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1、第十八章第十八章 植物转基因技术植物转基因技术 植物转基因技术：植物转基因技术： 又称基因重组技术或又称基因重组技术或DNA重组，重组，即将人工分离和修饰过的基因导入植即将人工分离和修饰过的基因导入植物基因组中，通过导入基因的表达从物基因组中，通过导入基因的表达从而引起植物体性状的可遗传的修饰。而引起植物体性状的可遗传的修饰。凡是外源凡是外源DNADNA导入细胞的过程都可导入细胞的过程都可以泛称为转化，包含以下内容：以泛称为转化，包含以下内容： 直接转化；直接转化； 介导转化；介导转化； 直接转化直接转化 是将裸露的是将裸露的DNADNA直接导入植物细胞的转化方法。直接导入植物细胞的转化方法。
2、 这种裸露的这种裸露的DNADNA可以是全部或部分染色体，分可以是全部或部分染色体，分离的离的DNADNA，也可以是基因工程质粒；也可以是基因工程质粒；介导转化介导转化 介导转化是利用另一种生物来实现基因介导转化是利用另一种生物来实现基因的转入和整合。的转入和整合。 目前使用的主要是根瘤农杆菌、发根农杆目前使用的主要是根瘤农杆菌、发根农杆菌等土壤农杆菌，转化效率较高。菌等土壤农杆菌，转化效率较高。直接转化与介导转化都涉及以下三方面直接转化与介导转化都涉及以下三方面: :1 1、遗传物质导入植物细胞；、遗传物质导入植物细胞；2 2、外源、外源DNA在植物基因组中的稳定整合；在植物基因组中的稳定整
3、合；3 3、转基因植株的再生。、转基因植株的再生。一一 、直接转化、直接转化一一)目的基因的获得：目的基因的获得：(1)直接从目的生物直接从目的生物(即供体生物即供体生物)的基因组中用机的基因组中用机械械(如超声波如超声波)或限制性内切酶切断后分离出来或限制性内切酶切断后分离出来 。(2)通过反转录酶作用通过反转录酶作用,以以mRNA为模板为模板,经反转录成经反转录成为互补为互补DNA(即即cDNA)。(4)通过建立核基因库通过建立核基因库，然后从基因库中筛选然后从基因库中筛选并扩增出目的基因。并扩增出目的基因。(3)在体外用化学合成和酶促合成的方法来获在体外用化学合成和酶促合成的方法来获得目
4、的基因。得目的基因。 二）目的基因的修饰，构成嵌合基因：二）目的基因的修饰，构成嵌合基因： 嵌合基因中必有启动子（如花椰菜病毒的嵌合基因中必有启动子（如花椰菜病毒的35s35s亚基启动子、亚基启动子、19s19s亚基启动子），目的基因亚基启动子），目的基因及终止子。及终止子。三）嵌入标记基因或报告基因：三）嵌入标记基因或报告基因： 应用较广的是应用较广的是 GUS GUS 基因；绿色荧光蛋白基因。基因；绿色荧光蛋白基因。 基因枪法：基因枪法： 微弹为微弹为0.2-2.0um0.2-2.0um的钨粉或者金粉，用超声波使外源的钨粉或者金粉，用超声波使外源 DNADNA液均匀的包裹钨粉微粒手枪原理射
5、击。液均匀的包裹钨粉微粒手枪原理射击。四）直接转化的方法：四）直接转化的方法： 电穿孔转化法：电穿孔转化法： 用短时高脉冲电处理可导致细胞膜出现可恢复性孔隙，用短时高脉冲电处理可导致细胞膜出现可恢复性孔隙， 从而发生的渗透点从而发生的渗透点3 34nm4nm为外源为外源DNADNA进入细胞提供通路。进入细胞提供通路。 PEG转化法：转化法： PEG转化法和转化法和PEGPEG诱导原生质体融合方法相似，诱导原生质体融合方法相似，同样需要高钙、同样需要高钙、高高pHpH条件从而将外源条件从而将外源DNADNA插入原生插入原生质体并整合。质体并整合。五）、转化基因材料的分析与鉴定五）、转化基因材料的
6、分析与鉴定（1 1）GUS 测定：测定： GUSGUS基因的表达产物是葡糖苷酸酶，基因的表达产物是葡糖苷酸酶，它可分解葡糖苷酸，葡糖苷酸被分解后它可分解葡糖苷酸，葡糖苷酸被分解后形成蓝色产物使植物组织成为蓝色。形成蓝色产物使植物组织成为蓝色。（2 2）southern southern 杂交法：杂交法： 用放射性同位素用放射性同位素3232P P标记一段标记一段DNADNA分子及探分子及探针针, ,与转化植物或其他被分析个体的总与转化植物或其他被分析个体的总DNADNA杂杂交交, ,可以探测转化植物是否含有与探针同源可以探测转化植物是否含有与探针同源的的DNADNA序列序列, ,通过放射自显影
7、可看到杂交片断通过放射自显影可看到杂交片断并测分子量大小。并测分子量大小。（3 3）蛋白质杂交技术：）蛋白质杂交技术： 蛋白质抗原与其相应的特异抗体相结合。蛋白质抗原与其相应的特异抗体相结合。（4 4）PCRPCR反应：反应： 根据已知转化基因或标记基因顺序设计引物，根据已知转化基因或标记基因顺序设计引物，（5 5）遗传分析：）遗传分析： 观察基因是否可以稳定遗传给下一代。观察基因是否可以稳定遗传给下一代。（6 6）鉴定转化基因的功能。）鉴定转化基因的功能。实例实例 小麦的基因枪转化小麦的基因枪转化1 1、试验材料：小麦幼胚（开花后、试验材料：小麦幼胚（开花后10101212天）天）2 2、质
8、粒的制备：转化所用质粒为、质粒的制备：转化所用质粒为pABH9pABH9，该质粒该质粒插入插入BADHBADH基因（表达产物是甜菜碱醛脱氢酶，提基因（表达产物是甜菜碱醛脱氢酶，提高植物细胞的调渗能力和耐盐性）和高植物细胞的调渗能力和耐盐性）和BARBAR基因（表基因（表达产物是达产物是PPTPPT已酰转移酶，抗除草剂已酰转移酶，抗除草剂PPTPPT，因此可因此可利用利用PPTPPT作为转化物的选择剂），由玉米启动子控作为转化物的选择剂），由玉米启动子控制，并含有制，并含有nosnos中止子。中止子。3 3、幼胚的高渗预培养：、幼胚的高渗预培养：4 4、微弹的制备与基因枪的轰击（无菌）：、微弹的
9、制备与基因枪的轰击（无菌）：5 5、抗、抗PPTPPT愈伤组织的选择：白色生长快的为愈伤组织的选择：白色生长快的为 外源质粒转化的愈伤（外源质粒转化的愈伤（见图见图）。）。6 6、抗、抗PPTPPT再生植株的获得：（再生植株的获得：（见图见图）实例实例 小麦的基因枪转化小麦的基因枪转化7 7、抗、抗PPTPPT转化植株的耐盐性：转化植株的耐盐性： 含盐含盐0.70.7NaClNaCl条件下转化植株表现较强的耐盐性。条件下转化植株表现较强的耐盐性。8 8、转化植株的壮苗、生根、移栽、传代。、转化植株的壮苗、生根、移栽、传代。9 9、转、转BADHBADH基因植株的分子检测：基因植株的分子检测：
10、根据已知的根据已知的BADHBADH结构基因设计引物用结构基因设计引物用PCRPCR法鉴定外源法鉴定外源 BADHBADH基因是否整合到小麦基因组中。也可以进一步用基因是否整合到小麦基因组中。也可以进一步用 Southern Southern 杂交验证。杂交验证。实例实例 小麦的基因枪转化小麦的基因枪转化 农杆菌是普遍存在于土壤中的抑制革农杆菌是普遍存在于土壤中的抑制革兰氏阴性菌，能在自然条件下趋化性的感兰氏阴性菌，能在自然条件下趋化性的感染大多数的双子叶植物的受伤部位，并诱染大多数的双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤（根瘤农杆菌）和发状根导产生冠瘿瘤（根瘤农杆菌）和发状根（发根农杆菌）。
11、（发根农杆菌）。 分别含有分别含有TiTi质粒和质粒和RiRi质粒。质粒。二、二、 农杆菌介导转化农杆菌介导转化一）土壤农杆菌的转化机理一）土壤农杆菌的转化机理 致致瘤瘤性（性（tumorinducing）是由是由Ti质粒上的质粒上的T-DNA所致所致（一）（一）.土壤农杆菌土壤农杆菌感染植物的过程：感染植物的过程：（二）、（二）、Ti质粒：质粒： Ti质粒的大小约质粒的大小约200kb左右，为双链环状左右，为双链环状DNA分子。分子。 含有含有T-DNA区、毒性区、质粒复制起点、区、毒性区、质粒复制起点、质粒结合转移位点和冠瘿碱分解位点质粒结合转移位点和冠瘿碱分解位点. 其中以其中以T-DN
12、A区和毒性区（区和毒性区（vir-region）在在植物转化中最为重要。植物转化中最为重要。T-DNAT-DNA区：能够转移整合入植物受体基因组，区：能够转移整合入植物受体基因组， 并能在植物细胞中表达，从而导致并能在植物细胞中表达，从而导致 冠瘿瘤发生。冠瘿瘤发生。VirVir区：由多个毒性基因组成，区：由多个毒性基因组成， 其编码蛋白对其编码蛋白对 T-DNAT-DNA的转移和整合的转移和整合 必不可少。必不可少。1.Ti质粒上的质粒上的T-DNA：章鱼碱合成酶胭脂碱合成酶农杆碱合成酶农杆菌素碱合成酶 仅存在于被感染植物细胞的细胞核中，仅存在于被感染植物细胞的细胞核中，整合整合到植物基因组
13、中到植物基因组中 ，T-DNA以单拷贝或多拷贝形以单拷贝或多拷贝形式插入植物基因组中式插入植物基因组中,插入的位点也各不相同。插入的位点也各不相同。T-DNA 从农杆菌的从农杆菌的 Ti 质粒转移到植物细胞中，接着质粒转移到植物细胞中，接着 T-DNA 整合到整合到细胞核基因组中进行表达，对宿主细胞进行遗传转化。细胞核基因组中进行表达，对宿主细胞进行遗传转化。在在 Ti 质粒的两端，质粒的两端，T-DNA有两个几乎完全相同的有两个几乎完全相同的 25bp 的重复。右端重复的重复。右端重复对于对于 T-DNA的转移和整合是必需的。的转移和整合是必需的。T-DNA 与植物基因组中的右接口拼接与植物
14、基因组中的右接口拼接相当精确，右边接口保留有相当精确，右边接口保留有 1-2bp 的右端重复，但左边接口处序列变化较的右端重复，但左边接口处序列变化较大，有大约大，有大约 100bp 以内的序列来自左边界。以内的序列来自左边界。2.Ti质粒适用于植物基因转化的质粒适用于植物基因转化的重要特性重要特性（或转化原理）：（或转化原理）：第一第一,保留保留T-DNA两端的末端序列两端的末端序列,然后用一段外源然后用一段外源DNA插人或直接取代野生型插人或直接取代野生型T-DNA的部分基因组的部分基因组,这段这段外源外源DNA仍然可以进入植物细胞仍然可以进入植物细胞,整合到植物的染色体整合到植物的染色体
15、组上组上（卸甲载体卸甲载体：disarmed vector）。）。其次，其次，T-DNAT-DNA的末端序列由的末端序列由2525个核苷酸序列组成，它们个核苷酸序列组成，它们的左右端序列都具有高度的同源性，并且末端序列对的左右端序列都具有高度的同源性，并且末端序列对T-T-DNADNA转移到植物细胞内具有重要意义转移到植物细胞内具有重要意义 。第三第三,毒性区是控制毒性区是控制T-DNA转移的，而且转移的，而且毒性毒性区对区对T-DNA的作用既可以以顺式的作用既可以以顺式(in cis)方式方式进行进行,又可以以反式又可以以反式(in trans)方式进行。方式进行。3、Ti质粒上的毒性区：质
16、粒上的毒性区： Ti质质粒粒的的毒毒性性区区约约有有30kb大大小小,由由7个个互互补补群群组组成成,分分别别命命名名为为VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG、 VirF和和VirH。 毒性区的大多数基因产物都控制毒性区的大多数基因产物都控制T-DNA的转移。在的转移。在这个区域内的突变往往导致土壤农杆菌感染植物的能这个区域内的突变往往导致土壤农杆菌感染植物的能力下降。力下降。Ti质粒衍生的载体系统质粒衍生的载体系统1 1删除生长素基因，细胞分裂素基因和冠瘿删除生长素基因，细胞分裂素基因和冠瘿2 2 碱基因，使质粒大大减小。碱基因，使质粒大大减小。2 2插入插入E.col
17、iE.coli复制原点，使复制原点，使TiTi质粒能在大肠质粒能在大肠3 3 杆菌中繁殖。杆菌中繁殖。3 3 具有选择型标记基因，便于转化体的筛选。具有选择型标记基因，便于转化体的筛选。4 4 含有多克隆位点，便于目的基因的克隆。含有多克隆位点，便于目的基因的克隆。二）、转化载体系统：二）、转化载体系统：Ti质粒载体系统一般分为两类：质粒载体系统一般分为两类： 一类叫共整合载体系统；一类叫共整合载体系统； 一类叫双元载体系统。一类叫双元载体系统。（一）、共整合载体质粒：（一）、共整合载体质粒：X：目的基因BL：左端重复序列BR：左端重复序列vir：毒性区1.pGV3850系系统统: 这这是是第
18、第一一个个非非致致癌癌的的Ti质质粒粒衍衍生生载载体体,来来自自胭胭 脂脂 碱碱 型型 质质 粒粒pTiC58Trac,包包括括25bp末末端端序序列列和和胭胭脂脂碱碱 合合 成成 酶酶 基基 因因 ,T-DNA上上的的其其它它基基因因则则为为pBR322序序列列取取代代。2.pGV2260系统系统: 来自章鱼碱型来自章鱼碱型Ti质粒质粒pTiB63,整个整个T-DNA序列连同序列连同25bp未端序列均未端序列均被一段被一段pBR322所所取代。取代。X：目的基因BL：左端重复序列BR：左端重复序列vir：毒性区大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌pBRpBR衍生物衍生物衍生物衍生物 这种系统需要
19、两个这种系统需要两个彼此分离的质粒彼此分离的质粒： 一个是多功能克一个是多功能克隆载体质粒，在大肠隆载体质粒，在大肠杆菌和土壤农杆菌中杆菌和土壤农杆菌中都能够复制都能够复制； 另一个是另一个是Ti衍生质衍生质粒粒,如如 pGV2260,可可以提供反式的毒性区以提供反式的毒性区功能功能,以便以便TDNA转移到植物中去。转移到植物中去。（二）、双元载体系统：（二）、双元载体系统： X：目的基因BL：左端重复序列BR：左端重复序列vir：毒性区大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌pBRpBR衍生物衍生物衍生物衍生物农杆菌转化过程：农杆菌转化过程：1 1对植物表面部位的识别和附着：植物伤口分泌对植物表面部
20、位的识别和附着：植物伤口分泌2 2 的酚类小分子物质可以诱导的酚类小分子物质可以诱导VirVir基因活化并表达。基因活化并表达。2 2T-DNAT-DNA进行复制和转移：进行复制和转移：VirVir产物能诱导产物能诱导TiTi质粒质粒3 3 复制产生一新的单链复制产生一新的单链T-DNAT-DNA分子，并使其转移到分子，并使其转移到4 4 植物细胞中。植物细胞中。3 3T-DNAT-DNA的整合：在的整合：在VirVir产物作用下，产物作用下，T-DNAT-DNA转入转入4 4 细胞核，并整合到植物染色体上。细胞核，并整合到植物染色体上。1 1 原生质体或悬浮细胞与农杆菌共培养原生质体或悬浮细
21、胞与农杆菌共培养2 2 叶盘转化法叶盘转化法3 3其它外植体转化法：如桃的茎断胚胎愈伤其它外植体转化法：如桃的茎断胚胎愈伤4 4 组织、核桃的体细胞胚、草莓的下胚轴等。组织、核桃的体细胞胚、草莓的下胚轴等。 4 4 整株感染法。整株感染法。实例：农杆菌介导的水稻基因转化实例：农杆菌介导的水稻基因转化1 1、水稻愈伤组织诱导：、水稻愈伤组织诱导： 以水稻成熟胚的盾片愈伤组织为转基因受体。以水稻成熟胚的盾片愈伤组织为转基因受体。2 2、菌株和质粒。、菌株和质粒。3 3、转化程序。、转化程序。转化后的转化后的GUSGUS的瞬间表达的瞬间表达转化后转化后3 3周产生的抗性愈伤组织周产生的抗性愈伤组织抗
22、性愈伤的抗性愈伤的GUSGUS反应反应再生的转化植株再生的转化植株转化植株叶片的转化植株叶片的GUSGUS表达表达抗性植株后代的抗性检测抗性植株后代的抗性检测第二节第二节 转基因植物转基因植物 自自1983年人类首次获得转基因植物后，已有大量年人类首次获得转基因植物后，已有大量的抗病、抗逆及品质改良的转基因植物获得成功，在农的抗病、抗逆及品质改良的转基因植物获得成功，在农业生产上已经发挥了重要的作用。在转基因技术基础上业生产上已经发挥了重要的作用。在转基因技术基础上发展起来的植物生物反应器展现了诱人的发展前景。发展起来的植物生物反应器展现了诱人的发展前景。1. 植物抗虫基因工程植物抗虫基因工程
23、 我国科学家成功地人工合成和改造的我国科学家成功地人工合成和改造的Bt基因转入基因转入花，获得了高抗棉铃虫的转基因棉花品种和品系。花，获得了高抗棉铃虫的转基因棉花品种和品系。2. 植物抗病基因工程植物抗病基因工程 中国农业科学院生物技术研究所成功将抗菌肽基因中国农业科学院生物技术研究所成功将抗菌肽基因导入马铃薯，获得抗青枯病的转基因株系；北京大学克导入马铃薯，获得抗青枯病的转基因株系；北京大学克隆了烟草花叶病毒隆了烟草花叶病毒TMV，黄瓜花叶病毒，黄瓜花叶病毒CMV等基因。等基因。3. 植物抗逆基因工程植物抗逆基因工程 我国在抗盐基因工程上已取得了一些进展，先后克我国在抗盐基因工程上已取得了一
24、些进展，先后克隆了脯氨酸合成酶、山菠菜碱脱氢酶、磷酸甘露醇脱氢隆了脯氨酸合成酶、山菠菜碱脱氢酶、磷酸甘露醇脱氢酶等耐盐相关基因，并获得了抗盐的转基因植物。酶等耐盐相关基因，并获得了抗盐的转基因植物。4. 植物品质改良的基因工程植物品质改良的基因工程 将编码必需氨基酸的基因转入马铃薯，获得含高必将编码必需氨基酸的基因转入马铃薯，获得含高必需氨基酸的马铃薯品系；将高赖氨酸基因导入玉米获得需氨基酸的马铃薯品系；将高赖氨酸基因导入玉米获得含高赖氨酸的转基因玉米；获得储存时间延长的转基因含高赖氨酸的转基因玉米；获得储存时间延长的转基因番茄。番茄。5. 植物叶绿体基因工程植物叶绿体基因工程 进行叶绿体遗传
25、转化研究，建立了烟草叶绿体遗传进行叶绿体遗传转化研究，建立了烟草叶绿体遗传转化体系。并将一些基因转入烟草叶绿体。转化体系。并将一些基因转入烟草叶绿体。6. 植物生物反应器植物生物反应器 利用转基因植物作为生物反应器生产药用蛋白，利利用转基因植物作为生物反应器生产药用蛋白，利用转基因植物生产口服疫苗，大大降低疫苗的生产成本。用转基因植物生产口服疫苗，大大降低疫苗的生产成本。基因工程育种的优点基因工程育种的优点 （1 1）基因资源丰富：植物、动物和微生物等；）基因资源丰富：植物、动物和微生物等；（）转入的某性状具连续性和整体性；（）转入的某性状具连续性和整体性；（）育种周期短，成本低；（）育种周期短，成本低；（）基因育种具不污染环境等优点；（）基因育种具不污染环境等优点；思思 考考 题题 1 1哪些因素会影响培养物的遗传变异？哪些因素会影响培养物的遗传变异？ 2 2体细胞无性系变异的诱导和选择方法。体细胞无性系变异的诱导和选择方法。 3 3常见的基因转化技术有哪些？常见的基因转化技术有哪些？
