2010年版药典一部生物安全性检查和生物活性测定法介绍

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1、20102010年版药典一部年版药典一部生物安全性检查和生物活性测定法介绍生物安全性检查和生物活性测定法介绍 20102010年版药典一部安全性检查内容介绍年版药典一部安全性检查内容介绍凡例凡例 动物试验(四十五)成方制剂和单味制剂成方制剂和单味制剂 四个品种附录附录 A 热原检查法 D细菌内毒素检查法 E异常毒性检查法* G过敏试验检查法* H 溶血与凝聚试验*附录附录 B 中药注射剂安全性检查法指导原则中药注射剂安全性检查法指导原则附录附录 C 中药生物活性测定指导原则中药生物活性测定指导原则凡例凡例-动物试验动物试验2005年版一部动物品系、年龄、性别应符合规定。尽量取代动物试验,减少动

2、物使用量。2010年版一部动物应健康。动物品系、年龄、性别、体重应符合规定。凡例凡例-动物试验动物试验实验动物的要求实验动物的要求应是取得实验动物生产资质的单位生产,动物应有合格证。动物应品系、年龄明确。动物性别、体重应符合试验需要。应有严格检疫制度。使用前应正常饲养至适应使用环境。应有动物处理制度。成方制剂和单味制剂成方制剂和单味制剂止喘灵注射液 异常毒性注射用双黄连(冻干) 溶血与凝聚、热原清开灵注射液 异常毒性、热原、溶血与凝聚注射用灯盏花素* 热原、过敏试验、降压物质、异常毒性、溶血与凝聚附录附录 A A 热原检查法热原检查法热原热原(Pyrogen ) :系指某些药品中含有的能引起体

3、温升高的杂质。来源:来源:临床上能够引起发热的物质如细菌内毒素、病毒、细菌,以及其他一些微生物、类固醇等。存在存在:无所不在,水、灰尘、生产药品的器皿中都存在热原质。性质性质:细菌内毒素是细菌细胞壁的一种化学成份,主要为脂多糖,致热性极强,具有耐热、耐酸碱、耐氧化剂,不易破坏,同时具有水溶性、不挥发性、滤过性,在药品生产过程中不易去除。不良反应不良反应:引起人体发冷、寒颤,然后引起发热,甚至昏迷和休克。附录附录 A A 热原检查法热原检查法2005年版药典供试用家兔体重 1.73.0kg,雌者应无孕。饲养:预测前7日的规定。淘汰: 饲养不正常者 供试品判为不合格者 使用超过10次者 2010年

4、版药典供试用家兔体重 1.7kg以上,雌者应无孕。饲养:预测前7日的规定。淘汰:饲养不正常者 供试品判为不合格者 不同点:体重无上限 使用次数不再规定10次建议:建议:附录附录 A A 热原检查法热原检查法家兔预选未曾使用过的家兔。供试品合格,但升温 0.6,休息达2周以上。3周内未曾使用的家兔。 预选条件应与正式实验一致。 休温应在38.0 39.6。 每一只8次测温最高与最低温差应不大于0.4附录附录 A A 热原检查法热原检查法2005年版药典试验环境条件实验室与饲养室温差不得大于5 ,且在17 25之间。实验过程中温度变化32010年版药典试验环境条件实验室与饲养室温差不得大于3 ,且

5、在17 25之间。实验过程中温度变化3附录附录 A A 热原检查法热原检查法实验操作过程试验前准备工作试验前准备工作:实验兔、相关器具除热原、供试品正式实验正式实验 家兔正常体温测定:体温38.0 39.6,且两次相差0.2。 供试品液准备:注射前配制,温热至约38 。 分组:三只家兔温度最好相近,组内温差不得过1 注射给药:15分钟内注射完毕,注意止血。 测定给药后的体温计算体温变化计算体温变化(升温为负值时以0计,注意数值修约)数值修约:四舍六入五成双 12.149812.1; 12.16 12.2 12.150001 12.2; 12.15 12.2; 12.45 12.4得出结论得出结

6、论附录附录 A A 热原检查法热原检查法结果判断(2005版)初试合格3只均0.6 ,且总和1.4需复试3只中有一只 0.6 ,或均不超过0.6 ,但总和1.4初试不合格3只中 0.6 的超过一只。复试合格5只中 0.6 不超过一只,或8只总和3.5 复试不合格5只中 0.6 超过一只,或8只总和 3.5 结果判断(2010版)初试合格3只均0.6 ,且总和1.3需复试3只中有一只 0.6 ,或总和 1.3初试不合格3只中 0.6 的超过一只复试合格5只中 0.6 不超过一只,或8只总和3.5 复试不合格5只中 0.6 超过一只,或8只总和 3.5 附录附录 A A 热原检查法热原检查法家兔的

7、重复使用供试品合格的家兔 至少休息48小时。升温 0.6 的家兔,至少休息2周以上,且通过预选合格。供试品不合格的家兔淘汰建议:关于升温的家兔建议:关于升温的家兔 关于降温的家兔关于降温的家兔 附录附录E E 异常毒性检查法异常毒性检查法异常毒性检查初试动物要求:1720g,5只。复试动物要求:1819g,10只。给药时间:各论下有规定者按各论项下规定时间, 否则按每只45秒。 结果观察:给药后观察48小时。结果判断:以动物是否死亡作为判定指标。附录附录F F 降压物质检查法降压物质检查法降压物质检查法对照品贮备液的配制: 磷酸组胺折算成组胺的系数0.342。 规定配制成1.0mg/ml,但最

8、好采用定容方法。 48 保存3个月内使用。将有沉淀析出改为经验证活性符合要求,验证方法:猫注射0.1g/kg,血压下降均值应不小于2.67kpa。对照品稀释液的配制: 配制浓度应根据供试品给药剂量(体积)来确定。实验前的准备工作:对照品、猫、仪器、试验通路联接、手术器具、麻 醉剂、供试品猫的麻醉及手术注意事项猫灵敏度测定: 0.05g/kg、 0.1g/kg、 0.15g/kg供试品降压物质检查:ds dT dT ds异常情况的处理异常情况的处理: :动物呼吸困难、动物有苏醒迹象、血压突然下降附录附录GG过敏试验检查法过敏试验检查法过敏物质检查法动物要求动物要求: 250 350g,雌者应无孕

9、,6只。致敏:致敏:腹腔注射给药0.5ml/只,间日一次,连续3次。激发:激发:首次致敏注射后的第14日和第21日,静脉注射1ml/只。结果观察:结果观察:激发后观察30分钟。建议观察60分钟。结果判断:结果判断:如有一只动物出现竖毛、发抖、干呕、连续喷嚏3声、紫癜和呼吸困难等现象中的2种或2种以上,或出现二便失禁、步态不稳或倒地、抽搐、休克,死亡现象之一者,判定供试品不符合规定。保证实验可靠的几点建议:保证实验可靠的几点建议: 设置空白、适当增加动物数、激发前的观察、饲养问题 对该试验的几点思考对该试验的几点思考:实验剂量、实验动物数、观察指标。附录附录H H 溶血与凝聚检查法溶血与凝聚检查

10、法2%兔红细胞混悬液配制操作法温育: 370.5 , 3小时。结果判断几个问题几个问题 试验剂量问题,结果判断问题试验剂量问题,结果判断问题 乳状液型注射液实验观察问题乳状液型注射液实验观察问题试管编号试管编号1样品样品2样品样品3颜色颜色4阴性阴性5阳性阳性2%兔红细胞混悬液ml2.52.52.52.50.9%氯化钠溶液ml2.22.24.72.5蒸馏水ml2.5供试品溶液ml0.30.30.3附录附录D D 细菌内毒素检查法细菌内毒素检查法细菌内毒素(细菌内毒素(Endotoxin) 革兰氏阴性细菌细胞壁的组成成分,具有多种生物活性, 其化学结构是脂多糖(LPS)。生物活性生物活性 致热性

11、 、与鲎试剂反应特点特点广泛存在、非常稳定、具有疏水性和亲水性的两性分子致热活性的高度不均一性细菌内毒素标准品细菌内毒素标准品 参考标准品(国际 国家标准品) 国家工作 标准品 企业工作品 附录附录D D 细菌内毒素检查法细菌内毒素检查法鲎试剂鲎试剂 鲎血液变形细胞裂解物冷冻干燥制备而成规格规格: 0.1ml; 0.5ml.灵敏度灵敏度() 对鲎试剂灵敏度的正确理解。鲎试剂的灵敏度复核 细菌内毒素工作标准液的配制:2、1/2、1/4 鲎试剂的复溶:按标示规格复溶,不得稀释或浓配。 加样操作 结果判断附录附录D D 细菌内毒素检查法细菌内毒素检查法灵敏度复核结果实验成立与否的判断结果计算方法:c

12、=anitlg(X/4) X为反应终点的对数(lg)值。不需要计算的几种情况不需要计算的几种情况内毒素浓度(内毒素浓度(EU/ml)21/21/41/4反 1 + +-应 2 + +-管 3 + +-号 4 + +-附录附录D D 细菌内毒素检查法细菌内毒素检查法细菌内毒素的常规检查例1:取本品,用细菌内毒素检查用水至少稀释20倍后,依法检查,本品每1ml中含有的内毒素应小于1. 25EU。 L=1.25EU/ml MVD=CL/-20=11.25EU/ml/ =0.625EU/ml 供试品液配制: 样品液 稀释稀释10倍倍 稀释20倍。 内毒素工作标准品配制 120EU/支 ,150601-

13、200963。 120EU(1支) 1.0ml( 120EU/ml) 120EU/ml 0.25EU/ml(4) 0.125EU/ml(2) 供试品阳性对照液 内毒素液 0.5ml 0.25EU/ml 0.125EU/ml(2,20倍稀释液) 上样品10倍稀释液 0.5ml 例2:某样品规格1g 细菌内毒素 取本品,依法检查,每1mg中含内毒素量应小于0.1EU介绍一种简便的操作方法介绍一种简便的操作方法中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草静脉用注射剂静脉用注射剂 热原、异常毒性、溶血与凝聚、过敏反应、降压物质(非降压药)。 可考查建立细菌内毒素检查法。

14、肌肉用注射剂肌肉用注射剂 异常毒性、过敏反应。 中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草热原标准起草热原标准起草 剂量设定:临床成人1小时内最大用量的35倍。 考虑几点: 毒性、干扰、药物本身具有解热性问题。供试液浓度确定:考虑两点: 溶血、刺激性。注射体积确定:标准文字表述:异常毒性标准起草异常毒性标准起草剂量设定:应低于最低致死量,1/3LD1或者1/4LD50。 建议:最好低于明显出现药物本身毒性的剂量。 根据临床用药量来确定。标准文字表述:中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草降压物质检查标准起草降压物质检查标准

15、起草本身为降压药物不用设置降压物质检查标准。剂量设定:指导原则定得太宽,操作性很强。 无降压作用的药品: 临床单次用量的1/55倍; 有一定降压作用的药品:最大无降压反应的1/4 1/2。 供试品临床原液注射1ml/kg无降压反应,可以此作剂量。 建议:按临床用量来设定,考虑毒性问题。 供试液浓度确定:溶血、刺激性。 给药体积确定: 标准文字表述:中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草过敏反应标准起草过敏反应标准起草 豚鼠毒性试验剂量设定:在考虑毒性的基础上,剂量应尽可能大, 同时考虑临床用量。 致敏次数及激发时间:应当作研究,而不是完全按试验 方法规定次

16、数与时间来操作。 中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草溶血与凝聚标准起草溶血与凝聚标准起草实验方法问题:取样量、供试液。结果判断问题:振摇引起的争议。个人提出的修改方法 建议以此作为内控标准。供试液配制试验剂量结果观察结果判断中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草细菌内毒素检查标准起草细菌内毒素检查标准起草举例:某中药注射液用法与用量静脉滴注:一日2040ml,以10%葡萄糖注射液200ml 或氯化钠注射液100ml稀释后使用。(一)内毒素限值确定一)内毒素限值确定:L=K/M 5EU/(kg.h) = = 7.5E

17、U/ml 40ml/60kg.h需要考虑的因素:5EU/(kg.h)只是理论数值,以此给家兔,有一半体温上升; 临床联合用药;注射器、输液器含内毒素,人体内含有的内毒素。 最后可以确定内毒素限值为 L=4EU/ml。 *体表面积给药的计算:中国人体表面积按1.62m2计算。 比如:某药临床人用量为100mg/m2 则 100mg/m 21.62m2=162mg 162mg/60kg=2.7mg/kg中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草细菌内毒素检查标准起草细菌内毒素检查标准起草(二)预试验(二)预试验 供试液配制成一系列浓度:可采用对倍稀释法。 原液、2

18、倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍稀释液 鲎试剂(TAL) 灵敏度为 细菌内毒素工作标准品液配制:2浓度 加样试验 编号编号 原液原液 2 2倍倍 4 4倍倍 8 8倍倍 1616倍倍 3232倍倍 6464倍倍 128 128倍倍 2内毒素内毒素 BET BET水水 中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草细菌内毒素检查标准起草细菌内毒素检查标准起草预试验结果 编号编号 原液原液 2 2倍倍 4 4倍倍 8 8倍倍 1616倍倍 3232倍倍 6464倍倍 128 128倍倍 2内毒素内毒素 BET BET水水 (三)正式实验(三)正式实验

19、比如预试验稀释16倍就可能没有干扰作用。鲎试剂确定 =0.25EU/ml细菌内毒素液配制: 2 、 、1/2 、1/4四个浓度加样操作中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草供试液组内毒素 0.5 0.25 0.125 0.0625 阴性对照阴性对照 BET水组内毒素 0.5 0.25 0.125 0.0625 阴性对照阴性对照 中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草细菌内毒素检查标准起草 正式实验结论:(四)标准起草(四)标准起草 供试液:PH最好在68, 标准规定用缓冲液或酸碱来调节PH值 建议:能用BET水稀释达到

20、要求的就不用缓冲液或酸碱调节(五)常规检查(验证)(五)常规检查(验证) ( (六六) )介绍一种简单的半定量法介绍一种简单的半定量法 比如:某透析液L=2EU/ml,合格.想要了解大致内毒素含量。 假设样品液即无干扰作用。则 鲎试剂 1EU/ml 0.5EU/ml 0.25EU/ml 0.125EU/ml 0.0625EU/ml20102010年版一部注射剂安全性检查介绍年版一部注射剂安全性检查介绍总总 结结广义的注射剂安全性狭义的注射剂安全性2010版药典一部安全性检查的特点: 变化大,增加多,剂量要求更明确 安全性检查还存在的问题 方法并不完善 剂量设定要求上还存在不足 中药生物活性测定

21、指导原则中药生物活性测定指导原则生物活性 也可以说就是药物的有效性。中药生物活性成份的筛选 中药提取分离,精制后,通过药理药效学试验进行筛选。 通过查阅已有的研究资料来确定。目前复方中成药标准中含量测定成份未必就是生物活性成份。中药生物活性测定指导原则中药生物活性测定指导原则 中药生物活性测定 就是通过测定生物效应,用统计的方法得出生物效价或生物活性大小的一种方法。 举例:缩宫素效价测定中药生物活性测定的重要性 含量很高,但未必就存在生物效应。 举例:甘露聚糖肽含量测定与活性测定中药生物活性测定指导原则中药生物活性测定指导原则中药生物活性测定的基本原则 符合药理学研究基本原则 随机、对照、重复

22、;作为标准还应相对简单、易操作。 举例:缩宫素效价测定量反应平行线测定随机区组设计(2,2)法 A、B、C、D, B、C、D、A, C、D、A、B, D、A、B、C 绒促性素效价测定量反应平行线测定随机设计(3,3,3)法体现中医药特点 拟建立的测定指标应与该中药的“功能主治”相关。 一点个人看法品种选择合理 选的品种功能主治应明确,优先考虑症明确的品种。方法科学可靠 优先考虑效价测定,其次考虑生物活性测定。中药生物活性测定指导原则中药生物活性测定指导原则基本内容1、实验条件试验系选择 根据中药的药效来确定。供试品选择 工艺稳定,质量合格。标准品或对照品2、 实验设计设计原理 客观、专属性强、

23、重现性好,能反应功能主治设计类型 效价测定、活性测定。剂量设计 效价测定应与标准品或对照品等效。 生物活性测定应产生明显的生物效应。给药途径 最好与临床一致。给药次数 参照药效学与临床用药指标选择 功能主治中的指标。中药生物活性测定指导原则中药生物活性测定指导原则方法学验证1、测定方法的影响因素考察 作为标准最重要的是准确、客观、影响因素少,重复性好。2、精密度考察 进行重复性、中间精密度、重现性考察3、方法适用性考察 用起草的方法多批次进行测定,考察该方法有没有适用性。中药生物活性测定指导原则中药生物活性测定指导原则举例:灯盏花素注射液的生物活性测定目的目的:采用生物活性测定法加强控制灯盏花

24、素注射液的质量。方法:方法:取清洁级大鼠,体重180200g,雄性,用YLS-14B血栓生成仪,将刺激电流控制在1mA,电刺激时间定为3min,建立大鼠单侧颈总动脉血栓形成实验动物模型来评价灯盏花素注射液的活血化淤的功能。结果:结果:比较大鼠颈总动脉单侧血栓全阻时间,可作为生物活性测定的指标。结论:结论:该方法准确,可靠。 (本研究由湖南省药品检验所 欧阳杰湖、潘善庆、陈子渊完成)中药生物活性测定指导原则中药生物活性测定指导原则举例举例:水蛭水蛭含量测定含量测定 取本品粉末约1g,精密称定,精密加入0.9%氯化钠溶液5ml,充分搅拌,浸提30分钟,并时时振摇,离心,精密量取上清液100l,置试管中,加入0.5%牛纤维蛋白原(以凝固物计)的三羟基甲烷盐酸缓冲液(临用配制)200l,摇匀,置水浴中370.5温浸5分钟,滴加凝血酶溶液,至凝固,记录消耗凝血酶溶液体积,计算。 中和一个单位的凝血酶的量,为一个抗凝血酶活性单位. 本品每1g含抗凝血酶活性水蛭应不低于16.0U;蚂磺、柳叶蚂蟥应不低于3.0U.谢谢大家!谢谢大家!

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