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1、第三章第三章 酶的提取与分离纯化酶的提取与分离纯化一、电泳的基本理论一、电泳的基本理论 1. 1. 原理原理: : 在一定在一定pHpH条件下条件下（用（用bufferbuffer），），不同大小、不同大小、形状及带电颗粒在电场中的移动速度不同形状及带电颗粒在电场中的移动速度不同（用迁移率表示），（用迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。成紧密的泳动带。 +- 影响影响迁移率迁移率的因素：的因素： 颗粒性质：颗粒性质：Q Q越大、越大、r r越小、形状越接近球形，越小、形状越接近球形，v v 越快。越快。 电场强度：电场强度：E E越高，越高，v v
2、越快。越快。 电泳液：电泳液： pH pH值：离值：离pIpI越远，越远，v v越快。越快。（用（用bufferbuffer保持恒定）保持恒定） 离子强度：离子强度越高，离子强度：离子强度越高，v v 越低。越低。 通常，缓冲液离子强度在通常，缓冲液离子强度在0.02-0.20.02-0.2之间。之间。 电电 渗：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。渗：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。 应避免用高电渗物质作支持介质。应避免用高电渗物质作支持介质。 自由界面电泳：自由界面电泳：又称移动界面电泳又称移动界面电泳，指在没指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。有支持介质的溶液中进行的电泳。
3、区带电泳区带电泳: :指有支持介质的电泳，待分离物指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。质在支持介质上分离成若干区带。 支持介质的作用支持介质的作用: :防止电泳过程中的对流和扩散。防止电泳过程中的对流和扩散。2. 2. 电泳的分类电泳的分类按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：纸电泳：用滤纸作支持介质，用于核苷酸定性定量分析。纸电泳：用滤纸作支持介质，用于核苷酸定性定量分析。醋酸纤维素薄膜电泳：常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，醋酸纤维素薄膜电泳：常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。优点是简便
4、迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。 v以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。 琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳： 一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳： 用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分辨率高。用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分辨率高。v聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持
5、介质。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。 3. 3. 电泳常用设备电泳常用设备 （1 1）电泳仪电泳仪 ：提供稳定直流电源的装置：提供稳定直流电源的装置 。 常压电泳仪（常压电泳仪（600V600V） 高压电泳仪（高压电泳仪（3000V3000V） 超高压电泳仪（超高压电泳仪（30000V30000V50000V50000V）（2 2）电泳槽电泳槽： 自由界面电泳槽自由界面电泳槽 管状电泳槽管状电泳槽 板状电泳槽板状电泳槽（3 3）附属设备：附属设备： 二、聚丙烯酰胺凝胶电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳！ 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide polyac
6、rylamide gel electrophoresisgel electrophoresis，PAGEPAGE）是以聚丙烯酰胺凝是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。胶作为支持介质的一种电泳方法。 1.1.原理原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（AcrAcr）和交联剂和交联剂N N，N-N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺（BisBis）在催化剂和加速剂作用下聚合的。在催化剂和加速剂作用下聚合的。CHCH2 2=CH=CHC=OC=ONHNH2 2CH2=CHCH2=CH C=O C=O NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O CH CH
7、2 2=CH=CH-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH- C=O C=O C=O C=O NH NH2 2 NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH- C=O C=O C=O C=O NH NH NH NH2 2丙烯酰胺丙烯酰胺N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺AcrBis 聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种： 1 1）化学催化系统：）化学催化系统：AP-TEMEDA
8、P-TEMED 催化剂：过硫酸铵催化剂：过硫酸铵（ammonium persulfateammonium persulfate，APAP） 加速剂：加速剂：TEMEDTEMED（N N，N N，NN，N-N-四甲基乙二胺）四甲基乙二胺） 2 2）光催化系统：核黄素光（）光催化系统：核黄素光（TEMEDTEMED） 催化剂催化剂: : 核黄素核黄素（维生素（维生素B B2 2） 引发剂引发剂: : 光光 TEMED TEMED的存在，可加速聚合。的存在，可加速聚合。 . 凝胶浓度越大凝胶浓度越大（小），（小），孔径越小孔径越小（大），（大），可可分离分子量较小分离分子量较小（大）（大）的颗粒。的
9、颗粒。 Acr Acr与与Bis的重量比应在的重量比应在30左右。左右。 凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系样品样品分子量（分子量（DaDa）适宜的凝胶浓度（）适宜的凝胶浓度（）蛋白质蛋白质105510105 52020303015152020101015155 510102 25 5聚丙烯酰胺凝胶浓度参考表聚丙烯酰胺凝胶浓度参考表2. 2. 分离效应分离效应 PAGE PAGE根据其有无浓缩效应，分为：根据其有无浓缩效应，分为：连续电泳连续电泳 采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统不连续电泳不连续电泳 采用不同孔径的凝胶和不同缓冲
10、体系采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系 电荷效应电荷效应不连续不连续PAGE PAGE 分子筛效应分子筛效应 浓缩效应浓缩效应 连续连续PAGEPAGE 电荷效应电荷效应: :分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。迁移率不同。 分子筛效应：分子筛效应：大小和形状不同的样品分子通大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。现出不同的迁移率。 浓缩效应：浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分离胶进行分离。窄带，然后再进入分离胶进行分离
11、。不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳系统的不连续性表现在以下几个方面：系统的不连续性表现在以下几个方面： 1. 1.凝胶分上、下两层，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔凝胶分上、下两层，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。径的分离胶。 2. 2.缓冲液离子组成及各层凝胶的缓冲液离子组成及各层凝胶的pHpH不同。电极缓冲液为不同。电极缓冲液为pH8.3pH8.3的的Tris-Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.8pH6.8的的Tris-HClTris-HCl缓冲液，缓冲液，分离胶为分离胶为pH8.8pH8.8的的Tris-HClTris-HCl缓冲液
12、。缓冲液。 3. 3.在电场中形成不连续的电位梯度。在电场中形成不连续的电位梯度。 不连续系统，有三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶不连续系统，有三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，提高了分辨率。的分子筛效应和电荷效应，提高了分辨率。三、三、SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis, sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel ele
13、ctrophoresis, SDS- PAGESDS- PAGE）简称简称SDSSDSPAGEPAGE。 是目前测定蛋白质亚基相对分子量的一种是目前测定蛋白质亚基相对分子量的一种最好的办法最好的办法 。1.1.原理：原理：SDSSDS是种阴离子去污剂，带有大量负电荷，是种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。白质间原有电荷的差异。 SDS SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，巯基乙醇使二硫键破坏蛋白质氢键
14、、疏水键，巯基乙醇使二硫键打开，引起蛋白质构象改变，使蛋白质打开，引起蛋白质构象改变，使蛋白质SDSSDS复合物复合物形状近似椭圆形，短轴相同形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm1.8nm），），长轴与蛋白质分长轴与蛋白质分子量成正比。子量成正比。 因此，蛋白质因此，蛋白质SDSSDS复合物在凝胶中的迁移率不复合物在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）（蛋白质分子量）有关。有关。未知蛋白质在相同条件未知蛋白质在相同条件未知蛋白质在相同条件未知蛋白质在相同条件下进行电泳，可在标准下进行电泳，可在标准下进行电泳，可
15、在标准下进行电泳，可在标准曲线上求得分子量。曲线上求得分子量。曲线上求得分子量。曲线上求得分子量。2. 2. 操作：操作：（SDS-PAGESDS-PAGE及及PAGEPAGE，即变性及非变性），即变性及非变性） 1 1）制胶）制胶: : （变性：（变性：buffer buffer 中加中加0.4%SDS0.4%SDS） a. a.分离胶：根据待分离样品的分子大小选择一定分离胶：根据待分离样品的分子大小选择一定浓度的分离胶浓度的分离胶（查表），（查表），配制分离胶溶液：配制分离胶溶液： Acr:Bis=29:1 Acr:Bis=29:1，分离胶，分离胶buffer,buffer, TEMED,
16、 AP, TEMED, AP, 水水 迅速倒胶，加水使液面平坦，室温迅速倒胶，加水使液面平坦，室温0.5h0.5h聚合完聚合完全。全。 b. b.浓缩胶：用浓缩胶浓缩胶：用浓缩胶bufferbuffer。插上梳子。插上梳子。2 2）样品制备：）样品制备： a.PAGE: a.PAGE: 样品样品缓冲液样品样品缓冲液（蔗糖或甘油指示剂溴酚蓝）（蔗糖或甘油指示剂溴酚蓝） b.SDS-PAGE: b.SDS-PAGE: 样品样品缓冲液样品样品缓冲液（SDSSDS，甘油，巯基乙醇，甘油，巯基乙醇，溴酚蓝），溴酚蓝），煮沸煮沸2-5min2-5min， 以除去亚稳态聚合。以除去亚稳态聚合。3 3）加样及
17、电泳：）加样及电泳： SDS-PAGE: SDS-PAGE: 电极电极bufferbuffer中加中加0.1%SDS0.1%SDS，溴酚蓝，溴酚蓝距下端距下端1cm1cm时停止电泳。时停止电泳。4 4）固定及染色）固定及染色a.a.固定：将凝胶浸于固定：将凝胶浸于7 7乙酸或乙酸或12.512.5三氯乙酸中三氯乙酸中固定蛋白质组分。固定蛋白质组分。b.b.染色：染色： 考马斯亮蓝染色法考马斯亮蓝染色法 银染法银染法（灵敏度比前者高（灵敏度比前者高100100倍）倍） 其它的染色方法：氨基黑、阿尔辛蓝，过碘酸其它的染色方法：氨基黑、阿尔辛蓝，过碘酸SchiffSchiff试剂（糖蛋白）。试剂（糖
18、蛋白）。四、等电聚焦电泳四、等电聚焦电泳 ( ( ( ( isoelectric focusingisoelectric focusingisoelectric focusingisoelectric focusing，IEF )IEF )IEF )IEF ) 利用蛋白质具有不同等电点的特性，利用蛋白质具有不同等电点的特性，以以聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体两性电解质两性电解质（商品名：（商品名：（商品名：（商品名：AmpholineAmpholineAmpholineAmpholine，一种含有各种连续一种含有各种连续 pI pI 的小分的小分子
19、混合物子混合物）的电泳方法称聚丙烯酰胺的电泳方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电等电聚焦电泳（泳（IEF-PAGEIEF-PAGE）。）。自学自学第五节第五节 酶的浓缩、干燥与结晶酶的浓缩、干燥与结晶一、酶的浓缩一、酶的浓缩 1 1 蒸发浓缩蒸发浓缩 图图 4-60 4-60 减压蒸发浓缩的简易装置减压蒸发浓缩的简易装置 1 1蒸馏瓶蒸馏瓶 2 2毛细管毛细管 3 3螺旋夹螺旋夹 4 4橡皮管橡皮管 5 5温度计温度计 6 6出水口出水口 7 7冷凝器冷凝器 8 8进水口进水口 9 9连接管连接管 10 10抽气口抽气口 11 11接收瓶接收瓶2 2 超滤浓缩超滤浓缩 超滤浓缩以压力超滤浓缩以压力差为动
20、力，将待浓差为动力，将待浓缩溶液通过超滤膜，缩溶液通过超滤膜，酶分子较大被滞留，酶分子较大被滞留，水分子和小分子选水分子和小分子选择性透过，达到浓择性透过，达到浓缩目的缩目的 。图图4-61 酶的超滤浓缩酶的超滤浓缩 3 3 吸水剂吸水剂 胶过滤浓缩胶过滤浓缩 利用葡聚糖凝胶利用葡聚糖凝胶Sephadex G-25Sephadex G-25或或G-50G-50等的等的吸水特性。将干胶直接加入样品溶液，吸水膨润吸水特性。将干胶直接加入样品溶液，吸水膨润后，再过滤或离心分出浓缩的酶液。后，再过滤或离心分出浓缩的酶液。聚乙二醇浓缩：聚乙二醇浓缩： 聚乙二醇聚乙二醇（polyethylene glyc
21、olpolyethylene glycol），），简称简称PEG PEG 。 利用利用PEGPEG的吸水特性。将的吸水特性。将PEGPEG涂于装有酶溶液涂于装有酶溶液的透析袋上，置于的透析袋上，置于44下，干下，干PEGPEG粉末吸收水和盐粉末吸收水和盐类，酶溶液即被浓缩。类，酶溶液即被浓缩。 一般用分子量大的一般用分子量大的PEG,PEG,如如PEG 6,000PEG 6,000和和PEG 20,000PEG 20,000，以防止，以防止PEGPEG进进入蛋白质溶液。入蛋白质溶液。4 4 反复冻融浓缩反复冻融浓缩 利用酶溶液相对于纯水冰点较低的原利用酶溶液相对于纯水冰点较低的原理使酶分子与小
22、分子物质分离。理使酶分子与小分子物质分离。 5 5 沉淀法沉淀法 盐析法，有机溶剂法盐析法，有机溶剂法二、酶的干燥二、酶的干燥 酶的干燥多采用冷冻干燥法。酶的干燥多采用冷冻干燥法。 将酶溶液在较低温度下将酶溶液在较低温度下（-10-10到到-50-50）冻结成固态，然后在高度真空条件下，将冻结成固态，然后在高度真空条件下，将其中固态水分直接升华为气态而除去，也其中固态水分直接升华为气态而除去，也称酶的升华干燥。称酶的升华干燥。三、酶的结晶三、酶的结晶 结晶结晶（Crystallization）是指物质以晶体的状态是指物质以晶体的状态从蒸汽或溶液中析出的过程。从蒸汽或溶液中析出的过程。 结晶的条
23、件结晶的条件 1.1.酶的纯度酶的纯度: :纯度越高越易结晶（纯度越高越易结晶（ 5050 ） 2.2.酶的浓度酶的浓度 （恰到好处）（恰到好处）: : 浓度越高越易结晶，控制在饱和区以浓度越高越易结晶，控制在饱和区以上，过饱和区以下的介稳区内上，过饱和区以下的介稳区内。3. 3. 结晶温度结晶温度 4. 4. 溶液溶液pHpH5. 5. 离子强度离子强度 6. 6. 晶核晶核 7. 7. 结晶时间结晶时间 第五节第五节 纯化方案的设计与评价纯化方案的设计与评价 一、纯化方案的设计一、纯化方案的设计 1 1 纯化方法的选择依据纯化方法的选择依据 根据有效成分和杂质之间理化性质的差异根据有效成分
24、和杂质之间理化性质的差异 调节溶解度：调节溶解度：沉淀法沉淀法 根据分子大小、形状的不同：根据分子大小、形状的不同： 离心分离，膜分离，凝胶过滤离心分离，膜分离，凝胶过滤 根据分子电荷性质的不同：根据分子电荷性质的不同：离子交换层析，电泳离子交换层析，电泳 根据专一性结合的方法：根据专一性结合的方法：亲和层析亲和层析 其它：其它：吸附层析，疏水层析吸附层析，疏水层析2 2 纯化方法的排序纯化方法的排序 先选用粗放、快速、有利于缩小样品体先选用粗放、快速、有利于缩小样品体积的方法。精确、费时、需样品少的方法，积的方法。精确、费时、需样品少的方法，宜后选用。宜后选用。 二、纯化方案的评价二、纯化方
25、案的评价1 1 酶活力测定：酶活力测定： 酶活力酶活力(enzyme activity)(enzyme activity)又称酶活性，即单位时又称酶活性，即单位时间内酶促反应的产物生成量间内酶促反应的产物生成量. . 是酶催化某一化学反应的能力。是酶催化某一化学反应的能力。 方法：方法： 在酶反应开始后不同时间，从反应系在酶反应开始后不同时间，从反应系统中取出一定量反应液，用适当方法停止统中取出一定量反应液，用适当方法停止其反应后，再根据产物和底物在物化性质其反应后，再根据产物和底物在物化性质上的差别进行分析，求得单位时间的酶促上的差别进行分析，求得单位时间的酶促反应变化量。反应变化量。 常用
26、的方法常用的方法 ： 化学分析法化学分析法（比色法）（比色法）：产物可与特定的化学：产物可与特定的化学试剂反应生成稳定的有色溶液试剂反应生成稳定的有色溶液 。 分光光度法分光光度法: :利用底物和产物光吸收性质的利用底物和产物光吸收性质的不同不同 。 量气法量气法: :酶促反应中产物或底物之一为气体。酶促反应中产物或底物之一为气体。 滴定法滴定法（pHpH值测量法）值测量法）：产物之一是自由的酸性：产物之一是自由的酸性物质或碱性物质。多用物质或碱性物质。多用pHpH电极测。电极测。 常用终止反应方法：常用终止反应方法： 改变反应最适条件：改变反应最适条件： 加酸、碱、加热加酸、碱、加热 加酶变
27、性剂：加酶变性剂： 5 5三氯乙酸三氯乙酸 酶活力单位：酶活力单位：通常采用国际酶学委员会规定的通常采用国际酶学委员会规定的单位。单位。 在纯化过程中，为了方便，可采用自行规定的在纯化过程中，为了方便，可采用自行规定的单位，只要达到可比较的目的即可，如直接以光密单位，只要达到可比较的目的即可，如直接以光密度值表示。度值表示。 2 2 蛋白质浓度测定蛋白质浓度测定 紫外吸收法：酪氨酸、色氨酸残基中苯环有共紫外吸收法：酪氨酸、色氨酸残基中苯环有共轭双键，在轭双键，在A A280280有最大吸收。有最大吸收。特点：特点：简便、快速、简便、快速、不损耗样品，但干扰因素多。不损耗样品，但干扰因素多。 双
28、缩脲法：具有两个或两个以上肽键的化合物双缩脲法：具有两个或两个以上肽键的化合物均有双缩脲反应。均有双缩脲反应。优点：优点：快速快速. .缺点：灵敏度差缺点：灵敏度差 酚试剂酚试剂（Folin-Folin-酚）酚）测定法：测定法： 繁琐，但灵敏度、准确度高。繁琐，但灵敏度、准确度高。 染料结合法染料结合法（考马斯亮蓝染色法）（考马斯亮蓝染色法）：又称：又称BradfordBradford法，法，灵敏、简便、快速、干扰少，是常用的检测法。灵敏、简便、快速、干扰少，是常用的检测法。 3 3 酶的纯化指标酶的纯化指标 纯度纯度 提纯倍数提纯倍数 回收率回收率 常用比活力表示酶的纯度：常用比活力表示酶的
29、纯度： 酶活力（酶活力（u/ml） 比活力比活力 蛋白质含量（蛋白质含量（mg蛋白蛋白/ml酶液）酶液） 比活力越高，酶纯度也越好。比活力越高，酶纯度也越好。 提提纯倍数纯倍数= =提纯后比活力提纯后比活力/ /提纯前比活力提纯前比活力 提纯倍数越大，表示该方法纯化效果越好。提纯倍数越大，表示该方法纯化效果越好。 回收率回收率提纯后酶总活力提纯后酶总活力/ /提纯前酶总活力提纯前酶总活力100100 表示提纯过程中酶损失程度的大小。表示提纯过程中酶损失程度的大小。 回收率越高，损失越小。回收率越高，损失越小。 总活力酶活力单位数总活力酶活力单位数 酶液总体积酶液总体积 即样品中全部酶活力。即样
30、品中全部酶活力。 判断一个分离纯化方法的优劣，常用总活判断一个分离纯化方法的优劣，常用总活力的回收率和比活力的提纯倍数力的回收率和比活力的提纯倍数两个指标。两个指标。 回收率：反映酶的损失情况。回收率：反映酶的损失情况。 提纯倍数：表示方法的有效程度。提纯倍数：表示方法的有效程度。 一个好的纯化步骤是回收率较高，提纯倍一个好的纯化步骤是回收率较高，提纯倍数也较大。数也较大。4 4 纯化表纯化表提纯倍数: 0.6/0.416=1.44 9.8/0.416=23.6 500/0.416=1200比活力: 5/12=0.416 11/3=3.67 364/7=52总活力: 51000=5000 17010=1700产率(回收率): 4800/5000=96% 1820/5000=36.4% 1500/5000=30%酶浓度: 5000/1000=5 1820 /5=364 1700/10=170思考题：思考题：1 PAGE 和和 SDSPAGE电泳的原理有何区别电泳的原理有何区别?应应用有何不同用有何不同?2酶活力酶活力 酶比活酶比活3酶的纯化效率通常采用哪些指标酶的纯化效率通常采用哪些指标?它们如何计算它们如何计算?
