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1、第六章第六章 蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化和表征和表征 一、一、 蛋白质的性质蛋白质的性质 1. 1. 蛋白质的酸碱性蛋白质的酸碱性 蛋白质也是两性电解质，溶液的蛋白质也是两性电解质，溶液的pHpH可以改变蛋可以改变蛋白质的带电情况。白质的带电情况。 蛋白质的等电点（等离子点）受组成蛋白质的蛋白质的等电点（等离子点）受组成蛋白质的酸性氨基酸和碱性氨基酸数目的影响。酸性氨基酸和碱性氨基酸数目的影响。 2. 2. 蛋白质的大分子特性蛋白质的大分子特性 a a a a 渗透与渗透压渗透与渗透压渗透与渗透压渗透与渗透压 溶剂溶剂分子由稀溶液向浓溶液单方面的净移动称分子由稀溶液向浓溶液单方面的净移动
2、称为称为渗透。为称为渗透。 渗透压是溶液分子在平衡浓度时的净水压，是渗透压是溶液分子在平衡浓度时的净水压，是蛋白质的依数性之一。蛋白质的依数性之一。 b b b b 蛋白质分子的扩散现象蛋白质分子的扩散现象蛋白质分子的扩散现象蛋白质分子的扩散现象 由于浓度差导致的由于浓度差导致的溶质溶质分子的净迁移，称为扩散。分子的净迁移，称为扩散。 扩散系数的大小与蛋白质形状、大小及溶剂的粘度有扩散系数的大小与蛋白质形状、大小及溶剂的粘度有关。关。 c c 蛋白质分子的沉降特性蛋白质分子的沉降特性蛋白质分子的沉降特性蛋白质分子的沉降特性 蛋白质分子在溶液中受到强大的离心力作用时发生移蛋白质分子在溶液中受到强
3、大的离心力作用时发生移动的现象称为沉降。动的现象称为沉降。 沉降的速度与蛋白质分子的大小、形状、密度及溶剂沉降的速度与蛋白质分子的大小、形状、密度及溶剂的密度和粘度、温度等有关。的密度和粘度、温度等有关。 沉降系数用沉降系数用S S做单位。做单位。 d d 蛋白质的胶体性质及沉淀蛋白质的胶体性质及沉淀蛋白质的胶体性质及沉淀蛋白质的胶体性质及沉淀 分散相质点的半径介于分散相质点的半径介于1- 100nm1- 100nm时形成的均匀分时形成的均匀分散的溶液，称为胶体溶液。散的溶液，称为胶体溶液。 蛋白质溶液作为胶体溶液，稳定的原因是蛋白质蛋白质溶液作为胶体溶液，稳定的原因是蛋白质分子表面的水化层和
4、双电层。分子表面的水化层和双电层。 沉淀蛋白质的方法：沉淀蛋白质的方法： 大量的中性盐、大量的中性盐、 极性有机溶剂、极性有机溶剂、 重金属盐、重金属盐、 生物碱试剂、生物碱试剂、 加热加热 二、二、 蛋白质的分离纯化方法蛋白质的分离纯化方法 （一）根据分子大小不同的纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法 1. 1. 透析和超滤透析和超滤 2. 2. 密度梯度离心：蔗糖梯度、聚蔗糖梯度密度梯度离心：蔗糖梯度、聚蔗糖梯度 3. 3. 凝胶过滤层析凝胶过滤层析( ( 分子排阻层析分子排阻层析) ) 分离蛋白质常用的凝胶的商品名：分离蛋白质常用的凝胶的商品名： Sephadex Sephadex
5、某一蛋白质样品在凝胶柱上的分配系数某一蛋白质样品在凝胶柱上的分配系数 Kav = Kav = Ve: Ve: 该蛋白质的洗脱体积该蛋白质的洗脱体积 Vo: Vo: 凝胶柱的空隙体积凝胶柱的空隙体积( (外水体积外水体积) ) Vt : Vt : 凝胶柱的总体积凝胶柱的总体积VeVoVtVo凝 胶 过 滤 层 析 原 理 示 意 图 （二）（二） 利用溶解度差别纯化蛋白质利用溶解度差别纯化蛋白质 蛋白质的溶解度受到溶液的蛋白质的溶解度受到溶液的pHpH、离子强度、离子强度、 介电常数和温度等因素的影响，所以改变以上条介电常数和温度等因素的影响，所以改变以上条 件，可以选择性地控制蛋白质混合物中某
6、一成分件，可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分 的溶解度，达到分离纯化蛋白质的目的。的溶解度，达到分离纯化蛋白质的目的。 1. 1. 通过改变溶液通过改变溶液pHpH值的等电点沉淀法值的等电点沉淀法 2. 2. 通过改变溶液离子强度的盐析、盐溶通过改变溶液离子强度的盐析、盐溶 3. 3. 有机溶剂的分级沉淀有机溶剂的分级沉淀 4. 4. 通过改变温度的沉淀法通过改变温度的沉淀法 （三）（三） 根据电荷不同纯化蛋白质根据电荷不同纯化蛋白质 1. 1. 电泳电泳 纸电泳或薄膜电泳纸电泳或薄膜电泳 粉末电泳粉末电泳 细丝电泳细丝电泳 凝胶电泳凝胶电泳平板电泳柱状电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳
7、 （1 1） 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(PAGE)浓缩胶样品 分离胶 在PAGE中，除了一般的电荷效应外，还有凝胶对样品的分子筛效应和浓缩效应， 三种效应共同起作用， 使样品的分离效果大大提高。 （2 2） 等电聚焦电泳等电聚焦电泳(IEF-PAGE)(IEF-PAGE)Ph=3pH=10连续pH梯度的凝胶和样品电泳 两性电解质载体 ampholite （3 3） SDS SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(SDS-PAGE) 在SDS和少量的巯基乙醇存在时，蛋白质分子解聚并处于完全展开的状态，SDS以其烃基链与蛋白质分子的侧链结合成复合物，
8、每两个氨基酸残基相当于结合一个SDS分子，使得蛋白质分子在电场中的迁移率完全取决于相对分子量而同本身所带的电荷及形状无关。 2. 2. 离子交换层析离子交换层析 纤维素离子交换层析纤维素离子交换层析 交链葡聚糖离子交换层析交链葡聚糖离子交换层析 （三）（三）根据对配基根据对配基的生物学特性的分的生物学特性的分离：离： 亲和层析亲和层析 亲和层析是利用亲和层析是利用生物亲和力，即蛋白生物亲和力，即蛋白质分子和其配基之间质分子和其配基之间特有的特有的识别能力识别能力而建而建立的一种纯化方法。立的一种纯化方法。 三、三、三、三、 蛋白质分子量的测定方法蛋白质分子量的测定方法蛋白质分子量的测定方法蛋白
9、质分子量的测定方法 1 . 1 . 根据化学组成测最低相对分子量根据化学组成测最低相对分子量 2 . 2 . 由渗透压测相对分子量由渗透压测相对分子量 3 . 3 . 沉降分析法测相对分子量沉降分析法测相对分子量 沉降速度法：沉降速度法： 蛋白质分子在离心力作用下沿旋转中心向外周方向蛋白质分子在离心力作用下沿旋转中心向外周方向移动，产生沉降界面，通过测定界面的移动速度求出移动，产生沉降界面，通过测定界面的移动速度求出蛋白质的分子量。蛋白质的分子量。 沉降平衡法：沉降平衡法： 蛋白质在高速离心力作用下逐渐沉降，直至其浮力蛋白质在高速离心力作用下逐渐沉降，直至其浮力与离心力相等时为止。与离心力相等时为止。 4. 4. 凝胶过滤法测相对分子量凝胶过滤法测相对分子量 在一定的分子量范围内，蛋白质分子量M的对数和洗脱体积成线性关系： logM=K1-K2Ve 5. SDS-PAGE5. SDS-PAGE测相对分子量测相对分子量lgM=K1K2R
