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1、 第五章动物胚胎工程技术及体外受精 现代生物技术家畜育种领域繁殖生物技术分子生物技术人工授精技术胚胎工程技术 超数排卵和胚胎移植胚胎性别鉴定体外受精胚胎分割克隆技术试管婴儿o体外受精联合胚胎移植技术（IVF）o1978年英国专家steptoe和Edowrds定制了世界上第一个试管婴儿o1978年7月25日世界第一例试管婴儿Louis Brown在英国诞生。IVF的最早阶段妊娠成功率只有2.94。o大陆首例试管婴儿郑萌珠于1988年3月10日上午8点56分在北京医科大学第三医院诞生 第一节 胚胎工程技术o胚胎移植o胚胎融合o胚胎分割o胚胎的冷冻保存o早期胚胎培养o胚细胞核移植受精过程 分解放射冠
2、的卵泡细胞 水解局部透明带 精子细胞核和部分胞质进入卵母细胞卵裂及胚泡形成（第一周）卵裂(cleavage)受精卵由输卵管向子宫方向运行，并不断进行细胞分裂，受精卵早期的细胞分裂称卵裂；卵裂产生的子细胞呈球形，称卵裂球（blastomere）桑椹胚（morula）受精后第3天，形成了1216个卵裂球组成的实心胚，形似桑椹，称桑椹胚胚泡形成 受精后第46天桑椹胚细胞继续分裂，细胞间开始出现小腔隙，并逐渐汇合成一个大腔，桑椹胚转变为中空的泡状，称胚泡（blastocyst），胚泡由三部分组成： 胚泡滋养层胚泡腔内细胞群极端滋养层一、胚胎移植o受精卵移植n把一头雌性动物的早期胚胎从输卵管或子宫中冲洗
3、出来，移植到另一头雌性动物的输卵管或子宫内，使之继续发育成新个体的技术o供体n提供胚胎的动物o受体n接受和孕育胚胎的动物o初始阶段n1890-1900 W.Heape将安哥拉兔和荷兰兔的受精卵分别移植到比利时兔的输卵管内，分别获得仔兔2只n1900-1950 主要由英美科学家在家兔、绵羊、山羊小家畜方面研究，成功率35%左右o发展阶段n1950-1970 日本首次在牛胚胎移植上成功，之后日、美采用非手术法移植成功，胚胎移植成功率达70-80%胚胎移植的历史胚胎移植的历史o实用化初始阶段n 1970-1980 加美开始成立牛胚胎移植公司，1973年牛冻胚移植成功（英）o实用化研究阶段n 1982
4、- 大规模胚胎移植、核移植、嵌合体、胚胎分割、性别鉴定、体外受精在英美日德广泛开展，克隆羊诞生胚胎移植的历史胚胎移植的历史1.胚胎移植的生理学基础o成年母畜卵巢上存在数千到上万个卵泡，在外源激素作用下，每个发情期的卵泡发育和排卵数可达数十个o每个发情周期生殖器官都有一个孕向发育o早期胚胎处于游离状态o胚胎发育不存在免疫问题o胚胎发育到一定阶段会与子宫发生生理和组织联系o胚胎的遗传性不受受体的影响2. 胚胎移植的基本原则o胚胎移植前后所处的环境的同一性n供体和受体在分类学上的相同属性n动物生理上的一致性：受体和供体在发情时间上的同期性n动物解剖位置上的一致性：空间环境的一致性o胚胎的发育期限：必
5、须处于周期黄体期内o胚胎的质量：胚胎必须是正常的，并在处理过程中不受不良因素的影响3、胚胎移植o供受体的选择与管理o供体的超数排卵处理和配种o受体的同期发情处理o胚胎回收o胚胎检查o胚胎移植1）供受体的选择与管理o供体的选择n遗传价值：生产性能优秀的母畜n健康状况:身体健康，营养水平中等以上的未孕动物n繁殖性能：达到配种年龄以上繁殖机能正常的母畜o受体的选择n身体健康，身体状况中上的适繁未孕个体，无生殖道疾病和难产病史n繁殖状况正常，有正常的发情周期n母性良好：泌乳性能、护仔性能o供、受体的管理n防疫、记录n饲养管理等 2）同期发情（synchronization of eatrus）o采用激
6、素或类激素的药物处理，使这一群母畜在特定时间内集中发情和排卵o即将母畜的黄体期延长或缩短，使母畜摆脱内、外孕激素对卵巢的控制，在同一时间内引起全部母畜的卵泡发育，从而达到同期发情的目的o延长黄体期：孕激素 控制卵泡的生长发育和发情表现o缩短黄体期：前列腺素 加速黄体退化，使卵巢提前摆脱体内孕激素的控制o促进卵泡发育、排卵：促性腺激素 3）超数排卵o超排：以各种外源性促性腺激素诱发动物卵巢的许多卵泡发育并排出具有受精能力的卵子o孕母马促性腺激素、促卵泡素、前列腺素、促排卵类药物、孕激素o超数排卵处理的时期应选择在发情周期的后期，即黄体消退时期o个体对超排处理的反应效果难以预测o产生不良的后果：胚
7、胎死亡o卵母细胞蛋白质合成过程发生改变o生殖道机能产生影响4）胚胎回收o利用冲胚液从供体的生殖道中冲洗出来，提供移植或其它胚胎工程用o手术法o非手术法胚胎质量评价：o透明带的形态和完整性o胚胎的发育与胚龄是否一致o胚胎的形态与匀称性，胚内细胞大小的变化o细胞质的结构及颜色，胚内是否出现空泡，细胞碎片，有无游离细胞o如A级： 为优良胚胎，形态典型，卵裂球轮廓清晰，紧密充实，大小均一，细胞质致密，色调和分布均一6）胚胎的保存o胚胎的降温：使胚胎停止发育，延长其体外生存时间o体外培养：将胚胎置于体温条件下，在培养液中，使其继续发育o胚胎冷冻：通过一定的处理程序，将胚胎降温冷冻后，保存于液氮中胚胎冷冻
8、的原理o胚胎冷冻实际是脱水的过程，冷冻保存的关键是设法减少细胞内冰晶对胚胎的损伤o冷冻过程中，水分形成冰晶造成细胞机械损伤，同时，导致未结冰的细胞内溶液渗透压急剧升高，造成蛋白质变性，导致死胎o常规慢速冷冻法、玻璃化冷冻保持o受精卵移植o一般供体为良种或优良个体，而受体为生产性能较差的个体或品种。o“借劣质动物之腹怀优秀个体之胎”7）胚胎移植选择供体母牛受体母牛同期发情处理超数排卵供体公牛配种冲卵质量检查、培养胚胎移植妊娠检查分娩（胚胎移植的犊牛）胚胎移植的基本程序 8)胚胎移植的应用范围o在家畜改良方面的应用o在特定品种扩繁上的应用o在动物生物多样性上的应用o其它方面应用：转基因动物、性别控
9、制、体外受精在家畜改良方面的应用o人工授精技术可成几十到几百倍地提高了优秀种公畜的配种效能，但对优秀母畜来说，受其产仔数和世代间隔的限制，尤其是牛羊等繁殖力较低的畜种更是如此o通过超数排卵和胚胎移植技术（multiple ovulation and embryo transfer: MOET)牛羊的生长性状年遗传进展可比正常繁殖提高80%和70%；产奶性状提高33%在特定品种扩繁上的应用o牛羊等低繁殖力家畜，从引进到形成一个纯种群体需要7-8个世代，15-20年，而采用MEOT法，一次就可获得一个纯种群体o80年代初，美、澳、新从欧洲引进的大型肉牛品种均采用胚胎移植技术扩繁o2000年前后，我
10、国的波尔山羊也是采用胚胎移植进行扩繁的在动物生物多样性上的应用o在保护动物遗传资源，提高家畜生产性能，挽救濒临灭绝的野生动物方面，胚胎移植技术越来越发挥出重要作用o冷冻能够很好地保存濒临灭绝动物的胚胎或生殖细胞，但该种动物雌性个体的减少，也是这种动物的胚胎或生殖细胞无法得到移植，科学家开始研究在该种动物的亚种或亲缘种中试验，并取得一些成功，如斑马胚胎移植给马，蒙古马胚胎移植给驴，白肢野牛移植给荷斯坦牛其它方面应用o胚胎移植是克隆技术的必须过程o体外受精必须借助胚胎移植实现“试管婴儿的继续发育”o转基因及动物生物反应器的研究也必须借助胚胎移植二、胚胎分割技术1）概念 采用显微手术（机械方法）的方
11、法将早期胚胎分割成2分胚，4分胚或8分胚，经体内或体外培养后植入受体，以得到同卵双胎或同卵多胎的技术 胚胎分割以增加优秀遗传性状的动物数量为主要目的，可提高胚胎移植技术的效率和效益选择良好的桑椹胚或囊胚移入培养皿中，用分割针或分割刀片将其切开，吸出其中的半个胚胎注入透明带中或直接移植给受体2)基本过程：3）胚胎分割的理论依据o大多数哺乳动物早期胚胎属调整发育类型，去掉早期胚胎的一半，剩余的部分仍发育成完整的胚胎，至少在8细胞前，每个分裂球都有相同的发育能力o到晚桑椹胚时，胚胎发生初步分化，这时进行胚胎分割，可以重新发育到囊胚4）特点: 后代具有相同的遗传物质 胚胎克隆5）使用的主要仪器： 实体
12、显微镜和显微操作仪6）应用: 为转基因技术、性别控制技术提供活胚材料注意：对囊胚阶段的胚胎进行分割时，要将内细胞团均等分割原因：内细胞团一般到囊胚阶段才出现，它是发育为胚胎本身的基础细胞，其他细胞为滋养细胞，只为胚胎和胎儿发育提供营养。若分割时不能将内细胞团均等分割，会出现含内细胞团多的部分正常发育的能力强，少的部分发育受阻或发育不良，甚至不能发育等问题胚胎分割技术也是动物克隆的方法之一 胚胎分割的份数越多，操作的难度会越大，移植的成功率也越低 早期胚胎的体积很小，只有在显微镜下才能看到 细胞数目是有限的：分割的份数越多，不但难以做到均等分割，每一份的细胞数会越少，作为囊胚期的胚胎内细胞团细胞
13、所受的影响会更大 分割的份数越多，技术的难度会越大，移植后的恢复和发育的难度会越大，移植成功率自然会降低透明带对于分割胚体内外发育的影响o透明带作用：阻止异种动物精子受精和同种动物的多精子受精，保护受精卵在输卵管和子宫内正常运行，防止输卵管和子宫液的伤害及白细胞的吞噬，并使分裂阶段的卵裂球相互靠近，不致分离o胚胎分割时所处的发育阶段，对透明带的依赖性越强冷冻胚胎的影响o分割过程引起的透明带损伤和胚胎细胞数量减少，经冷冻和解冻在体内和体外的发育能力进一步降低，其移植妊娠率低于完整的冷冻胚胎三、胚胎嵌合体o由两个或两个以上具有不同遗传性状的细胞或细胞系组成的聚合胚发育而成的个体o原发性嵌合体o次生
14、型嵌合体1、方法o囊胚注入法n在动物胚胎发育到囊胚时，将目的细胞或细胞团注入囊胚腔，使之与内细胞团结合并发育，最终得到嵌合体个体o聚合法n全胚聚合法p将发育到一定时期的胚胎，去掉透明带后，将两个或两个以上的胚胎聚合在一起，形成一个胚胎后放入二氧化碳培养箱中培养至囊胚，再植入受体动物体子宫内n卵裂球聚合法p去掉透明带后将胚胎打散，从双方胚胎卵裂球中各取出一部分细胞进行聚合，培养后移植2、影响因素o胚胎的质量与状态nA级和B级胚胎o胚胎的发育时期n多采用8细胞早期胚胎聚合 四、胚胎细胞核移植将未着床的早期胚胎分散成单个的细胞，用电融合方法，使单个细胞与去除细胞核的未受精的成熟的卵母细胞融合，体外培
15、养发育成胚胎后，移入受体妊娠产子已在小鼠、兔、山羊、牛、猴等动物上成功五、性别控制与胚胎性别鉴定o动物的性别控制(sex control)技术是通过对动物的正常生殖过程进行人为干预，使成年雌性动物产出人们期望性别后代的一门生物技术oX、Y精子分离技术：流式细胞仪o胚胎性别诊断 早期胚胎的性别鉴定1）核型分析：分析部分胚胎细胞的染色体的组成2）SRY片段的PCR扩增Y染色体染色体上的特异上的特异片段片段3）H-Y抗原：雄性特异性弱组织相容性Y抗原o只有Y 精子才能表达H-Y抗原o利用H-Y 抗体检测精子质膜上存在的H-Y抗原，再通过一定的分离程序，就能将精子分离成H-Y+(Y精子)和H-Y-(X
16、精子)两类，将所需性别的精子进行人工受精，即可获得预期性别的后代o测定胚胎上H-Y抗原的存在与否对胚胎的性别作出鉴定意义o通过控制后代的性别比例，可充分发挥受性别限制的生产性状(如泌乳)和受性别影响的生产性状(如生长速度、肉质等)的最大经济效益o控制后代的性别比例可增加选种强度，加快育种进程o控制胚胎性别还可克服牛胚胎移植中出现的异性孪生不育现象，排除伴性有害基因的危害六、早期胚胎培养o发育阻断：早期胚胎停顿在某个特定发育时期，不能继续发育o时间随动物种不同而异o培养条件不完备o添加各种生长因子可促进胚胎发育o与某些体细胞共同培养 饲养性细胞，通过分泌某些有利于胚胎发育所需的营养因子第二节 体
17、外受精o体外受精(In Vitro Fertilization)是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术，英文简称为IVFo在生物学中，把体外受精胚胎移植到母体后获得的动物称试管动物(test-tube animal) 人工授精人工授精(AI)一、基本原理：人工模拟体内环境（包括营养、温度、pH等），使初级卵母细胞成熟，同时使精子获能，最终完成受精作用，并有计划地保存胚胎二、体外受精技术发展的历史 体外受精研究有100多年历史o1878年德国Sehenk在家兔和豚鼠进行了尝试o1954年张民觉获得首例体外受精兔o1963年金黄仓鼠体外受精获得成功，开创了精子体外获能成功
18、的先例o1990年我国钱菊芬获得首例试管山羊o旭日干、范必勤等获得试管牛犊三、意义o体外受精技术对动物生殖机理研究、畜牧生产、医学和濒危动物保护等具有重要意义o在家畜品种改良中，体外受精技术为胚胎生产提供了廉价而高效的手段，对充分利用优良品种资源，缩短家畜繁殖周期，加快品种改良速度等有重要价值o哺乳动物胚胎移植、克隆、转基因和性别控制等现代生物技术不可缺少的组成部分四、体外受精技术环节o卵母细胞的获得和体外成熟o精子的体外获能o成熟卵母细胞与获能精子的体外受精o受精卵的体外培养o受精卵的移植体外受精获能次级卵母细胞减数第二次分裂中期1卵母细胞的获得与体外成熟1）卵细胞的采集方法获得足够数量的卵
19、母细胞是生产试管动物的前提（1）从屠宰场家畜卵巢中采集（2）从超数排卵的卵巢获得卵泡,借助腹腔镜，手术法取卵（3）阴道超声波监视穿刺法直接从牛卵巢收集卵母细胞和内窥镜借助套筒穿刺阴道穹隆获得2）卵母细胞的成熟o未成熟的卵母细胞的核在细胞中央，成熟过程中迁移到动物极质膜下，核变得膨大，改称发生泡，接着进行第一次成熟分裂，减数分裂的完成标志着卵母细胞核的成熟（1） 细胞核成熟（2） 细胞质的成熟o显著的蛋白质合成发生在生发泡破裂前后，这些新合成的蛋白质不仅与卵细胞自身成熟有关（激活成熟促进因子），而且与卵母细胞输精后的发育能力直接有关，所以细胞质成熟的质量如何直接影响到早期胚胎的发育能力o胞质成熟
20、主要表现为细胞器变化和纺锤体的形成o卵母细胞成熟后期细胞器完成重新组装，如高尔基体消失，线粒体分布核的周围，胞质内有PAS阳性的囊膜和脂滴（3）细胞膜和透明带的成熟o细胞膜稳定性发生改变，膜微绒毛发生重排，表现密集而有弯曲，并从透明带内退出或断裂o透明带外层呈网状，变软2、体外获能o指精子在体外获得受精能力的过程o包括在体外环境中除去精浆和精子表面吸附的大分子物质，减少表面阴性电荷，提高膜流动性，增加精子呼吸率和加快运动幅度等一系列生理生化过程o精子体外获能是体外受精技术的关键环节，主要包括精子的洗涤和添加特定成分oBrackett（1982）以高离子强度液处理使精子获能o钙离子在精子获能时起
21、关键作用，能较快的诱发精子超活化运动和顶体反应o氨基多糖（GAGs）是牛精子获能的主要物质，可促进对钙离子的吸收，诱发顶体反应。如肝素也可使精子获能，但同样是一个钙离子依赖的过程o血清白蛋白（BSA）也可诱发精子获能。可能作为Zn离子融合剂引起PLA2的表达，或者在获能中去除精子膜上的胆固醇3、 体外受精o体外受精是以正常体内受精的研究为基础的，尽可能给精卵提供一个适宜的共培养体系是研究体外受精的目的o受精成功的标志是看受精卵是否可发育至囊胚期阶段o多精子受精一直是体外受精的一个难点4、受精卵的体外培养 受精卵要在体外条件下培养发育一段时间，再移植到受体子宫内，因此，“试管动物”实际上要在体外进行三个阶段的培养： 第一阶段是卵子成熟培养和精子获能培养 第二阶段是受精培养 第三阶段才是受精卵早期发育培养5、存在的问题o体外受精的效率有待提高o体外培养体系有待进一步完善o基础理论研究有待加强
