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1、分子医学技能分子医学技能- -实验实验二二PCRPCR技术技术1. PCR试剂盒检测试剂盒检测HBV DNA2. apoB 基因检测基因检测PCR基本原理及相关知识基本原理及相关知识n n聚合酶链反应（聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）是一种体外扩增特异）是一种体外扩增特异DNA片断的技术片断的技术,能在短时间内获得数百能在短时间内获得数百万个特异万个特异DNA序列的拷贝。序列的拷贝。Kary MullisKary MullislPCR技技术术最最早早由由美美国国Cetus公公司司人人类类遗遗传传研研究究室室KaryMullis及及同同事事于于1985年发年
2、发明明并研制成功的。并研制成功的。lKaryMullis因因发发明明了了“聚聚合合酶酶链链式式反反应应”而而获获得得1993年年度度诺诺贝贝尔尔化化学学奖。奖。 n相相相相对对对对DNADNA克克克克隆隆隆隆而而而而言言言言，这这这这种种种种方方方方法法法法的的的的特特特特点点点点：操操操操作作作作简简简简便、时间短、特异性高、灵敏度高、实用性强便、时间短、特异性高、灵敏度高、实用性强便、时间短、特异性高、灵敏度高、实用性强便、时间短、特异性高、灵敏度高、实用性强n广广广广泛泛泛泛的的的的应应应应用用用用于于于于医医医医学学学学诊诊诊诊断断断断、分分分分子子子子生生生生物物物物学学学学、分分分
3、分子子子子克克克克隆隆隆隆、基因诊断、法医学、考古学等各个领域。基因诊断、法医学、考古学等各个领域。基因诊断、法医学、考古学等各个领域。基因诊断、法医学、考古学等各个领域。PCR技术的应用优点技术的应用优点PCR扩增扩增DNA片段的原理片段的原理 PCRPCR是在模板是在模板是在模板是在模板DNADNA、引物和四种脱氧核苷酸等、引物和四种脱氧核苷酸等、引物和四种脱氧核苷酸等、引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，存在的情况下，存在的情况下，存在的情况下，DNADNA聚合酶依赖的酶促合成反应，聚合酶依赖的酶促合成反应，聚合酶依赖的酶促合成反应，聚合酶依赖的酶促合成反应，整个扩增过程分三步：整个扩增
4、过程分三步：整个扩增过程分三步：整个扩增过程分三步： 变性：加热，模板变性：加热，模板变性：加热，模板变性：加热，模板DNADNA形成两条单链形成两条单链形成两条单链形成两条单链 退火：降温，模板单链退火：降温，模板单链退火：降温，模板单链退火：降温，模板单链DNADNA与引物配对结合与引物配对结合与引物配对结合与引物配对结合 延延延延伸伸伸伸：在在在在DNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶及及及及镁镁镁镁离离离离子子子子等等等等存存存存在在在在的的的的条条条条件件件件下下下下，引物引物引物引物3-3-端向前延伸，合成与模板配对的新链端向前延伸，合成与模板配对的新链端向前延伸，合成与模板配对的新
5、链端向前延伸，合成与模板配对的新链 上述三步为一个循环，经过一个循环上述三步为一个循环，经过一个循环上述三步为一个循环，经过一个循环上述三步为一个循环，经过一个循环DNADNA量增量增量增量增加一倍。新合成的链又可以成为新一轮循环的模板，加一倍。新合成的链又可以成为新一轮循环的模板，加一倍。新合成的链又可以成为新一轮循环的模板，加一倍。新合成的链又可以成为新一轮循环的模板，经过经过经过经过25-3025-30个循环后目的个循环后目的个循环后目的个循环后目的DNADNA就可以扩增就可以扩增就可以扩增就可以扩增10106 6101099倍。倍。倍。倍。通过循环可以提高通过循环可以提高通过循环可以提
6、高通过循环可以提高PCRPCR的特异性。的特异性。的特异性。的特异性。PCR反应体系的组成及功能反应体系的组成及功能完整的完整的PCR反应体系包括：反应体系包括：模板模板：单、双链单、双链DNA均可，不能混有蛋白酶、核酸均可，不能混有蛋白酶、核酸酶、酶、DNA聚合酶抑制剂、聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。结合蛋白类。相相对于分子克隆、酶切、连接、标记等，对于分子克隆、酶切、连接、标记等，PCR对对DNA模板纯度的要求并不严格。模板用量也是模板纯度的要求并不严格。模板用量也是很低的，一般认为很低的，一般认为10100拷贝模板就可以满足拷贝模板就可以满足要求。要求。一般一般100ngDNA模板模板
7、/100 L。模板浓度模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。过高会导致反应的非特异性增加。引物引物是预扩增是预扩增DNA片段两端的已知序列，是保片段两端的已知序列，是保证证PCR特异性的关键因素，引物浓度：特异性的关键因素，引物浓度：0.1-0.5 mol/L，浓度过高易导致模板与浓度过高易导致模板与引物错配引物错配,反应特异性下降。反应特异性下降。TaqDNA聚合酶聚合酶有良好的热稳定性，具有有良好的热稳定性，具有有良好的热稳定性，具有有良好的热稳定性，具有5 5 -3-3 聚合酶活性聚合酶活性聚合酶活性聚合酶活性, ,无无无无3 3 -5-5 外切酶活外切酶活外切酶活外切酶活性，因此。它对
8、核苷酸的错配是没有校正功能。性，因此。它对核苷酸的错配是没有校正功能。性，因此。它对核苷酸的错配是没有校正功能。性，因此。它对核苷酸的错配是没有校正功能。其活性对其活性对其活性对其活性对Mg2+Mg2+浓度非常敏感浓度非常敏感浓度非常敏感浓度非常敏感终浓度一般为：终浓度一般为：终浓度一般为：终浓度一般为：2.5u/100ul2.5u/100ul，酶量增加使反应特异性下降；酶量增加使反应特异性下降；酶量增加使反应特异性下降；酶量增加使反应特异性下降；酶量过少影响反应产量。酶量过少影响反应产量。酶量过少影响反应产量。酶量过少影响反应产量。 dNTP： 已有商品化的混合液，终浓度一般为已有商品化的混
9、合液，终浓度一般为已有商品化的混合液，终浓度一般为已有商品化的混合液，终浓度一般为20200umol/L20200umol/L。反应反应体系（体系（10PCRbuffer） 已作成商品化的产品，它包括：已作成商品化的产品，它包括：已作成商品化的产品，它包括：已作成商品化的产品，它包括：250500mmol/LKCl250500mmol/LKCl；100500mmol/LTris-HA100500mmol/LTris-HAc c（pH8.4pH8.4）；）；）；）；1520mmol/L1520mmol/LMgClMgCl2 2（对（对（对（对TaqTaq酶的活性影响很大，一般浓度为酶的活性影响很
10、大，一般浓度为酶的活性影响很大，一般浓度为酶的活性影响很大，一般浓度为1.52.0mmol/L1.52.0mmol/L，实际应用时根据反应体系的情况进，实际应用时根据反应体系的情况进，实际应用时根据反应体系的情况进，实际应用时根据反应体系的情况进行调整）；行调整）；行调整）；行调整）； 0.1%0.1%明胶或牛血清白蛋白明胶或牛血清白蛋白明胶或牛血清白蛋白明胶或牛血清白蛋白ddH2O调节反应体积调节反应体积液体石蜡油液体石蜡油（现在不用了，上盖可加热现在不用了，上盖可加热）影响影响PCR的主要因素的主要因素n nPCR反应体系的各个组分反应体系的各个组分n nPCR循环的温度（预变性、变性、退
11、火、延循环的温度（预变性、变性、退火、延伸）伸）n nPCR循环的次数和平台效应循环的次数和平台效应n n操作环境操作环境平台效应及其原因平台效应及其原因遗传多态现象遗传多态现象(geneticpolymorphism)是指同一交配繁殖群体中存在两种或两种以上遗是指同一交配繁殖群体中存在两种或两种以上遗是指同一交配繁殖群体中存在两种或两种以上遗是指同一交配繁殖群体中存在两种或两种以上遗传变异的类型传变异的类型传变异的类型传变异的类型, ,其中频率最低的类型并不依靠重其中频率最低的类型并不依靠重其中频率最低的类型并不依靠重其中频率最低的类型并不依靠重复突变维持。复突变维持。复突变维持。复突变维持
12、。染色体多态现象染色体多态现象蛋白质多态现象蛋白质多态现象DNA多态现象多态现象DNA多态现象产生的原因多态现象产生的原因n单个核苷酸的点突变即核苷酸的替换单个核苷酸的点突变即核苷酸的替换n单一单一DNADNA序列的插入或缺失序列的插入或缺失n整串整串DNADNA序列的插入或缺失序列的插入或缺失n基因转换基因转换DNA多态现象的类型多态现象的类型wRFLP(restrictedfragmentlengthpolymorphism)wRAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA)w微卫星多态性微卫星多态性(microsatellitepolymorphism)wSSCP(
13、singlestrandconformationpolymorphism)wDSCP(doublestrandconformationpolymorphism)wDNA芯片芯片(DNAchips)wDNA指纹指纹随机扩增多态性随机扩增多态性DNA标记标记(RAPD)由由Williams等于等于1990年创立。其基本原理与年创立。其基本原理与PCR技术一致；技术一致；由人工随机合成的由人工随机合成的DNA分子为引物，以基因组分子为引物，以基因组DNA为模板，为模板，进行多态性进行多态性DNA片段的随机合成。对扩增产物进行电泳、染片段的随机合成。对扩增产物进行电泳、染色分析，就可直接在紫外光线下看
14、到新合成的色分析，就可直接在紫外光线下看到新合成的DNA分子片段分子片段形成的不同条带。形成的不同条带。遗传材料的基因组遗传材料的基因组DNA如果在特定引物结合区域发生如果在特定引物结合区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变片段插入、缺失或碱基突变，就有可能导致引物结合位，就有可能导致引物结合位点的分布发生相应的变化，导致点的分布发生相应的变化，导致PCR产物增加、缺少或发生分产物增加、缺少或发生分子量变化。子量变化。经经PCR产物增加或缺少，则产生产物增加或缺少，则产生RAPD标记。标记。不同品种鸡基因组的不同品种鸡基因组的RAPD分析图分析图关于关于ApoB基因基因n独立于独立于2号染色体
15、短臂末端，编码号染色体短臂末端，编码apoB蛋白质蛋白质n全长全长43kb(28个内含子，个内含子，29个外显子）个外显子）ApoB100ApoB48napoBapoB基因基因DNADNA多态性或遗传变异多态性或遗传变异 高胆固醇血症、动脉粥样硬化、心梗、冠心病、肥胖高胆固醇血症、动脉粥样硬化、心梗、冠心病、肥胖napoBapoB基因只要有微小变异（缺陷）都可以引起高胆基因只要有微小变异（缺陷）都可以引起高胆固醇和高甘油三酯血症固醇和高甘油三酯血症nApoBApoB基因基因33末端末端500500个核苷酸碱基对区域，有一个核苷酸碱基对区域，有一DNADNA片段构成可变动数目的半联重复（片段构成
16、可变动数目的半联重复（variable number variable number of tandem repeats. VNTRof tandem repeats. VNTR）已发现）已发现ApoBApoB基因基因33末端末端这种这种VNTRVNTR所致的多态性与心肌梗塞的发作有关联所致的多态性与心肌梗塞的发作有关联(用用口腔粘膜口腔粘膜基因组基因组DNA为模板）为模板）2*混合液混合液12.5l引物引物2lDNA模板模板4l蒸馏水蒸馏水6.5l总体积：总体积：25l94 5min（预变性）（预变性）941min（变性）（变性）604min退火退火+延伸（延伸（30个循环）个循环）605m
17、in（续延伸）（续延伸）4保存保存PCR加样表加样表PCR程序程序实验操作实验操作-1 ApoB检测检测认清试剂，实验分组认清试剂，实验分组（每（每2人一小组，人一小组，一人做乙肝病毒一人做乙肝病毒PCR）一人做一人做apoB，下页显示，下页显示)患者血清患者血清40 l+40 lDNA提取液提取液，混匀（，混匀（原先的原先的2大组共用一份大组共用一份）沸水浴沸水浴10min，10000rpm，5min（注意：离心机的使用注意：离心机的使用）取上清液取上清液2 l（或（或阳性血清阳性血清2 l）加入一加入一PCR反应管反应管（已含有（已含有PCR引物、模板等）引物、模板等）6000rpm10s，混匀，混匀 PCR仪上，仪上，93-3min 预变性预变性 (Hema PCR仪的使用与程序设计仪的使用与程序设计) 93-45s，55-35s，72-60s，重复，重复30个循环个循环 72保温保温 5min，-20保存备用保存备用实验操作实验操作-2 HBV检测检测
