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1、食品微生物检验食品微生物检验规范操作基础培训规范操作基础培训 1 清洗、消毒和灭菌操作清洗、消毒和灭菌操作福建出入境检验检疫局技术中心食品所微生物实验室福建出入境检验检疫局技术中心食品所微生物实验室福建出入境检验检疫局技术中心食品所微生物实验室福建出入境检验检疫局技术中心食品所微生物实验室2010.052010.05主要内容：主要内容： 1清洗、消毒和灭菌操作清洗、消毒和灭菌操作 2培养基的制备培养基的制备 3采样和取、制样采样和取、制样 4接种、分离纯化接种、分离纯化 5制片、染色及显微观察制片、染色及显微观察 6实验室安全基础知识实验室安全基础知识 1 清洗、消毒和灭菌操作清洗、消毒和灭菌
2、操作1.1 1.1 玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗 1.1.11.1.1新购的玻璃器皿新购的玻璃器皿 碱性玻璃浸泡于碱性玻璃浸泡于mol/Lmol/L盐酸浸泡过夜，中和玻盐酸浸泡过夜，中和玻璃中的碱性物质。璃中的碱性物质。1.1.21.1.2用过的玻璃器皿用过的玻璃器皿 污染的器皿，必须经过适当消毒，污染的器皿，必须经过适当消毒， 污迹不能洗净时，可浸泡于洗液内。污迹不能洗净时，可浸泡于洗液内。 1.1.31.1.3洗液的配制洗液的配制 称取重铬酸钾称取重铬酸钾100g100g与与1000mL1000mL水置大烧瓶中加热水置大烧瓶中加热搅拌溶化，待冷却后，将烧瓶置冷水中，慢慢加入浓搅拌溶化，待冷
3、却后，将烧瓶置冷水中，慢慢加入浓流酸流酸250mL250mL，并不断搅拌。并不断搅拌。 1.21.2消毒、灭菌消毒、灭菌v消毒消毒（disinfectiondisinfection）：）：杀灭物体上病原微生杀灭物体上病原微生物的方法，但不一定杀死细菌芽胞。物的方法，但不一定杀死细菌芽胞。 v灭菌灭菌（sterilizationsterilization）：）：杀灭物体上包括芽杀灭物体上包括芽胞在内的所有病原性和非病原性微生物的方法。胞在内的所有病原性和非病原性微生物的方法。v防腐防腐（antisepsisantisepsis）：）：防止或抑制细菌生长繁防止或抑制细菌生长繁殖的方法，细菌一般不死
4、亡。殖的方法，细菌一般不死亡。v无菌无菌（asepsisasepsis）：）：不含活菌的意思。防止微不含活菌的意思。防止微生物进入机体或物体的操作方法，称为生物进入机体或物体的操作方法，称为无菌操无菌操作或无菌技术作或无菌技术。进行微生物实验、外科手术及。进行微生物实验、外科手术及医疗技术操作等过程，均需进行严格的无菌操医疗技术操作等过程，均需进行严格的无菌操作。作。 消毒灭菌的方法消毒灭菌的方法 l（一）物理消毒灭菌法（一）物理消毒灭菌法l（二）化学消毒法（二）化学消毒法 （一）物理消毒灭菌法（一）物理消毒灭菌法1.1.热力灭菌法热力灭菌法 热力灭菌法分干热灭菌和湿热灭菌两大类。在同一温度下
5、， 后者效力比前者为大，这是因为： （1）湿热中细菌菌体蛋白较易凝固；（2）湿热的穿透力比干热大；（3）湿热的蒸汽有潜热存在。水由气态变为液态时释放出的潜热，可迅速提高被灭菌物体的温度。 加热灭菌和加热消毒的方法 干热灭菌法 火焰灭菌法 干燥加热空气灭菌法高温灭菌 巴氏消毒法 常压下 煮沸消毒法 湿热灭菌法 间歇灭菌法 常规加压灭菌法 加压下 (高压蒸汽灭菌法) 连续加压灭菌法干热灭菌法1.1.焚烧：焚烧：是一种彻底的灭菌方法，但仅适用于废是一种彻底的灭菌方法，但仅适用于废弃物品或尸体等。弃物品或尸体等。2.2.烧灼：烧灼：直接用火焰灭菌，适用于微生物学实验直接用火焰灭菌，适用于微生物学实验室
6、的接种环、试管口等的灭菌。室的接种环、试管口等的灭菌。3.3.干烤：干烤：鼓风干燥箱灭菌。一般加热至鼓风干燥箱灭菌。一般加热至160160170170经经2 2小时。适用于高温下不变质、不蒸发小时。适用于高温下不变质、不蒸发的物品，的物品， 如玻璃器皿、瓷器等。如玻璃器皿、瓷器等。 湿热灭菌法l1.1.煮沸法：煮沸法：1 1个大气压下，煮沸的水温为个大气压下，煮沸的水温为100100，一般细，一般细菌繁殖体煮沸菌繁殖体煮沸5 51010分钟即被杀死。细菌芽胞常需煮沸分钟即被杀死。细菌芽胞常需煮沸1 1小时，才被杀死。水中加入小时，才被杀死。水中加入2%2%碳酸钠，可提高沸点碳酸钠，可提高沸点达
7、达105105，促进细菌芽胞的杀灭。促进细菌芽胞的杀灭。l 2.2.巴氏消毒法巴氏消毒法（pasteurizationpasteurization）: :用较低温度杀灭液用较低温度杀灭液体中的病原菌、同时又不影响消毒物品的营养成分及香体中的病原菌、同时又不影响消毒物品的营养成分及香味的消毒方法。加热味的消毒方法。加热61.161.162.862.8半小时即可，常用于半小时即可，常用于牛奶和酒类等的消毒。牛奶和酒类等的消毒。l3. 3. 间歇灭菌法间歇灭菌法（郭霍氏蒸汽消毒）（郭霍氏蒸汽消毒）: :将待灭菌的物品将待灭菌的物品100100加热加热15153030分钟，杀死其中的细菌繁殖体，然后将
8、物品置于分钟，杀死其中的细菌繁殖体，然后将物品置于3737温箱温箱中过夜使芽胞发育成繁殖体，次日再通过流通蒸汽加热，如此连中过夜使芽胞发育成繁殖体，次日再通过流通蒸汽加热，如此连续三次，可将所有细菌繁殖体和芽胞全部杀死。针对有点培养基续三次，可将所有细菌繁殖体和芽胞全部杀死。针对有点培养基和牛奶、糖等在和牛奶、糖等在100100以上有效成分易被破坏的产品进行灭菌。以上有效成分易被破坏的产品进行灭菌。 l4.4.高压蒸汽灭菌法：高压蒸汽灭菌法：是灭菌效果最好、目前应用最广的灭菌是灭菌效果最好、目前应用最广的灭菌方法。方法是在一密闭蒸锅方法。方法是在一密闭蒸锅高压蒸汽灭菌器内进行的。通常采高压蒸汽
9、灭菌器内进行的。通常采用纯饱和蒸汽压为用纯饱和蒸汽压为103.4kPa103.4kPa，温度达，温度达121,121,维持维持15153030分钟，可分钟，可杀死包括细菌芽胞在内的所有微生物。杀死包括细菌芽胞在内的所有微生物。 适用于适用于各种耐热、体积各种耐热、体积大的培养基的灭菌，也适用于玻璃器皿、工作服、耐高温塑料用大的培养基的灭菌，也适用于玻璃器皿、工作服、耐高温塑料用品等物品的灭菌。品等物品的灭菌。 l在高压蒸汽灭菌前要确保高压锅中的所有冷空气已经排空，否则表上的蒸汽压与蒸汽温度之间不具对应关系，这样会大大降低灭菌效果。l定期对灭菌效果进行监测和验证，可采用： 物理监测法（留点温度计
10、法、热电偶法）； 化学指示剂法（化学指示胶带、指示卡等）； 生物指示法（孢子悬液、孢子条带等）监控高压灭菌 的效果。2.2.辐射辐射 利用辐射进行灭菌消毒，可以避免高温灭菌或利用辐射进行灭菌消毒，可以避免高温灭菌或化学药剂消毒的缺点，所以应用越来越广化学药剂消毒的缺点，所以应用越来越广 。1.1.紫外线：紫外线：紫外线波长为紫外线波长为200200300nm300nm时具有杀菌作用，时具有杀菌作用，其中以其中以260nm260nm最强。紫外线杀菌机理主要是作用于最强。紫外线杀菌机理主要是作用于细菌细菌DNADNA，使同一条使同一条DNA DNA 链上相邻的两个胸腺嘧啶链上相邻的两个胸腺嘧啶共价
11、结合而形成嘧啶二聚体，因而改变共价结合而形成嘧啶二聚体，因而改变DNADNA的分子的分子构型，干扰细菌构型，干扰细菌DNADNA的复制与转录，导致细菌的死的复制与转录，导致细菌的死亡或变异。亡或变异。紫外线穿透力差紫外线穿透力差，故只适用于空气及不，故只适用于空气及不耐热物品的耐热物品的表面消毒表面消毒。 2.2.应用应用射线射线作食品表面杀菌，作食品表面杀菌，射线射线用于食品内部用于食品内部杀菌。经辐射后的食品，因大量微生物被杀灭，再杀菌。经辐射后的食品，因大量微生物被杀灭，再用冷冻保藏，可使保存期延长。用冷冻保藏，可使保存期延长。 3.3.滤过除菌滤过除菌 采用机械方法，设计一种采用机械方
12、法，设计一种滤孔比细菌还小的筛子滤孔比细菌还小的筛子，做成各种过滤器。通过过滤，只让液体培养基从筛子做成各种过滤器。通过过滤，只让液体培养基从筛子中流下，而把各种微生物菌体留在筛子上面，从而达中流下，而把各种微生物菌体留在筛子上面，从而达到除菌的目的。这种灭菌方法适用于一些对热不稳定到除菌的目的。这种灭菌方法适用于一些对热不稳定的体积小的液体培养基的灭菌以及气体的灭菌。它的的体积小的液体培养基的灭菌以及气体的灭菌。它的最大优点是不破坏培养基中各种物质的化学成分。最大优点是不破坏培养基中各种物质的化学成分。 滤过除菌主要用于一些滤过除菌主要用于一些不耐高温灭菌的血清、毒不耐高温灭菌的血清、毒素、
13、抗生素、药液、空气等除菌素、抗生素、药液、空气等除菌。但是比细菌还小的。但是比细菌还小的病毒仍然能留在液体培养基内，有时会给实验带来一病毒仍然能留在液体培养基内，有时会给实验带来一定的麻烦。定的麻烦。 滤菌器的种类很多，目前常用的有滤菌器的种类很多，目前常用的有蔡氏滤菌器、蔡氏滤菌器、玻璃滤器、薄膜滤器。玻璃滤器、薄膜滤器。 （二）化学消毒法（二）化学消毒法化学药物根据其抑菌或杀死微生物的效应分为化学药物根据其抑菌或杀死微生物的效应分为杀菌剂杀菌剂、消毒剂消毒剂、防腐剂防腐剂三类。三类。 1.凡杀死一切微生物及其孢子的药剂称凡杀死一切微生物及其孢子的药剂称杀菌剂杀菌剂； 2.只杀死感染性病原微
14、生物的药剂称只杀死感染性病原微生物的药剂称消毒剂消毒剂； 3. 只能抑制微生物生长和繁殖的药剂称为只能抑制微生物生长和繁殖的药剂称为防腐剂防腐剂。 但三者界限往往难以区分。化学药剂的效应与但三者界限往往难以区分。化学药剂的效应与药剂浓度、处理时间长短和菌的敏感性均有关系，药剂浓度、处理时间长短和菌的敏感性均有关系，主要仍取决于主要仍取决于药剂浓度药剂浓度。大多数杀菌剂在低浓度。大多数杀菌剂在低浓度下只起抑菌作用或消毒作用。它们的杀菌或抑菌原下只起抑菌作用或消毒作用。它们的杀菌或抑菌原理基本相同。实验室中常用的化学杀菌剂和消毒剂理基本相同。实验室中常用的化学杀菌剂和消毒剂列于下表列于下表 。类
15、别代 表*常用浓度*用 途作用机制醛类甲醛36%40%10%熏蒸空气(接种室、培养室)发酵罐甲醛蒸汽灭菌组织标本固定使蛋白质和酶变性酚类石炭酸来苏尔3%5%3%5%1%2%室内空气喷雾消毒，擦洗被污染的桌面、地面浸泡用过的移液管等玻璃器皿(浸泡1h)皮肤消毒 (12min)破坏细胞膜，使蛋白质变性醇类乙醇70%75%皮肤消毒(对芽胞及孢子无效)或器皿表面消毒脱水，蛋白质变性实验室中常用的化学杀菌剂和消毒剂实验室中常用的化学杀菌剂和消毒剂实验室中常用的化学杀菌剂和消毒剂实验室中常用的化学杀菌剂和消毒剂有机酸乳酸醋酸苯甲酸山梨酸丙酸盐80%或0.331mol/L35mL/m30.1%0.1%0.3
16、2%熏蒸空气(接种室、培养室)熏蒸空气食品防腐剂(抑制真菌)食品防腐剂(抑制霉菌)食品防腐剂(抑制霉菌)破坏细胞膜和酶类无机酸碱类硫酸烧碱NaOH石灰水0.01mol/L4%1%3%适用于玻璃器皿浸泡病毒性传染病粪便消毒、畜舍消毒破坏细胞膜和酶类氧化剂 高锰酸钾漂白粉过氧化氢氯气碘0.1%3%1%5%3%0.21.0ppm2.5%皮肤、水果、茶具消毒洗刷培养室、饮水及粪便消毒(对噬菌体有效)清洗伤口饮用水消毒皮肤消毒蛋白质或酶氧化变性重金属昇汞(HgCl2)汞溴红(红药水)硝酸银硫酸铜0.05%0.2%2%0.1%1.0%与石灰水配成波尔多液非金属表面器皿及组织分离体表及伤口消毒新生儿眼药水真
17、菌、藻类杀菌剂，防治植病蛋白质变性，酶失活金属螯合剂8-羟奎啉硫酸盐0.1%0.2%外用(清洗、消毒)生化试剂缓冲液的防腐剂与酶的激活剂或金属活性基结合，使酶失活去污剂新洁尔灭(原液为5%季胺盐)肥皂0.25%1：10001：5000皮肤及器皿消毒浸泡用过的盖片、载片皮肤清洁剂破坏细胞膜；使蛋白质变性染料结晶紫2%4%体表及伤口消毒与细胞膜或细胞质中核酸结合，破坏其生理功能接种室、培养室空气熏蒸消毒甲醛熏蒸消毒法（1）加热熏蒸 按熏蒸空间计算，量取甲醛溶液，盛在小烧杯或白瓷坩埚内，用铁架支好，点燃酒精灯，关闭室门。甲醛溶液煮沸挥发，酒精灯最好能在甲醛蒸完后即自行熄灭。所需酒精的量要加以控制。（
18、2）氧化熏蒸 称取高锰酸钾（相当于甲醛用量的1/2）于一白瓷坩埚或玻璃烧杯内，再量取定量的甲醛溶液，准备妥当后，把甲醛溶液倒在盛有高锰酸钾的器皿内，立即关门。甲醛溶液即沸腾挥发。高锰酸钾是一种强氧化剂，当它与一部分甲醛溶液作用时，由氧化作用产生的热可使其余的甲醛溶液挥发为气体。甲醛溶液熏蒸后关门密闭保持12h以上。硫磺熏蒸法 称好硫磺粉，将其放在垫有几张废纸或火柴棍的白瓷坩埚或烧杯内，点火燃烧，密闭24h，硫磺燃烧前在室内墙壁、桌面、地上喷洒些水，使之产生的H2SO3杀菌力增强。为了防止H2SO3和H2SO4对金属腐蚀，熏蒸前将金属制品妥善处理。影响消毒灭菌效果的因素影响消毒灭菌效果的因素 l
19、1.1.消毒剂的性质、浓度和作用时间：消毒剂的性质、浓度和作用时间：一般情况下浓度越一般情况下浓度越大，作用时间越长，杀菌效果越好。但大，作用时间越长，杀菌效果越好。但95%95%的乙醇消毒的乙醇消毒效果反不如效果反不如75%75%为好，因为高浓度乙醇使细菌表面的蛋为好，因为高浓度乙醇使细菌表面的蛋白质迅速脱水而凝固，影响乙醇进入菌体内，减弱其杀白质迅速脱水而凝固，影响乙醇进入菌体内，减弱其杀菌作用。菌作用。 l2.2.微生物的种类与数量：微生物的种类与数量：同种消毒剂对不同微生物的杀同种消毒剂对不同微生物的杀菌效果不同。如结核杆菌对酸、碱的抵抗力菌效果不同。如结核杆菌对酸、碱的抵抗力 比其他的比其他的菌强；菌强；70%70%乙醇可杀死一般细菌繁殖体，但不能杀灭细乙醇可杀死一般细菌繁殖体，但不能杀灭细菌芽胞。因此，必须根据消毒对象选择合适的消毒剂。菌芽胞。因此，必须根据消毒对象选择合适的消毒剂。l3.3.环境中有机物的影响：环境中有机物的影响：消毒环境中如有有机物存在，消毒环境中如有有机物存在，如血清、脓汁、痰、粪便等，可与消毒剂结合而影响杀如血清、脓汁、痰、粪便等，可与消毒剂结合而影响杀菌效果。菌效果。 谢谢 谢！谢！
