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1、专题一基因工程的学习一、一、DNADNA重重组技技术的基本工具的基本工具（一）限制性核酸内切（一）限制性核酸内切（一）限制性核酸内切（一）限制性核酸内切酶酶“分子手分子手分子手分子手术术刀刀刀刀”1.1.1.1.分布：分布：分布：分布：2.2.2.2.特点：特点：特点：特点： 特异性，即能特异性，即能特异性，即能特异性，即能够识别够识别双双双双链链DNADNADNADNA分子的某种特定核苷分子的某种特定核苷分子的某种特定核苷分子的某种特定核苷酸序列，并且切割每一条酸序列，并且切割每一条酸序列，并且切割每一条酸序列，并且切割每一条链链中特定部位的两个核苷酸之中特定部位的两个核苷酸之中特定部位的两
2、个核苷酸之中特定部位的两个核苷酸之间间的磷酸二的磷酸二的磷酸二的磷酸二酯键酯键，使之断开。，使之断开。，使之断开。，使之断开。主要从原核生物中分离主要从原核生物中分离主要从原核生物中分离主要从原核生物中分离纯纯化出来化出来化出来化出来G A AG A A T T CT T CC T TC T T A A GA A GGGC T T A AC T T A AGGA A T T CA A T T CC C CC C C G G GG G GG G GG G G C C CC C CC C CC C CG G GG G GG G GG G GC C CC C C 中中中中轴线轴线 EcoEcoR R
3、（在（在（在（在G G G G与与与与A A A A之之之之间间切割）切割）切割）切割）SmaSma（在（在（在（在G G G G与与与与C C C C之之之之间间切割）切割）切割）切割）粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端平末端平末端平末端平末端切割切割切割切割DNADNADNADNA分子分子分子分子产产生的两种不同的末端（箭生的两种不同的末端（箭生的两种不同的末端（箭生的两种不同的末端（箭头头表示表示表示表示酶酶的切割位点）的切割位点）的切割位点）的切割位点） 3.3.结结果：果：果：果：在在在在识别识别序列中序列中序列中序列中轴线轴线两两两两侧侧切割，切割，切割，切割，产产生粘性末端；生粘性
4、末端；生粘性末端；生粘性末端；在在在在识别识别序列中序列中序列中序列中轴线处轴线处切割，切割，切割，切割，产产生平末端。生平末端。生平末端。生平末端。GC T T A AA A T T CGGC T T A AA A T T CG（二）（二）（二）（二）DNADNA连连接接接接酶酶“分子分子分子分子缝缝合合合合针针”GC T T A AA A T T CG（二）（二）（二）（二）DNADNA连连接接接接酶酶“分子分子分子分子缝缝合合合合针针”（二）（二）（二）（二）DNADNA连连接接接接酶酶“分子分子分子分子缝缝合合合合针针”2.2.2.2.连连接接接接酶酶的部位：的部位：的部位：的部位：磷
5、酸二磷酸二磷酸二磷酸二酯键酯键，不是，不是，不是，不是氢键氢键GC T T A AA A T T CG磷酸二磷酸二酯键磷酸二磷酸二酯键1.1.1.1.连连接接接接酶酶的作用：的作用：的作用：的作用：将互将互将互将互补补配配配配对对的两个黏性末端的两个黏性末端的两个黏性末端的两个黏性末端连连接起来，接起来，接起来，接起来，使之成使之成使之成使之成为为一个完整的一个完整的一个完整的一个完整的DNADNADNADNA分子分子分子分子3.3.3.3.连连接接接接酶酶的的的的类类型（按来源分型（按来源分型（按来源分型（按来源分类类）(1)E.coli DNA连接接酶：(来源于大来源于大肠杆菌杆菌)只能只
6、能连接双接双链DNA片段互片段互补的粘性末端的粘性末端(2)T4 DNA连接接酶：（来源于（来源于T4噬菌体）噬菌体）既可以既可以连接双接双链DNA片段片段互互补的的粘性末端，又可以粘性末端，又可以“缝合合”双双链DNA片段的平末端片段的平末端（三）基因（三）基因（三）基因（三）基因进进入受体入受体入受体入受体细细胞的胞的胞的胞的载载体体体体“分子运分子运分子运分子运输车输车”1.1.作用：作用：2.2.条件：条件： 能在宿主能在宿主细胞内复制并胞内复制并稳定地保存；定地保存； 具有多个限制具有多个限制酶切位点切位点, ,便于目的基因插入；便于目的基因插入； 具有具有标记基因，便于基因，便于筛
7、选； 必需是安全的，必需是安全的，对宿主宿主细胞无害。胞无害。将外源基因送入受体将外源基因送入受体细胞胞3.3.种种类： 质粒、粒、噬菌体的衍生物、噬菌体的衍生物、动植物病毒植物病毒质粒粒 细细菌菌菌菌拟拟核核核核DNADNA之外能自主之外能自主之外能自主之外能自主复制的小型双复制的小型双复制的小型双复制的小型双链环链环状状状状DNADNA分子；分子；分子；分子； DNADNA分子上具有多个限制分子上具有多个限制分子上具有多个限制分子上具有多个限制酶酶切割位点；切割位点；切割位点；切割位点； 能在宿主能在宿主能在宿主能在宿主细细胞中胞中胞中胞中进进行自我行自我行自我行自我复制；复制；复制；复制
8、； DNADNA分子上具有特殊的分子上具有特殊的分子上具有特殊的分子上具有特殊的标标记记基因；基因；基因；基因； 对对宿主宿主宿主宿主细细胞无影响。胞无影响。胞无影响。胞无影响。二、基因工程的基本操作程序二、基因工程的基本操作程序获取目的基因取目的基因构建表达构建表达载体体导入受体入受体细胞胞目的基因目的基因检测与与鉴定定第一步第一步第二步第二步第三步第三步第四步第四步（一）目的基因的（一）目的基因的（一）目的基因的（一）目的基因的获获取取取取1.1.1.1.从基因文从基因文从基因文从基因文库库中中中中获获取目的基因取目的基因取目的基因取目的基因（1 1 1 1）基因）基因）基因）基因组组文文
9、文文库库 将含有某种生物不同基因的将含有某种生物不同基因的许多片段，多片段，导入受体菌的入受体菌的群体中群体中储存，各个受体菌分存，各个受体菌分别含有含有这种生物的不同的基因，种生物的不同的基因，称称为基因文基因文库。受体菌包含了某种生物所有的基因，受体菌包含了某种生物所有的基因，该受体菌群受体菌群体称体称为这种生物的基因种生物的基因组文文库。（2 2 2 2）部分基因文）部分基因文）部分基因文）部分基因文库库受体菌包含了一种生物部分基因，受体菌包含了一种生物部分基因，该受体菌群体称受体菌群体称为这种生物的部分基因文种生物的部分基因文库，如，如cDNAcDNA文文库。（3 3 3 3）基因文）
10、基因文）基因文）基因文库库的构建的构建的构建的构建l基因基因基因基因组组文文文文库库的构建的构建的构建的构建提取某生物提取某生物全部全部DNA用适当用适当限制限制酶切割切割许多多DNA片段片段与与载体体连接接导入受体菌群入受体菌群该生物基生物基因因组文文库（每个受体菌含有一段不同的（每个受体菌含有一段不同的DNADNA片段）片段）lcDNAcDNA文文文文库库的构建的构建的构建的构建mRNAmRNA反反反反转录转录形成形成形成形成mRNA逆逆转录酶杂交双交双链核酸核酸酶H单链DNADNA聚合聚合酶双双链DNA与与载体体连接接导入受体菌群入受体菌群该生物生物cDNA文文库2.2.2.2.利用利用
11、利用利用PCRPCRPCRPCR技技技技术扩术扩增目的基因增目的基因增目的基因增目的基因(1) (1) (1) (1) 原理原理原理原理PCR是聚合是聚合酶链式反式反应（polymerasechainreaction）,它是利用它是利用DNA双双链复制的原理，将复制的原理，将基因的核苷酸序列不断的加以复制，使其数量呈基因的核苷酸序列不断的加以复制，使其数量呈指数方式增加。因指数方式增加。因为整个整个过程是在体外程是在体外进行，所行，所以又叫做体外以又叫做体外DNA扩增技增技术。2. 2. 2. 2. 过过程程程程高温高温变性性(DNA解旋解旋)（9095）低温退火低温退火(引物引物结合合)（5
12、560）中温延伸中温延伸(互互补链合成合成)（7075）p 双双链DNADNA是在高温条件下解是在高温条件下解链为单链DNADNA的，因此整个的，因此整个过程不需要解旋程不需要解旋酶。多次多次重复重复3.3.3.3.特点：指数形式特点：指数形式特点：指数形式特点：指数形式扩扩增增增增推推测推推测合合成成3.3.3.3.通通通通过过DNADNADNADNA合成合成合成合成仪仪直接合成目的基因直接合成目的基因直接合成目的基因直接合成目的基因DNA合成合成仪蛋白蛋白蛋白蛋白质质的氨的氨的氨的氨基酸基酸基酸基酸顺顺序序序序mRANmRAN核苷酸序列核苷酸序列核苷酸序列核苷酸序列基因基因基因基因DNAD
13、NA的的的的核苷酸序列核苷酸序列核苷酸序列核苷酸序列目的目的目的目的基因基因基因基因 当基因比当基因比当基因比当基因比较较小、蛋白小、蛋白小、蛋白小、蛋白质质的氨基酸序列可以的氨基酸序列可以的氨基酸序列可以的氨基酸序列可以测测得或核苷酸序列已知得或核苷酸序列已知得或核苷酸序列已知得或核苷酸序列已知时时，可采用此种方法。，可采用此种方法。，可采用此种方法。，可采用此种方法。（二）基因表达（二）基因表达（二）基因表达（二）基因表达载载体的构建体的构建体的构建体的构建用限制用限制酶切割切割质粒使之出粒使之出现一个切口，将目的一个切口，将目的基因插入切口基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口目的基
14、因的黏性末端与切口上的黏性末端互上的黏性末端互补配配对后，在后，在连接接酶的作用下的作用下连接形成重接形成重组DNA分子，即基因表达分子，即基因表达载体。体。质粒粒目的基因目的基因限制限制酶DNA连接接酶重重组DNA（二）基因表达（二）基因表达（二）基因表达（二）基因表达载载体的构建体的构建体的构建体的构建1.1.1.1.构建目的构建目的构建目的构建目的 使目的基因在受体使目的基因在受体细胞中胞中稳定存在，并且可定存在，并且可遗传给下下一代，同一代，同时，使目的基因能，使目的基因能够表达和表达和发挥作用。作用。2.2.2.2.构建零件及其作用构建零件及其作用构建零件及其作用构建零件及其作用（1
15、 1）目的基因）目的基因（2 2）启）启动子子 RNARNA聚合聚合酶识别和和结合的一段特殊合的一段特殊结构的构的DNADNA片段，位于基因的首端，片段，位于基因的首端，RNARNA聚合聚合酶与之与之结合才能合才能驱动基因基因转录出出mRNAmRNA，进而而获得需要的得需要的蛋白蛋白质。（二）基因表达（二）基因表达（二）基因表达（二）基因表达载载体的构建体的构建体的构建体的构建（3 3）终止子止子 一段特殊一段特殊结构构的的DNADNA片段，位于基因的尾端，片段，位于基因的尾端，作用是使作用是使转录在所需要的地在所需要的地方停止。方停止。（4 4）标记基因基因 鉴别受体受体细胞中胞中是否含有目
16、的基因，从而将含有是否含有目的基因，从而将含有目的基因的目的基因的细胞胞筛选出来。出来。（二）基因表达（二）基因表达（二）基因表达（二）基因表达载载体的构建体的构建体的构建体的构建2.2.2.2.构建零件及其作用构建零件及其作用构建零件及其作用构建零件及其作用(5)(5) 复制原点复制原点（三）将目的基因（三）将目的基因（三）将目的基因（三）将目的基因导导入受体入受体入受体入受体细细胞胞胞胞 将目的基因将目的基因导入受体入受体细胞并且在受体胞并且在受体细胞内胞内维持持稳定和表达的定和表达的过程称程称为转化。化。 基因工程中常用的受体基因工程中常用的受体细胞有大胞有大肠杆菌、枯草杆菌、杆菌、枯草
17、杆菌、土壤土壤农杆菌和杆菌和动植物植物细胞等。胞等。 导入受体入受体细胞的方法主要是借胞的方法主要是借鉴细菌或病毒侵染菌或病毒侵染细胞的途径，且因受体胞的途径，且因受体细胞的不同而不同。胞的不同而不同。（1 1）农杆菌杆菌转化法化法1.1.1.1.导导入植物入植物入植物入植物细细胞胞胞胞（2 2）其他方法）其他方法l 基因基因枪法法l 花粉管通道法花粉管通道法移移 植植显微微注射注射分分裂裂分分化化发育育2.2.2.2.导导入入入入动动物物物物细细胞胞胞胞 ( (显微注射技微注射技术) )含目的基因含目的基因的表达的表达载体体动物物的的受受精精卵卵含目的基因含目的基因的受精卵的受精卵早早期期胚
18、胚胎胎雌性雌性动物物输卵卵管或子管或子宫转基因基因动物物3.3.3.3.导导入微生物入微生物入微生物入微生物细细胞胞胞胞 繁殖快、多繁殖快、多繁殖快、多繁殖快、多为单细为单细胞、胞、胞、胞、遗传遗传物物物物质质相相相相对较对较少、操作少、操作少、操作少、操作简单简单、价格低廉。、价格低廉。、价格低廉。、价格低廉。(2)(2)(2)(2)常用受体常用受体常用受体常用受体细细胞胞胞胞 大大大大肠肠杆菌（杆菌（杆菌（杆菌（E.coliE.coliE.coliE.coli）(1)(1)(1)(1)过过程程程程l制制备感受感受态细胞：用胞：用Ca2+（CaCl2）处理理细菌，使菌，使细菌易于接受外源菌易
19、于接受外源DNA分子。分子。l重重组DNA分子与感受分子与感受态细胞混合孵育，完成胞混合孵育，完成转化。化。(Ca(Ca2+2+ 处理法理法) )（四）目的基因的（四）目的基因的（四）目的基因的（四）目的基因的检测检测与与与与鉴鉴定定定定目的基因是否真正插入受体目的基因是否真正插入受体细胞的胞的DNA中，是否能中，是否能够在受体在受体细胞中胞中稳定定遗传和正确表达，只有通和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。定才能得知。常用的常用的检测手段主要从分子水平和个体水平手段主要从分子水平和个体水平进行。行。适当限制适当限制酶切割切割用同位素用同位素标记的的目的基因片段目的基因片段杂交交1.1.1.
20、1.分子水平分子水平分子水平分子水平（1 1）检测转检测转基因生物的染色体基因生物的染色体基因生物的染色体基因生物的染色体DNADNA上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因 提取受体生提取受体生物全部物全部DNA许多多DNA片片段段显出出杂交交带（表明目的基因已插入）（表明目的基因已插入）（分子（分子杂交技交技术）(2)(2)检测检测目的基因是否目的基因是否目的基因是否目的基因是否转录转录出了出了出了出了mRNAmRNA提取受体生提取受体生物的物的mRNA用同位素用同位素标记的的目的基因片段目的基因片段杂交交显出出杂交交带（表明目的基因已（表明目的基因
21、已转录出了出了mRNA）检测DNA利用的是利用的是DNA与与DNA杂交，交，检测mRNA利用的是利用的是DNA与与mRNA杂交。交。1.1.1.1.分子水平分子水平分子水平分子水平 （分子（分子杂交技交技术）（3 3）检测检测目的基因是否翻目的基因是否翻目的基因是否翻目的基因是否翻译译出蛋白出蛋白出蛋白出蛋白质质 （抗原（抗原抗体抗体杂交技交技术）提取受体生提取受体生物的蛋白物的蛋白质与相与相应抗体抗体杂交交显出出杂交交带（表明目的基因已形成蛋白（表明目的基因已形成蛋白质产品）品）1.1.1.1.分子水平分子水平分子水平分子水平 （分子（分子杂交技交技术）2.2.2.2.个体水平个体水平个体水
22、平个体水平例：用棉例：用棉铃饲喂棉喂棉铃虫，如虫吃后不出虫，如虫吃后不出现中毒症状，中毒症状，说明未明未摄入目的基因或入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，毒死亡，则说明明摄入了抗虫基因并得到表达。入了抗虫基因并得到表达。1.用基因工程技用基因工程技术可使大可使大肠杆菌合成人的蛋白杆菌合成人的蛋白质。下列叙述。下列叙述不正确的是不正确的是（）A.常用相同的限制性内切常用相同的限制性内切酶处理目的基因和理目的基因和质粒粒B.导入大入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达杆菌的目的基因不一定能成功表达C.DNA连接接酶和和RNA聚合聚合酶是构建重是构建重组质粒必
23、需的工具粒必需的工具酶D.可用含抗生素的培养基可用含抗生素的培养基检测大大肠杆菌中是否杆菌中是否导入了重入了重组质粒粒C2.下列关于基因工程中限制性内切下列关于基因工程中限制性内切酶的描述，的描述，错误的是（的是（）A.一种限制性内切一种限制性内切酶只能只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列一种特定的脱氧核苷酸序列B.限制性内切限制性内切酶的活性受温度的影响的活性受温度的影响C.限制性内切限制性内切酶能能识别和切割和切割RNAD.限制性内切限制性内切酶可从原核生物中提取可从原核生物中提取C含重含重组质粒粒土壤土壤农杆菌杆菌抗虫基因抗虫基因含含kan质粒粒重重组质粒粒A构建构建土壤土壤农杆菌杆菌导入入
24、B培养培养选择侵侵染染转基因基因抗虫植株抗虫植株离体棉花离体棉花叶片叶片组织愈愈伤组织C诱导选择再生植株再生植株分化分化D检测3.3.在培育在培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（kankanr r）常作常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡胞才能在卡那霉素培养基上生那霉素培养基上生长。下。下图为获得抗虫棉的技得抗虫棉的技术流程。流程。 请据据图回答：回答：（1 1）A A过程需要的程需要的酶有有_。（2 2）B B过程及其程及其结果体果体现了了质粒作粒作为运运载体必体必须具具备的两个条件是的两个条件是 _。（
25、3 3）C C过程的培养基除含有必要程的培养基除含有必要营养物养物质、琼脂和激素外，脂和激素外，还必必须加加 入入_。（4 4）如果利用）如果利用DNADNA分子分子杂交原理交原理对再生植株再生植株进行行检测，D D过程程应该用用 _ _ _ _ _作作为探探针。限制性内切限制性内切酶和和DNA连接接酶具有具有标记基因；能在宿主基因；能在宿主细胞内复制并胞内复制并稳定保存定保存卡那霉素卡那霉素放射性同位素（或放射性同位素（或荧光分子）光分子）标记后的抗虫基因后的抗虫基因（5）科学家）科学家发现转基因植株的卡那霉素抗性基因的基因植株的卡那霉素抗性基因的传递符合孟德符合孟德尔遗传规律。律。将将转基
26、因植株与基因植株与_杂交，其后代中抗卡那交，其后代中抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型的数量比霉素型与卡那霉素敏感型的数量比为1：1。若若该转基因植株自交，基因植株自交，则其后代中抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型其后代中抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型的数量比的数量比为_。若将若将该转基因植株的花基因植株的花药在卡那霉素培养基上作离体培养，在卡那霉素培养基上作离体培养，则获得得的再生植株群体中抗卡那霉素型植株占的再生植株群体中抗卡那霉素型植株占_%。含重含重组质粒粒土壤土壤农杆菌杆菌抗虫基因抗虫基因含含knar质粒粒重重组质粒粒A构建构建土壤土壤农杆菌杆菌导入入B培养培养选择侵侵染染转基因基因抗虫植株抗虫植
27、株离体棉花离体棉花叶片叶片组织愈愈伤组织C诱导选择再生植株再生植株分化分化D检测非非转基因植株基因植株3：1100三、基因工程的三、基因工程的应用用（一）植物基因工程（一）植物基因工程（一）植物基因工程（一）植物基因工程uu抗虫抗虫抗虫抗虫转转基因植物基因植物基因植物基因植物uu抗病抗病抗病抗病转转基因植物基因植物基因植物基因植物uu抗逆抗逆抗逆抗逆转转基因植物基因植物基因植物基因植物uu改良植物品改良植物品改良植物品改良植物品质质如如 转基因抗虫棉（水稻）基因抗虫棉（水稻） ( (减减轻农药对环境的境的污染染) )抗病毒（抗病毒（细菌、真菌）菌、真菌）转基因植物，基因植物， 如如 抗病毒抗病
28、毒转基因小麦、基因小麦、 抗病毒抗病毒转基因烟草等基因烟草等如如 转鱼抗抗冻蛋白基因番茄、蛋白基因番茄、 转基因抗除草基因抗除草剂玉米玉米如如 富含富含赖氨酸的氨酸的转基因玉米、基因玉米、 转基因延熟番茄基因延熟番茄（二）（二）（二）（二）动动物基因工程物基因工程物基因工程物基因工程三、基因工程的三、基因工程的应用用uu提高提高提高提高动动物生物生物生物生长长速度速度速度速度uu改善畜改善畜改善畜改善畜产产品的品品的品品的品品的品质质uu生生生生产药产药物物物物uu做器官移植供体做器官移植供体做器官移植供体做器官移植供体如如 转生生长激素基因激素基因鲤鱼如如 低乳糖低乳糖转基因牛（基因牛（转肠
29、乳糖乳糖酶基因）基因）如如 乳腺生物反乳腺生物反应器器利用基因工程改造供体器官，抑制或去利用基因工程改造供体器官，抑制或去除供体器官抗原决定基因的表达，除供体器官抗原决定基因的表达，获得得没有免疫排斥反没有免疫排斥反应的的转基因克隆猪器官基因克隆猪器官（三）基因工程（三）基因工程（三）基因工程（三）基因工程药药物物物物三、基因工程的三、基因工程的应用用利用基因工程技利用基因工程技术，通，通过微生物生微生物生产蛋白蛋白质类药品。品。uu生生生生长长激素激素激素激素uu干干干干扰扰素素素素uu胰胰胰胰岛岛素素素素（四）基因治（四）基因治（四）基因治（四）基因治疗疗三、基因工程的三、基因工程的应用用
30、 基因治基因治疗就是将正常基因就是将正常基因导入病人体内，使入病人体内，使该基因的表达基因的表达产物物发挥功能，从而达到治功能，从而达到治疗疾病的目疾病的目的。基因治的。基因治疗是治是治疗遗传病最有效的手段。病最有效的手段。uu体外基因治体外基因治体外基因治体外基因治疗疗 从病人体内从病人体内获得某种得某种细胞，胞，进行培养，在体外完行培养，在体外完成基因成基因转移，移，筛选成功成功转移的移的细胞胞扩增培养，再重新增培养，再重新输入患者体内的治入患者体内的治疗方法。方法。（四）基因治（四）基因治（四）基因治（四）基因治疗疗uu体内基因治体内基因治体内基因治体内基因治疗疗直接向人体直接向人体组织
31、细胞中胞中转移基因的治病方法。移基因的治病方法。SCID的基因工程治的基因工程治疗四、蛋白四、蛋白质工程工程 以蛋白以蛋白质分子的分子的结构构规律及其与生物功能的关系作律及其与生物功能的关系作为基基础，通，通过基因修基因修饰或基因合成，或基因合成，对现有蛋白有蛋白质进行行改造，或制造一种新的蛋白改造，或制造一种新的蛋白质，以，以满足人足人类对生生产和生和生活的需求。活的需求。四、蛋白四、蛋白质工程工程（一）原理（一）原理（二）（二）过程程基因基因DNA生物功能生物功能预期功能期功能mRNA转录氨基酸序列氨基酸序列多多肽链翻翻译蛋白蛋白质三三维结构构折叠折叠DNA合成合成分子分子设计中心法中心法则的逆推的逆推
