或与菌体形成与菌体形成相平行的产相平
27、行的产物物生产生产为主为主恒化恒化器器培养基流培养基流速（外控速（外控制）制）有限制有限制生长因生长因子子恒定恒定低于低于最高最高不同生长速不同生长速率的菌体率的菌体实验实验室为室为主主连续发酵（连续发酵（continuous fermentation）连续培养在生产上的应用，相对于单批发酵而言。连续培养在生产上的应用，相对于单批发酵而言。优点：优点：高效：装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等单元操作；高效：装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等单元操作；自控：便于自动控制，产品质量稳定；自控：便于自动控制，产品质量稳定；节约：水、电、汽的负荷均衡合理。节约：水、电、汽的负荷均衡合理。缺点：缺点：菌种易于退
28、化；菌种易于退化；易于遭到杂菌污染；易于遭到杂菌污染；营养物利用率低于单批培养；营养物利用率低于单批培养；生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月1年。年。四、四、高密度培养高密度培养1、定义工业发酵的基本目标是以最小的代价获得高质量的浓缩型菌体或代谢产物，而实现这一目标的工程手段之一是高密度培养技术(high cell density culture，HCDC)。HCDC没有确切的定义，是一个相对概念，指应用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较普通培养有显著的提高，最终提高特定产物的比生产率。2、HCDC优点与常规培养相比，HCDC在发
29、酵过程中有明显优势：1) 可以提高菌体的发酵密度，进而提高体积产率; 2) 可以缩小生物反应器体积，减少生产设备投资; 3) 强化下游分离提取，并在一定程度上减少废水量; 4) 综合提高比生产率，降低生产成本，并提高产品在市场上的竞争力。3、HCDC主要限制因素培养过程中底物对菌体生长的影响，具体体现在限制性底物(高浓度培养基)的抑制作用、不稳定性和挥发性底物/产物对菌体生长的影响(如产物的分解作用，二氧化碳的高溶解率以及热量和氧气的需求量等)、代谢产物或副产物的积累甚至还有培养基粘度等。4、HCDC的途径主要有透析培养、细胞循环培养、补料分批培养等，其中，后者是较为成熟和完善的技术。1) 透
30、析培养通过半透膜有效地去除培养室中有害的低分子量代谢产物，同时向培养液提供充足的营养物质的培养方式称为透析培养。透析培养不仅可以增加生物量的积累，大大降低营养物质的损失; 与微滤和超滤相比，在透析过程中透析膜不会被阻塞，并且可以很长时间维持其渗透性能。但是，由于反应器本身需要内嵌的透析膜或外在的透析组件、辅助泵及其它发酵罐等，透析培养的设备投资较大。2) 细胞循环培养通过某种方式将细胞保留在培养罐中加以循环利用的培养方式就是细胞循环培养。一般通过沉降、离心和膜过滤3种方式进行。膜过滤培养是发展较快的一种，它是连续培养和超滤的结合，它是在普通培养装置上附加一套膜过滤系统，用泵使培养液流过过滤器，
31、将菌体截留，滤液流出培养体系，并通过液面计控制流加泵添加新鲜的培养基，维持培养基体积不变。细胞循环可以除去抑制性代谢产物，可以用低浓度的培养基得到高的细胞密度，可以就地分离产物，有利于下游操作。3) 补料分批培养补料分批培养(又称流加培养)是根据菌株生长和初始培养基的特点，在分批培养的某些阶段以某种方式间歇地或连续地补加新鲜培养基，使菌体及其代谢产物的生产时间延长的培养方式。因此，它比其它培养方法具有更多的优越性。补料分批培养可以通过消除底物抑制，延长次级代谢产物的生产时间，稀释有毒代谢产物，最终达到细胞高密度培养，并降低染菌机率和避免遗传不稳定性。此外，还可以有效的控制菌体的浓度和粘度，延长发酵周期，提高溶解氧水平，进而有效的提高产物的发酵产量。5、总结在实际选用HCDC的途径时，要结合目标产物，全面考虑其收益和费用，以评价其可行性。在实验室中应用较为成功的是透析培养和膜过滤培养，作为发酵中的膜反应器，由于在放大过程中存在投资较大和别的实际障碍而很少投入工业化生产。补料分批培养只需进一步改进发酵工艺就可投入生产，因此它是现今被研究和应用最多的，特别适用于各种微生物的HCDC 。 请 提 宝 贵 意 见谢 谢
