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1、细菌(xjn)内毒素方法验证第一页，共十二页。1细菌内毒素验证细菌内毒素验证基本(jbn)程序l试验准备 确定样品内毒素限值 选择试剂 计算MVD 鲎试剂灵敏度复核试验 供试品干扰初筛试验 干扰试验 结果判断l计算公式：MVD=cL/ MVD为供试品的最大有效稀释倍数，c为供试品溶液的浓度，L供试品的细菌内毒素限值。如果计算在MVD时的供试品浓度，即最小有效稀释浓度，可使用(shyng)公式MVc= /L. 第二页，共十二页。2细菌内毒素验证鲎试剂(shj)灵敏度复核试验根据鲎试剂(shj)灵敏度的标示值（ ），将细菌内毒素工作标准品加入1ml内毒素检查用水溶解，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合
2、器上混合15分钟。然后按所用的鲎试剂灵敏度2、0.5、0.25进行稀释。0.1ml鲎试剂+ 0.1ml标准品，平行4管；NC： 0.1ml鲎试剂+ 0.1mlBET用水，平行2管371孵育60min2min。结果判断：反应管缓缓倒转180， 阳性（+）：凝胶不变形，不从管壁滑脱落； 阴性（-）：未形成凝胶或凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者。 实验有效：NC管全部阴性（ - - ）， 2.0 管全部阳性（+ + + +）， 0.25管全部阴性（- - - - ）。数据处理：灵敏度测定值c=antilg(X/n)。X：为反映终点浓度的对数值（lg), 反映终点浓度是系列浓度递减的内毒素浓度中最后一个
3、呈阳性结果的浓度。第三页，共十二页。3细菌内毒素验证干扰(gnro)试验预试验先用少量的鲎试剂初步确定供试品的最大不干扰浓度，为正式干扰试验提供依据。例：某样品C：100单位/ml L：0.8 EU/单位 ：0.25 EU/ml MVD0.25 = 320倍 MVC0.25 = / L=0. 3125 单位/ml MVC0.125= / L =0.156单位/ml MVC0.06= / L = 0.078单位/ml MVC0.03 = / L = 0.039 单位/ml100单位/ml20单位/ml10 单位/ml5 单位/ml2.5 单位/ml1.25 单位/ml0.625 单位/ml0.3
4、125 单位/ml0.156ml /ml0.078 单位/ml0.039 单位/ml分别用4的内毒素标准品与各梯度的供试品等量稀释，得到(d do)相应的供试品阳性对照。第四页，共十二页。4细菌内毒素验证干扰(gnro)试验预试验结果一 供试品无干扰或者干扰很小，可用上述任一浓度进行干扰试验结果二 供试品在某浓度开始(kish)无干扰，可选择该浓度或者跟低浓度进行干扰试验供试品浓度供试品浓度MVC0.25MVC0.125MVC0.06MVC0.03BET水水供试品溶液- - - - - -供试品阳性对照+ + + + + + MVC0.25MVC0.125MVC0.06MVC0.03BET水水
5、供试品溶液- - - - - -供试品阳性对照- -+ + + + +第五页，共十二页。5细菌内毒素验证干扰(gnro)试验预试验结果三 假阳性，更换另一批供试品进行测试结果四假阴性，消除(xioch)干扰后再测试供试品浓度供试品浓度MVC0.25MVC0.125MVC0.06MVC0.03BET水水供试品溶液+ + + + +- -供试品阳性对照+ + + + + + + +供试品浓度供试品浓度MVC0.25MVC0.125MVC0.06MVC0.03BET水水供试品溶液- - - - - -供试品阳性对照- - - - - - -+ +第六页，共十二页。6细菌内毒素验证正式干扰(gnro)
6、试验根据最大不干扰浓度选用(xunyng)相应灵敏度的鲎试剂作正式干扰试验。编号编号内毒素浓度内毒素浓度/被加入内被加入内毒素的溶液毒素的溶液稀释用稀释用液液稀释稀释倍数倍数所含内毒所含内毒素的浓度素的浓度平行管平行管A无/供试品溶液2B2 /供试品溶液供试品溶液12482 1 0.5 0.25 4444C2 /检查用水检查用水12482 1 0.5 0.25 2222D无/检查用水2第七页，共十二页。7细菌内毒素验证正式(zhngsh)干扰试验上张表中，A为供试品溶液，B为干扰试验系列；C为鲎试剂表示灵敏度的对照系列；D为阴性对照只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液
7、C的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，试验方为有效(yuxio)。干扰试验中我们需要对三批供试品，两个不同厂家的鲎试剂进行试验第八页，共十二页。8细菌内毒素验证干扰(gnro)试验结果举例 2（ 2 ）1（ 1 ）0.5（ 0.5 ）0.25（ 0.25 ）阴性对照 + + + + - - - - + + + + - - - -+ +-+-例1、批号1厂家1鲎试剂(shj)试验结果2、批号(p ho)1厂家2鲎试剂试验结果3、重复做3批，计算结果 2（ 2 ）1（ 1 ）0.5（ 0.5 ）0.25（ 0.25 ）阴性对照 + + + + - - - - + + + + - - - -+ -
8、+-第九页，共十二页。9细菌内毒素验证u正式干扰试验接受标准 当阴性(ynxng)对照4管为阴性，两组最大浓度2均为阳性，最低浓度0.25均为阴性时，试验结果有效。Et/Es值在0.52（包括0.5、2）之间为无干扰，反之为有干扰u正式干扰试验结果计算：用内毒素检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（ES）和用供试品溶液制成的内毒素的反应终点浓度的几何平均值（Et）。uEs= antilg (Xs/4)uEt = antilg (Xt/4)uXs，Xt分别为系列溶液反应终点浓度的对数值（lg）。第十页，共十二页。10细菌内毒素验证第十一页，共十二页。11细菌内毒素验证内容(nirng)总结细菌内毒素方法验证。如果计算(j sun)在MVD时的供试品浓度，即最小有效稀释浓度，可使用公式MVc= /L.。0.1ml鲎试剂+ 0.1ml标准品，平行4管。NC： 0.1ml鲎试剂+ 0.1mlBET用水，平行2管371孵育60min2min。阳性（+）：凝胶不变形，不从管壁滑脱落。阴性（-）：未形成凝胶或凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者。MVD0.25 = 320倍。- -。+ +。内毒素浓度/被加入内毒素的溶液第十二页，共十二页。细菌内毒素验证
